CC BY
22
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ТИПИРОВАНИИ ПАТОГЕНОВ
МОЛЕКУЛЯРНО-
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ТИПИРОВАНИИ ПАТОГЕНОВ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, ОБЛАДАЮЩИХ РАЗЛИЧНОЙ ПАТОГЕННОСТЬЮ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА
С.И. Беликов, Г.Н. Леонова*, И.Г. Кондратов, Е.В. Павленко*, У.В. Потапова Учреждение РАН «Лимнологический институт СО РАН», Иркутск *Учреждение Академии медицинских наук
«Институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН», Владивосток
Клещевой энцефалит (КЭ) - острая нейровирус-ная инфекция, возникающая чаще всего после присасывания иксодового клеща (укуса), зараженного вирусом КЭ. В клиническом течении инфекции различают лихорадочную, менингеальную и очаговые формы заболевания. Известно, что тяжесть течения КЭ уменьшается с востока на запад Евразийского континента. Некоторые авторы (Злобин и др., 2003, 2007) связывают это с особенностями субтипов вируса, преимущественно циркулирующих в природных очагах регионов. На территории России и в сопредельных странах известны три субтипа вируса - дальневосточный, сибирский и европейский, названные в соответствии с ареалами их обитания. В то же время было показано, что штаммы вируса КЭ даже дальневосточного субтипа зачастую могут не приводить к появлению выраженных симптомов заболевания, вызывая у людей после укуса зараженными клещами инаппарантные формы инфекции (Леонова и др., 2007, 2009).
Целью настоящего исследования явилось выявление мутаций в геноме штаммов вируса КЭ, выделенных от людей с различной тяжестью заболевания, которые можно связать с их патогенностью.
Штаммы вируса КЭ, вызвавшие тяжелые очаговые формы заболевания и приведшие к летальному ис-
ходу, были выделены путем внутримозговой инокуляции 2-хсуточным беспородным белым мышам 10 %-ной суспензии мозга умерших больных КЭ. Далее такие штаммы мы будем для краткости называть «патогенными». Штаммы вируса КЭ, приведшие к бессимптомным формам заболевания, были изолированы из крови людей на второй - третий день после укуса клеща в лесной зоне юга Дальнего Востока. Далее такие штаммы мы будем называть «инаппарантными». При изучении их патогенных свойств на белых мышах установлено, что все штаммы обладали выраженной ней-ровирулентностью при внутримозговом и подкожном способах заражения, индекс инвазивности составил от 0,6 до 2,2, что указывало на высокую степень нейроинвазивности. В работу по определению геномных последовательностей были взяты штаммы 2 - 9-го пассажей.
Определение нуклеотидных последовательностей полных геномов штаммов вируса КЭ проводили путем получения ДНК-копии вирусной РНК с последующей амплификацией перекрывающихся фрагментов генома с использованием набора 43 праймеров для повышения точности секвенирования. Суммарную РНК из головного мозга больных мышей-сосунков выделяли с помощью набора Рибо-Золь - А («АмплиСенс», Рос-
НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК
сия) согласно протоколу фирмы. Препараты суммарной РНК хранили после выделения в виде суспензии в 50 %-ном изопропаноле при -20°С.
Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью набора Реверта-LlOO («АмплиСенс», Россия) согласно протоколу фирмы. Амплификацию перекрывающихся фрагментов вирусного генома длиной около 1000 нуклеотидов осуществляли в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 65 мМтрис-HCl (pH 8,8), 20 мМ (NH4)2SO4, 0,01 % твин-20, 10 пмол каждого праймера, 0,5 ед. Taq-полимеразы, 0,2 мМ каждого dNTP и 0,12 мкл препарата кДНК. Амплификацию проводили на приборе DYAD DNA Engine («MG Research») следующим образом: денатурация - 96°С - 1 мин, затем 30 циклов в режиме 96°С - 5 сек, 60°С - 5 сек, 72°С - 1 мин. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 0,8 %-ном геле агарозы в трисацетатном буфере (20 мМ трисацетат, pH 8,5) с добавлением бромистого этидия. Ампликоны из геля выделяли методом замораживания с последующим центрифугированием через микроцентрифужный фильтр. ДНК осаждали добавлением к элю-ату равного объема изопропанола. Определение нук-леотидных последовательностей проводили посредством проведения терминирующих реакции с набором GenomeLabDTCS-QuickStartKit («BeckmanCoulter») согласно протоколу фирмы. Анализ продуктов терминирующих реакций осуществляли на секвенаторе CEQ-8800 («BeckmanCoulter»).
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с использованием программ MAFFT, BioEdit, MEGA, UCSFChimera и др.
Были определены нуклеотидные последовательности 34 штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа, сформировавших две группы «патогенных» и «инап-парантных» штаммов. Было показано, что длины геномов варьируют от 10 402 до 11 102 нуклеотидов благодаря наличию обширных делеций в 3' - нетранслируемом участке геномов. При сравнении изучаемых штаммов с геномами штаммов европейского и сибирского субтипов было показано, что все проанализированные штаммы принадлежали дальневосточному субтипу вируса и имели сходство от 91 до 99 %.
При филогенетическом анализе штаммы дальневосточного субтипа однозначно разделились на два кластера, которые в основном соответствовали делению штаммов на группы по патогенности. В кластер «патогенных» штаммов вошли также опубликованные ранее последовательности штаммов Sofjin, Senzhang и Glubinnoe, выделенных от умерших людей, больных КЭ. В кластер «инап-парантных» штаммов попал штамм Oshima, выделенный из крови собаки на острове Хоккайдо, Япония.
Проанализированные нами штаммы различались по мутациям, расположенным в 2245 позициях гено-
мов, т.е. 21,6 % позиций в геноме содержат хотя бы одну замену нуклеотида в одном из 34 штаммов. Подавляющее большинство мутаций расположено в третьих позициях кодонов и не приводит к заменам аминокислот в полипротеине. При сравнении полипротеинов, длина которых 3414 а.о. у «патогенных» и 3413 а.о. у «инаппарантных» штаммов, найдено лишь 204 сайта (6 %), содержащих замены аминокислот. Большинство замен аминокислот являются единичными или встречающимися у небольшого количества штаммов и, вероятно, являются случайными. Но найдено 17 позиций замен аминокислот, которые характерны для каждого кластера штаммов и отличаются у групп, обладающих различной патогенностью. В настоящее время нельзя предположить apriory без изучения роли каждой отдельной аминокислоты, какие аминокислоты отражают лишь эволюцию вирусной популяции, а какие влияют на патогенность. Однако ясно, что найденные единичные замены аминокислот в структурных белках prM и E, расположенные в трансмембранных участках, не влияют на патогенность. Наиболее вероятно, что ключевыми заменами, определяющими патогенность, являются замена и делеция одной аминокислоты в кап-сидном белке, приводящие к изменению скорости отщепления сигнальной последовательности и две замены в неструктурном белке NS3, комплекс которого с NS2B играет роль вирусной протеазы. Сочетание замен в сигнальной последовательности капсидного белка и в вирусной протеазе может нарушать процесс созревания вирусных частиц (budding) на мембранах эндоплазма-тического ретикулума. Такое нарушение может приводить к образованию дефектных вирусных частиц, не содержащих вирусную РНК и поэтому не инфекционных.
Для выяснения возможности изменения конфор-мации комплекса белков NS2B/NS3 нами построена трехмерная модель комплекса и методами молекулярной динамики выявлены ключевые участки, изменение конформации которых приводит к затруднению связывания комплекса протеазы с субстратом и в результате к уменьшению патогенности. Полученные результаты указывают на перспективность исследований по моделированию insilico лекарственных препаратов, направленных на ингибирование комплекса NS2B/NS3 протеазы.
Разработан простой метод детекции мутаций, коррелирующих с патогенностью, который может быть востребован для прогноза тяжести заболевания в каждом конкретном случае.
Работа выполнена при поддержке грантов Междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН № 63 и МНТЦ #4006, а также госконтракта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» П389.
