CC BY
7ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Научная статья
https://doi.org/10.36233/0372-9311-215
Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Vibrio cholerae nonO1/nonO139, выделенных от больных отитами на территории Российской Федерации
Монахова Е.В.И, Водопьянов А.С., Кругликов В.Д., Селянская Н.А., Писанов Р.В., Носков А.К.
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону, Россия
Аннотация
Введение. В 2017-2020 гг. в России впервые за много лет от больных отитами были выделены штаммы Vibrio cholerae nonO1/nonO139 (НАГ-вибрионов).
Цель работы — биоинформационный анализ полных геномов (WGSs) и отдельных генов штаммов НАГ-ви-брионов — возбудителей отитов, выделенных в России.
Материалы и методы. Анализ WGSs 8 клинических изолятов НАГ-вибрионов, полученных на платформе «MiSeq Illumina», проводили с использованием программ «BioEdit», «BLASTN», «BLASTP», «Vector NTI»; антибиотикоустойчивость определяли согласно МУК 4.2.2495-09.
Результаты. Штаммы различались по содержанию SNP, наборам детерминант факторов патогенности/ персистенции и их аллелям. Все были лишены профагов CTX, preCTX, RS1, острова патогенности VPI, гена термостабильного токсина, мобильных элементов, связанных с антибиотикорезистентностью, острова пандемичности VSP-I; 2 штамма содержали остров VSP-II. В разных сочетаниях выявлены гены ряда протеаз, cholix-токсина, кластер системы секреции 3-го типа (T3SS), дополнительные кластеры T6SS. Продукты изменённых генов сохраняли либо утрачивали характерные активные домены. В цитотоксине MARTX 6 штаммов отсутствовал ключевой домен ACD, у 4 выявлен новый домен rtxA-like. Кластеры генов биоплёнкообразования варьировали по стуктуре. Присутствие генов антибиотикорезистентности не всегда коррелировало с антибиотикограммами. Все штаммы были чувствительны к большинству антибиотиков, но некоторые проявляли резистентность к 1-4 препаратам.
Выводы. Все изученные штаммы — возбудители отитов, несмотря на выявленные различия, обладают достаточными наборами детерминант, ответственных за реализацию патогенетического и персистентного потенциала. В связи с несовпадением генотипических и фенотипических показателей антибиотикорезистентности при выборе препаратов для этиотропной терапии НАГ-инфекций следует полагаться в основном на фенотип. Выявление на территории России больных отитами, вызванными НАГ-вибрионами, указывает на целесообразность включения тестов на их присутствие в схему бактериологического анализа при внекишечных инфекциях и в случаях их выделения — оперативного определения чувствительности к антибиотикам.
Ключевые слова: Vibrio cholerae nonO1/nonO139, внекишечные формы НАГ-инфекций, полногеномные сиквенсы, биоинформационный анализ, факторы патогенности/персистенции
Этическое утверждение. Все штаммы получены из Музея живых культур (коллекция Референс-центра Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора).
Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Для цитирования: Монахова Е.В., Водопьянов А.С., Кругликов В.Д., Селянская Н.А., Писанов Р.В., Носков А.К. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Vibrio cholerae nonO1/nonO139, выделенных от больных отитами на территории Российской Федерации. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022;99(4):465-477.
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-215
Щ Check for updates
© Коллектив авторов, 2022
ORIGINAL RESEARCHES
Original article
https://doi.org/10.36233/0372-9311-215
Molecular genetic characteristics of Vibrio cholerae nonO1/nonO139 strains isolated on the territory of Russian Federation from patients with otitis
Elena V. Monakhova81, Alexey S. Vodop'yanov, Vladimir D. Kruglikov, Nadezhda A. Selyanskaya, Ruslan V. Pisanov, Alexey K. Noskov
Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute, Rostov-on-Don, Russia
Abstract
Introduction. In 2017-2020 for the first time in many years strains of Vibrio cholerae nonO1/nonO139 (NAGs) were isolated in Russia from patients with otitis.
Aim — bioinformatic analysis of whole genome sequences (WGSs) and sequences of individual genes of NAG strains - causative agents of otitis isolated in Russia.
Materials and methods. Analysis of WGSs of eight NAG clinical isolates obtained on the MiSeq Illumina platform was carried out using BioEdit, BLASTN, BLASTP, Vector NTI programs; antibiotic resistance was determined according to MUK 4.2.2495-09.
Results. The strains differed in SNP content, sets of determinants of pathogenicity/persistence factors and their alleles. All lacked CTX, preCTX, RS1 prophages, VPI pathogenicity island, thermostable toxin gene, mobile elements associated with antibiotic resistance, pandemicity island VSP-I; two strains contained VSP-II island. Genes of a number of proteases, cholix toxin, type 3 secretion system (T3SS) cluster and additional T6SS clusters formed different combinations. Products of the altered genes retained or lost their characteristic active domains. In the cytotoxin MARTX of 6 strains, the key ACD domain was absent; in 4 strains a new rtxA-like domain was revealed. Biofilm gene clusters varied in their structure. The presence of genes for antibiotic resistance did not always correlate with antibioticograms. All strains were susceptible to most antibiotics, but some showed resistance to 1-4 drugs.
Conclusion. All the studied strains — causative agents of otitis, in spite of revealed differences, have sufficient sets of determinants responsible for realization of pathogenic and persistent potential. Due to discrepancy between the genotypic and phenotypic characteristics of antibiotic resistance, one should rely mainly on the pheno-type when choosing drugs for the etiotropic therapy of NAG infections. Emergence of patients with otitis caused by NAG-vibrios in Russia indicates the advisability of the inclusion of tests for their identification in the scheme of bacteriological analysis for extraintestinal infections and, in cases of their isolation, for prompt determination of sensitivity to antibiotics.
Keywords: Vibrio cholerae nonO1/nonO139, extraintestinal forms of NAG infections, whole genome sequences, bioinformatics analysis, pathogenicity/persistence factors
Ethics approval. All strains were obtained from the Museum of Living Cultures (anonymized collection of the Reference
Center of the Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute).
Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.
Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
For citation: Monakhova E.V., Vodop'yanov A.S., Kruglikov V.D., Selyanskaya N.A., Pisanov R.V., Noskov A.K. Molecular genetic characteristics of Vibrio cholerae nonO1/nonO139 strains isolated on the territory of Russian Federation from patients with otitis. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology = Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2022;99(4):465-477. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-215
Введение
Холерные вибрионы nonО1/nonО139 серо-групп (НАГ-вибрионы), естественные обитатели поверхностных водоемов, способны вызывать острые кишечные инфекции различной степени тяжести в виде спорадических случаев либо локальных вспышек [1]. Гораздо реже они являются этиологическими агентами внекишечных форм, выявляемых, как правило, у ослабленных пациентов, страдающих сопутствующими хроническими заболеваниями. Тем не менее в литературе имеется достаточно мно-
го сообщений о выделении НАГ-вибрионов из клинического материала при первичной бактериемии, поражениях кожи и мягких тканей, мочеполовой системы, желчевыводящих путей, пневмонии [2, 3]. Не последнее место в этом списке занимают отиты (острые либо хронические), проявляющиеся в виде воспаления среднего уха или наружного слухового прохода [3]. Случаи отитов, вызванных НАГ-ви-брионами, регистрировались в нынешнем столетии в Германии, Австрии и Венгрии [2, 3]. В 2019 г. в Германии наблюдали случай хронического отита у
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 1. Клинические штаммы V. cholerae nonO1/nonO139, использованные в работе Table 1. V. cholerae nonO1/nonO139 clinical strains used in this study
№ No. Штамм Strain Место выделения Location of isolation Год Year Диагноз Diagnosis Источник выделения Source of isolation
1 20377 Челябинск Chelyabinsk 2017 Хронический отит Chronic otitis Мазок из уха Ear swab
2 20284 Челябинск (завоз из Туниса) Chelyabinsk (importation from Tunisia) 2017 Острый отит Acute otitis - " -
3 41 Москва Moscow 2018 Отит Otitis - " -
4 173 Москва Moscow 2019 Отит Otitis - " -
5 1175 Москва Moscow 2019 Отит Otitis - " -
6 14980 Москва (завоз из Дагестана) Moscow (importation from Dagestan) 2019 Отит Otitis - " -
7 735 Челябинск Chelyabinsk 2020 Гнойный отит Purulent otitis Выделения из уха Ear discharge
8 118 Челябинск Chelyabinsk 2020 Не указан Not indicated Кровь Blood
ребёнка, заразившегося при купании в Балтийском море. В Израиле зарегистрировано развитие хронического отита у воднолыжника, заразившегося в 2011 г. в Австралии в результате перфорации барабанной перепонки при аварии и попадании речной воды в среднее ухо; этиологическим агентом оказался штамм 0100 серогруппы [4]. Во Франции в 2017 г. НАГ-вибрион был выделен из отделяемого уха ребёнка, больного хроническим рецидивирующим мокнущим отитом; незадолго до обострения он купался в реке на территории страны [5]. В том же году в Испании НАГ-вибрион был выделен от больного c диагнозом «острый наружный отит»; заболевание проявилось после купания в Средиземном море [6]. Аналогичные случаи заражения при купании в водоёмах отмечены также в Швеции, Финляндии, Бельгии, Великобритании, Испании, Румынии, на Маврикии [3].
Авторы отмечают, что заражение людей происходит преимущественно в тёплое время года, что создаёт благоприятные условия как для купания, так и для размножения НАГ-вибрионов [5, 6]; высказывалось даже предположение о том, что продолжающиеся изменения климата могут в скором времени привести к повышению заболеваемости людей за счёт инфицирования НАГ-вибрионами и другими представителями вибриофлоры в мировом масштабе [7].
НАГ-вибрионы крайне вариабельны по гено-типическим свойствам за счёт высокой пластичности их геномов. В имеющихся публикациях генетические характеристики возбудителей внекишечных форм заболеваний ограничены ПЦР-детекцией отдельных генов, реже — данными частичного секве-нирования их участков. В базах National Center for Biotechnology Information (NCBI) были найдены
только полногеномные сиквенсы (WGSs) штаммов-возбудителей наружных отитов, выделенных в Австрии. Эти сиквенсы частично проанализированы S. Lepuschitz и соавт. в плане обнаружения генов антибиотикорезистентности [8].
Наш интерес к НАГ-вибрионам, вызвавшим отиты, обусловлен тем, что в 2017-2020 гг. такие штаммы выделялись из отделяемого уха больных на территории России.
Целью настоящей работы явился биоинформационный анализ полных геномов штаммов V. ско1вгав поп01/поп0139, выделенных от больных отитом на территории России, а также отдельных генов и продуктов их трансляции т ъШсо.
Материалы и методы
Объектами исследования служили 7 штаммов V. ско1вгав поп01/поп0139, выделенные от людей на территории России в 2017-2020 гг. Для сравнения в анализ был включен ещё 1 штамм, выделенный из крови больного с неизвестным диагнозом (табл. 1). Все штаммы получены из Музея живых культур (коллекция Референс-центра Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора).
Полногеномное секвенирование (WGS) осуществляли на платформе MiSeq [9]. Сравнительный однонуклеотидный анализ проводили соглас-
но предложенной ранее схеме [10].
Отдельные гены и их кластеры идентифицировали в полных геномах с помощью программ «BLASTN V. 2.2.29»1 и «Вк^й V. 7.2.5»2. Трансляцию генов, сравнительный анализ их нуклеотидных последовательностей и аминокислотных (аа) про-
1 URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov
2 URL: http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit
ORIGINAL RESEARCHES
Таблица 2. Сиквенсы, использованные в сравнительном анализе в качестве прототипов Table 2. Reference sequences used as prototypes in comparative analysis
NCBI ID
Штаммы Strains
Сиквенсы Sequences
AE003852, AE003853
AATY0200000000 AATY02000003, AATY02000004 AY876053, AB754471, AB754432 M85198 L03220
V. cholerae O1 N16061 V. cholerae O37 AM-19226
V. cholerae nonO1/nonO139 TP, C30, VC034 V. cholerae O31 NRT-36 V. cholerae O1 GP156
2 хромосомы 2 chromosomes
WGS
T3SS cluster
chxA-I, II, III
stn
sto
дуктов осуществляли с использованием пакета программ «Vector NTI Advance 11» («Invitrogen»). Прототипами служили соответствующие последовательности референс-штамма V. cholerae N16061 и другие, отсутствующие в его геноме (табл. 2). Для определения наличия и локализации активных доменов в белках, а также выявления их гомологов у штаммов из других регионов мира выполняли BLASTP-анализ.
Поиск в WGSs генетических детерминант лекарственной устойчивости проводили с использованием базы CARD3, а также нуклеотидных последовательностей отдельных генов, встречающихся у холерных вибрионов и отбранных в соответствии с набором включенных в исследование антибиотиков (табл. 3). Фенотипически чувствительность/устойчивость штаммов к антибактериальным препаратам определяли согласно МУК 4.2.2495-094.
WGSs штаммов, полученные нами в рамках настоящего исследования, депонированы в NCBI GenBank (BioProject: PRJNA781803, BioSample ID SAMN23296539-23296546).
Результаты
С помощью SNP-анализа WGSs 8 штаммов НАГ-вибрионов была построена дендрограмма, отражающая их сходство и различия (рис. 1).
Как видно из рис. 1, все штаммы различались между собой по содержанию SNP, хотя некоторые обладали более выраженным сходством друг с другом и образовали несколько кластеров, что указывает на отсутствие общих источников инфицирования даже в случаях одного места и времени выделения.
Далее были проведены идентификация в WGSs детерминант факторов патогенности/персистенции и их сравнительный биоинформационный анализ.
BLAST-анализ показал, что все исследованные штаммы были лишены профагов CTX, preCTX и
3 Comprehensive Antibiotic Resistance Database. URL: https://card.mcmaster.ca
4 Методические указания 4.2.2495-09. Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, ме-лиоидоз) к антибактериальным препаратам. М., 2009. 59 c.
RS1, острова патогенности VPI, гена термостабильного токсина stn/sto, а также острова пандемично-сти VSP-I. Однако остров VSP-II был выявлен у двух штаммов (173 и 1175).
Вместе с тем штаммы могли существенно различаться как по наборам генетических детерминант, так и по их аллельному составу. Так, всего у 2 штаммов, выделенных в Москве в 2019 г., присутствовали гены cholix-токсина (ChxA): у 173 — chxAI, у 1175 — chxAII.
Интактный кластер RTX, ответственный за синтез цитотоксина-актиномодулятора MARTX, присутствовал у всех штаммов, однако ген собственно токсина rtxA отличался значительной вариабельностью по длине и числу молчащих и мис-сенс-мутаций, что отразилось на аа-составе продуктов разных аллелей. Как видно из рис. 2, только у 2 штаммов белки MARTX оказались наиболее близкими прототипному RtxA1 и содержали все характерные для него активные домены: актин-связыва-ющий (ACD), инактивирующий Rho-ГТФазу (RID), цистеиновой протеазы (CPD) и а-Р-гидролаз (a/pH), два других отличались от них не только длиной, но и отсутствием ACD. Белки оставшихся 4 штаммов,
Рис. 1. Дендрограмма, построенная на основе кластерного анализа (UPGMA) распределения 3683 SNP, расположенных в открытых рамках считывания. В исследование включали только те SNP, для которых в пределах 9 п.н. от исследуемого полиморфизма не зафиксировано других мутаций.
Fig. 1. Phylogenetic tree based on cluster analysis (UPGMA) of distribution of 3683 SNPs located in open reading frames. Only SNPs that were not associated with other mutations within flanking 9 nucleotydes were included in analysis.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 3. Гены, использованные для идентификации детерминант антибиотикорезистентности в WGSs НАГ-вибрио-нов
Table 3. Genes used for identification of antibiotic resistance determinants in WGSs of NAGs
Гены Genes
Устойчивость к антибиотикам Resistance to antibiotics
ID сиквенсов, включающих искомые гены ID of sequences containing the necessary genes
tetA, tetR
floR
catB9 blaPI
carb7, carb9 blaNDM-1
blaCTX-M
qnrVCI
aadAI
strA, strB aphAI
aadA2, aadB arr3, arr-2 nfsA dfrA18
dfrAI, A12, A5 dfrA23 sul2, sull
Гены компонентов эффлюкс-помп: Genes for components of efflux pumps:
VC1634 N16961
VcmA, B, D, H, N, VcrM
Тетрациклины Tetracyclines
Хлорамфеникол Chloramphenicol
Ампициллин Ampicillin
Бета-лактамы (карбапенемы и др.) Beta-lactams (carbapenems et al.)
Цефалоспорины (цефтриаксон) Cephalosporins (ceftriaxone)
Фторхинолоны (налидиксовая кислота, ципрофлоксацин) Fluoroquinolones (nalidixic acid, ciprofloxacin)
Аминогликозиды (стрептомицин) Aminoglycosides (streptomycin)
Канамицин Kanamycin
Гентамицин Gentamicin
Рифампицин Rifampicin
Нитрофураны (фуразолидон) Nitrofurans (furazolidone)
Триметоприм Trimethoprim
Сульфаметоксазол Sulfamethoxazole
Бицикломицин/сульфонамиды и др. Bicyclomycin/sulfonamides et al.
Множественная Multiple
AB114188 (SXT)
AB114188, AY034138 (SXT)
NG_047621, AF462019 AB219457, AB219455, AY605693, AF221899
AF409092, AY248038 LN831184*, LN831185*
MT151380
EU436855, HM015626
Y115577, AY103457
AB114188 XXU13633, AY090559
AY103460, EU436855
HM015626, EU116441
AE004158
AY034138
AY103456, AF455254, AY103459, AF512546 MT151380* AB114188, AY034138; MT151380*
AE004241
AE004232, AB213656-213659, AB073219
Примечание. *Плазмиды. Note. *Plasmids.
лишенные не только ACD, но и a/pH, содержали по 2 RID. Кроме того, у них появился новый домен, описанный программой «BLASTP» как «rtxA-по-добный». На дендрограмме они образовали отдельный кластер.
Ген гемолизина hlyA был интактным у всех 8 штаммов, хотя и представлен разными отличными от прототипа аллелями за счёт молчащих и миссенс-мутаций. Такая же картина наблюдалась и при анализе входящего в состав hlj-локуса гена ме-
таллопротеазы рМУ. Оба гена имели «нормальную» (идентичную прототипу длину (соответственно 2226 и 2757 п.н.). Во всех геномах также присутствовали интактные гены других металлопроте-аз — гемагглютинин/протеазы НарА и коллагеназы УЛС.
Кроме генов металлопротеаз, были идентифицированы гены сериновых протеаз vesA, vesC, ыаР, rssP, тогда как vesB найден только у 4 штаммов (1175, 118, 20284 и 41), у остальных он отсутство-
- « -
«
«
«
«
ORIGINAL RESEARCHES
t
20377 Chelyabinsk-17 (0.0053) 20284 Chelyabinsk-17 (0.0055) 1175 Moscow-19 (0.0050) -735 Chelyabinsk-20 (0.0140)
a / a
€
— RtxAl prototype (0.0100) 118 Chelyabinsk-20 (0.0059) 173 Moscow-19 (0.0053)
-14890 Moscow-19 (0.0312)
-41 Moscow-18 (0.0108)
б / b ACD
entero EhxA
MARTX Nterm
118,173 (4545 aa)
IW\RTXNterm
RID
аЛэН CPD
entero EhxA
14980 (4370 aa), 41 (4356 aa)
tdA
MAR1X Nterm
RID
=4-
RID rlxA-like CPD
entero EhxA
20377, 1175, 735 (4525 aa), 20284 (4528 aa)
Рис. 2. Дендрограмма, построенная по результатам AlignX-анализа MARTX НАГ-вибрионов (а) и топография доменов
в их молекулах (б).
Fig. 2. Phylogenetic tree based on the results of AlignX analysis of MARTX of NAG vibrios (a) and topography of domains
in their molecules (b).
вал. Все исследуемые штаммы содержали разные аллели гена у четырех (173, 14980, 20377, 735) довольно близкие прототипу, у остальных они имели ряд делеций, кратных 3 нуклеотидам, в результате чего их продукты укоротились с 548 аа до 545 аа у штамма 118, 538 аа — у 1175 и 20284 аа, 534 аа — у 41, однако преждевременных стоп-кодонов не образовалось. Кроме того, у всех сохранились характерные активные домены и каталитическая триада Asp122, His75, Ser225 (у 3 последних — Ser219 за счёт предшествующей делеции 6 аа, однако остаток серина находился в короткой последовательности GDSGGPIFF, идентичной у всех штаммов). Также в типовых позициях находились S63, G159, У277, Q279 ^273), замещение которых на другие аа может приводить к блокировке активности белка [11].
Гены ^аР также различались по длине и ну-клеотидному составу, однако их продукты имели те же домены, что у прототипа. В базах NCBI найдены их гомологи, принадлежащие штаммам из разных регионов мира ^Я2467683, КАА1203788, MBJ6933743, EGQ7641687 и др.). Гены ромбосор-тазы гъъР также были представлены разными аллелями, из которых только один (штамма 735) был
близок прототипу (со старт-кодоном TTG), тогда как
7 остальных были укорочены до 60 п.н. из-за SNP G58T и образования преждевременного стоп-кодо-на. Однако ниже этой открытой рамки считывания (ORF) образовалась вторая, со старт-кодоном GTG. Продукты этих ORF2 (183-185 аа), различаясь между собой по аа-составу, тем не менее имели все 4 характерных активных домена. Такие формы RssP широко представлены в NCBI и обозначены как ромбосортазы V. cholerae.
Значительным разнообразием отличались и гены cef (CHO cell elongating factor). Продукты всех
8 аллелей этого гена, несмотря на существенные различия, сохранили все характерные активные домены — Куница, лейциновую молнию, a/ßH и LIP, а также субстрат-связывающий сайт GHSLG.
Что касается таких факторов, как контакт-зависимые системы секреции — 6-го и 3-го типов (T6SS и T3SS), то гены первой, входящие в состав основного кластера (vipAB, hiF, vasABCDEF, clpV vasHIJKLM), присутствовали в WGSs всех 8 штаммов, тогда как гены эффектора vgrG3 отличались вариабельностью, и только у 2 штаммов (14980 и 735) сохранили полную последовательность, кодирую-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
щую концевой пептидокликан-связывющий домен PBD, у остальных были значительно укорочены. Также не у всех выявлены гены дополнительных кластеров T6SS [12]. Aux-1 отсутствовал у штаммов 118 и 173, у остальных обнаружен ген эффектора vgrG1 с последовательностью, кодирующей ак-тин-связывающий домен ACD, но все были лишены tseL. Aux-2 не был найден у штаммов 20377 и 41, у остальных содержал гены эффекторов vasW и vasX. Aux-3 отсутствовал во всех WGS, а последовательности, гомологичные таковым Aux-4 [12], имелись у штаммов 1175, 41 и 735.
У одного из штаммов (118) присутствовал кластер T3SS, включая коровую область (гены регуляторов транскрипции vttR-A, B; структурных компонентов vcsN2, C2, T2, R2, Q2, U2, V2, J2, vspD; транслоконов vopH, A, M, I, W, F и 2 вариабельных фланкирующих участка: 3' (ген предполагаемого фактора вирулентности acfA, транслоконов vopE, X) и 5' (ген предполагаемых факторов вирулентности acfC, D и транслоконов vopG, K, Y, Z). Кроме того, в состав всех трех участков входили гены, функции которых пока не установлены. У штамма 118 структура кластера T3SS в целом совпадала с таковой референс-штамма АМ-19226, особенно коровой области, за исключением присутствия в ней дополнительной ORF длиной 1368 п.н., кодирующей белок-шаперон, после vopW. Почти все гены имели ту же длину, что у прототипа, но отличались значительным количеством SNP, ни один их которых не вызвал появления преждевременного стоп-кодона.
При анализе кластеров генов, обусловливающих продукцию маннозо-чувствительных пилей адгезии, установлено, что все изученные штаммы содержали изменённые гены структурных единиц пилей, ранее обозначенные нами как mshA-like и mshC-like [13]. Их продукты различались по аа-со-ставу и на дендрограммах имели разную степень сходства друг с другом (данные не показаны), однако все сохраняли активные домены адгезинов. Белки MshA-like могли различаться и по длине (148-162 аа), тогда как MshC-like все содержали по 170 аа. Ни один не имел близкого родства с прото-типными белками MshA (178 аа) и MshC (162 аа).
Кроме msh-кластера, у всех штаммов также присутствовали кластеры генов, ответственных за образование полисахаридов vpsI (vpsUABCDEFGYIJK), vpsII (vpsLMNOPQ) и матрикса биоплёнки rbm (rbmABCDEF), расположенного между ними. Все перечисленные гены у исследуемых штаммов в разной степени отличались как от прототипа, так и друг от друга по нуклеотидному составу, а некоторые и по длине, однако ни у одного не образовалось преждевременного стоп-кодона. Интактными оказались и гены регуляторов их экспрессии, локализованные в других участках генома — положительных (VpsR, VpsT) и отрицательных (CytR, HapR и H-NS). Наи-
более гетерогенным оказался кластер vpsI: только у 5 штаммов (1175, 14980, 20284, 20377 и 735) его структура полностью совпадала с прототипом, хотя в самих генах обнаруживались различные SNP. Напротив, у остальных выявлены отклонения, состоящие в отсутствии генов vpsC, vpsG и появлении новых ORF, не идентифицированных программой «BioEdit». Так, у штаммов 173 и 41 при отсутствии идентифицируемых vpsF и vpsG на их месте находились 2 ORF. Согласно данным программы «BLASTP», продукт первой имел 99-100% идентичности ряду гипотетических белков холерных вибрионов (EGR4217822, EGQ7706406, EGQ7879351 и др.), однако самой программой был обозначен как белок синтеза полисахаридов семейства VpsF (WP_000660859). Продукт второй ORF также имел 99-100% гомологи в базе NCBI среди гликозил-трансфераз V. cholerae (WP_113629015, EEO14829, EGQ9982865, EGR2039702, EGR2114868 и др.). У штамма 118 перед геном, сходным с vpsI, находились 3 дополнительных ORF, имеющих гомологи в NCBI; продукт одной из них (ORF2) был гомологичен большей части молекул белков, обозначенных как рибозилтрансферазы (WP_108243855, EGQ7689606 и др.) и содержал соответствующие активные домены, тогда как продукты ORF1 и ORF3 одинаковой длины (374 аа), но с совершенно различным аа-составом, тем не менее содержали одинаковые потенциальные домены. Один из которых имеет отношение к синтезу полисахаридов, функция второго неизвестна, хотя он сходен с RimK а-глутаматлигаз.
Самой выраженной вариабельностью обладал ген vpsU. У всех исследуемых НАГ-вибрионов эти гены различались по нуклеотидному составу, у некоторых также по длине и старт-кодонам, а у штамма 118 он даже не был идентифицирован программой «BioEdit», однако в дальнейшем в его продукте программой «BLASTP» были выявлены те же домены низкомолекулярных тирозинфосфатаз, что и у VpsU.
Кластеры vpsII и rbm были более или менее близки прототипам (не считая SNP в генах), за исключением «неопознанного» гена rbmA штамма 20284, продукт которого был гомологичен гипотетическим белкам V. cholerae (WP_142569116, TQP27817, TQQ39191 и др.) и RbmA V. albensis (EEO04139).
Генов, гомологичных детерминантам анти-биотикорезистентности (табл. 3), не выявлено почти у всех исследованных штаммов НАГ-ви-брионов (табл. 4). Исключением явилось обнаружение гена blaP1 у штамма 735 и catB9 у него же и штаммов 118 и 14980. В то же время у всех выявлен ген nsfA, хотя его связь с устойчивостью к фуразолидону описана для ряда бактерий, но не для холерных вибрионов. Что касается детерминант эффлюкс-помп, участвующих в обеспечении
ORIGINAL RESEARCHES
Таблица 4. Минимальная подавляющая концентрация (мг/л) штаммов V. cholerae nonO1/nonO139 и наличие генов антибиотикорезистентности
Table 4. Minimal inhibitory concentrations (mg/l) for V. cholerae nonO1/nonO139 strains and presence of genes associated with antibiotic resistance
Антибактериальные препараты / Antimicrobial agents
No. Strain TET DOX CMP AMP CFT NAL CIP STR KAN GEN RIF FUR SXT
1 41 0,25 0,25 2 32R 4R 2 0,001 8 8 0,25 2 32R 4
2 173 0,25 0,25 2 4 0,5 2 0,001 8 8 0,25 2 64R 0,5
3 1175 0,25 0,25 2 16R 0,5 2 0,001 8 4 0,25 4 32R 16R
4 20377 0,25 0,25 1 4 0,5 2 0,001 8 8 0,25 2 32R 0,5
5 20284 0,25 0,25 1 81 0,5 16R 0,001 8 4 0,25 2 32R 0,5
6 14980 0,25 0,25 1 81 0,5 2 0,001 8 8 0,25 8I 32R 8R
7 118 0,25 0,25 2 4 0,5 2 0,001 8 4 0,25 2 32R 4
8 735 1 0,25 2 128R 1 2 0,001 8 8 0,25 32R 32R 4
№ No. Штамм Strain Гены / Genes
tetA,R unknown catB9 blaPI, carb7,9 blaCTX-M qnrVCI strA,B, aadAI aphAI aadA2 arr2,3 nsfA dfrA/ sul2
1 41 - - - - - - - - + -/-
2 173 - - - - - - - - + -/-
3 1175 - - - - - - - - + -/-
4 20377 - - - - - - - - + -/-
5 20284 - - - - - - - - + -/-
6 14980 - + - - - - - - + -/-
7 118 - + - - - - - - + -/-
8 735 - + + - - - - - + -/-
Примечание. TET — тетрациклин, DOX — доксициклин, CMP — хлорамфеникол, AMP — ампициллин, CFT — цефтриаксон, NAL — налидиксовая кислота, CIP — ципрофлоксацин, STR — стрептомицин, KAN — канамицин, GEN — гентамицин, RIF — рифампицин, FUR — фуразолидон, SXT — триметоприм/сульфаметоксазол.
У всех штаммов также выявлены гены эффлюкс-помп VC1634, vcmABDHN, vcrM и не выявлены SXT, интегроны 1 класса и плазми-ды. R — устойчивость, 1 — промежуточная устойчивость; остальные значения соответствуют чувствительности в соответствии с МУК 4.2.2495-09.
Note. TET — tetracycline, DOX — doxycycline, CMP — chloramphenicol, AMP — ampicillin, CFT — ceftriaxone, NAL — nalidixic acid, CIP — ciprofloxacin, STR — streptomycin, KAN — kanamycin, GEN — gentamicin, RIF — rifampicin, SXT — trimethoprim/sulfamethoxazole All strains also shared efflux pump genes VC1634, vcmABDHN, vcrM, and lacked SXTelements, class 1 integrons and plasmids. R — resistance, I — intermediate resistance; the rest values correspond to sensitivity, in accordance with MUK 4.2.2495-09.
множественной лекарственной устойчивости, то они присутствовали у всех штаммов. Не удалось выявить мобильных элементов ^ХТ, интегронов класса 1, плазмид) и связанных с ними интеграз. Фенотипически все исследованные штаммы были устойчивы к фуразолидону и чувствительны к большинству антибиотиков. Вместе с тем некоторые проявляли резистентность к отдельным препаратам — от 1 до 4 (табл. 4).
Обсуждение
SNP-анализ показал, что исследованные штаммы НАГ-вибрионов, выделенные от разных больных, в большей или меньшей степени различались. Эти данные подтвердили отсутствие общих источников инфицирования даже в случаях одного места и времени выделения, что не удивительно, поскольку внекишечные формы заболеваний возникают,
как правило, спорадически и не связаны с локальными вспышками.
Наибольший интерес представлял сравнительный анализ структуры генов факторов патогенно-сти, которые могли внести свой вклад в развитие заболеваний, а также факторов персистенции, обеспечивающих выживание в водоёмах, обычно служащих источниками инфекции при отитах. При этом многие биологически активные субстанции вибрионов совмещают в себе свойства тех и других, т.е. являются по сути факторами патогенности/ персистенции.
Гены одного из таких факторов — ЛоНх-ток-сина — были выявлены у 2 из 8 штаммов, причём в виде разных аллелей: chxAI и chxAII. Продукты этих генов (в отличие от третьей известной формы ЗДхАШ) считаются причастным к развитию в основном внекишечных форм заболеваний, тогда как
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
их роль в патогенезе острых кишечных инфекций остаётся спорной [14]; в то же время все 3 формы могут способствовать персистенции возбудителей в ассоциации с водными ракообразными [15].
Одним из существенных факторов патогенно-сти холерных вибрионов считается высокомолекулярный цитотоксин-актиномодулятор MARTX, чья биологическая активность обусловлена присутствием в молекуле нескольких активных доменов: ACD, RID, CPD, a/ßH. У нетоксигенных штаммов, в особенности у НАГ-вибрионов, кодирующий его ген rtxA может быть представлен множеством аллелей. Среди их продуктов зачастую встречаются белки, утратившие один или более доменов, иногда взамен приобретя новые [16]. Наиболее близкими к прототипному MARTX оказались продукты генов двух разных по происхождению штаммов, два других отличались от них не только длиной, но и отсутствием ACD. Белки оставшихся 4 штаммов, лишённые не только ACD, но и a/ßH, содержали по 2 RID. Наибольший интерес представляет обнаружение у них rtxA-подобного домена (cd147295), который не выявлялся в MARTX возбудителей кишечных инфекций, изученных нами ранее [16]. Этот домен ещё недостаточно охарактеризован, однако, согласно аннотации программы «BLASTP», встречается у ряда белков, включая MARTX этиологического агента наиболее опасных раневых инфекций V. vulnificus и дермонекротический токсин Pasteu-rella multicida — возбудителя пастереллеза, который у людей также может протекать в форме раневой инфекции. Поэтому не исключено, что данный изменённый фактор мог приобрести свойства других токсинов, способных участвовать в патогенезе.
В качестве мощного фактора патогенности может выступать гемолизин/цитолизин HlyA, особенно у нетоксигенных штаммов разных серогрупп [1]. В нашем случае кодирующий его ген был интакт-ным у всех 8 штаммов, хотя и представлен разными отличными от прототипа аллелями за счёт молчащих и миссенс-мутаций. Такая же картина наблюдалась при анализе входящего в состав hlj-локуса гена металлопротеазы PrtV, обладающей цитоток-сической активностью за счёт деградации фибриногена, фибронектина и плазминогена, а также оказывающей летальное действие на водных беспозвоночных, питающихся бактериями [17]. Гены других металлопротеаз — гемагглютинин/протеазы HA/P и коллагеназы VchC — также были интактными. Первая может выступать в роли токсина-актиномоду-лятора и обеспечивать конкурентоспособность вибрионов в разных экологических нишах, благодаря широкому спектру протеолитической активности, вторая, предположительно, способствует развитию
5 По базе данных CDD — Conserved Domains Database. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd
раневых инфекций и утилизации коллагена гидро-бионтов в качестве источника питания [18].
Гены сериновых протеаз vesA, vesC, ivaP, rssP выявлены у всех штаммов, а vesB — только у 4, у остальных он отсутствовал. VesC способствует развитию воспалительной диареи [19], причастность к внекишечным формам заболевания и конкурентоспособности вибрионов нигде не описана, хотя можно предположить, что протеолитическая активность позволяет утилизировать белковые субстраты. VesA и VesB наряду с HA/P могут активировать А-субъединицу холерного токсина, что не актуально для нетоксигенных штаммов, но вносят (особенно вторая) значительный вклад в протео-литическую активность холерных вибрионов [20]. Поскольку холерные вибрионы обладают множеством протеаз, отсутствие гена vesB у 4 исследуемых штаммов вполне может компенсироваться экспрессией других генов. IvaP — сериновая протеаза семейства S8 — участвует в деградации фактора иммунной защиты макроорганизма интелектина, а также в переходе планктонных бактериальных клеток в биоплёнку и обратно [20]. Ромбосортаза (RssP) осуществляет посттранскрипционную модификацию Ves-протеаз, однако экспериментальные данные были получены с использованием прото-типной RssP [21], тогда как активность ее изменённых форм неизвестна.
Значительным разнообразием отличались и гены cef, кодирующий цитотонический токсин, одновременно обладающий свойствами липазы/ эстеразы, ответственной за усвоение липидных субстратов и способной к разрушению поверхностно-активных веществ, в настоящее время часто загрязняющих поверхностные водоемы. Продукты всех 8 аллелей генов cef, несмотря на существенные различия, сохранили все характерные активные домены. Причастность Cef к патогенезу внекишечных форм заболеваний не известна, однако его способность повреждать ультраструктуру культивируемых клеток [22] не исключает такой возможности.
Важным фактором патогенности/персистенции холерных вибрионов является T6SS: в организме хозяина вызывает обездвиживание и гибель макрофагов, способствует колонизации кишечника [23], в объектах окружающей среды защищает вибрионы от поедания одноклеточными хищниками, питающимися бактериями, и участвует в колонизации хитина водных беспозвоночных, а в обоих нишах — убивает бактерий-конкурентов, продукты лизиса которых могут служить источниками питания [24]. Отсутствие у некоторых исследованных штаммов отдельных детерминант T6SS вызывает сомнения по поводу возможности её экспрессии, в особенности у штаммов 118, 173, 20377 и 41, поскольку у двух первых отсутствовал ген ключевого эффектора vgrGl, у двух вторых — vasX. Кроме того, у всех
ORIGINAL RESEARCHES
8 штаммов отсутствовал ген tseL. Вместе с тем известно, что VgrGl, VasX и TseL необходимы для проявления устойчивости к поеданию простейшими, а последний и VgrG3 обеспечивают антагонистическую актиность по отношению к бактериям, причём степень утраты данных свойств зависит от числа отсутствующих либо повреждённых генов [25], поэтому для определения соответствующих фенотипов исследуемых штаммов требуются дополнительные экспериментальные исследования.
Наличие интактного кластера T3SS у одного из штаммов предполагает возможность экспрессии данной системы секреции. Известно, что она способствует колонизации кишечника и развитию тяжёлой летальной диареи у лабораторных животных [26]. Высказывалось предположение о её возможном вкладе в выживаемость вибрионов в объектах окружающей среды в ассоциации с водными организмами [27].
Одной из составляющих успешного переживания в водоёмах является способность вибрионов к биоплёнкообразованию. Кодируемые msh-кла-стером пили MSHA обеспечивают адгезию бактериальных клеток к абиотическим и биотическим поверхностям, предшествующую формированию биопленки, а её дальнейшее созревание зависит от экспрессии генов, организованных в 3 сцепленных кластера: vpsI-rbm-vps-II. Несмотря на существенные различия в структуре этих кластеров, мы полагаем, что все они находятся в функционально активном состоянии. Ранее нами были выявлены штаммы V. cholerae O1 серогруппы, обладающие сходной структурой генов mshA-like, mshC-like, vps, rbm и при этом в экспериментах in vitro образовавшие зрелые биоплёнки на стекле с гораздо большей скоростью по сравнению со штаммами, содержащими прототипные либо близкие им кластеры [9]. Не исключено, что именно эти изменения лежат в основе селективных преимуществ и НАГ-вибри-онов. MSHA обычно связывают с персистенцией холерных вибрионов в водоёмах за счёт формирования биоплёнок на абиотических и биотических поверхностях и противостояния поеданию водными беспозвоночными, тогда как их роль в колонизации кишечника человека считается незначительной. Однако MSHA-подобные пили не чувствительны к маннозе, и в условиях эксперимента штаммы НАГ-вибрионов — возбудители острых кишечных инфекций с таким же генотипом — обладали адгезивной активностью [13]. Это позволяет предположить, что в отсутствие пилей TCP и других адгези-нов они могут брать на себя роль ключевого фактора колонизации.
Для успешного лечения НАГ-инфекций крайне важны данные о спектрах резистентности штаммов-возбудителей. В литературе описан случай полного излечения больного, страдавшего от хро-
нического отита в течение 3 лет, после непродолжительного применения ушных капель с правильно подобранным антибиотиком (ципрофлоксацином) [4]. Известны и другие случаи успешного лечения отитов препаратами, подобранными на основе анти-биотикограмм [3, 5, 6]. В литературе встречаются сообщения о штаммах НАГ-вибрионов, устойчивых к одному и более антибактериальным препаратам и содержащих соответствующие генетические детерминанты в составе интегронов либо плазмид [28, 29]. Изученные нами штаммы не содержали мобильных элементов SXT, интегронов 1 класса, плазмид и, соответственно, связанных с ними детерминант антибиотикорезистентности. В большинстве случаев их отсутствие коррелировало с чувствительностью к антибиотикам. Однако иногда наблюдалось несоответствие результатов изучения фено- и генотипов. Например, 5 из 8 штаммов были в различной степени устойчивы к ампициллину, и только у одного из них, самого устойчивого, были выявлены гомологи генов бета-лактамаз blaP1, bla-carb7, bla-carb9, хотя все они обнаруживались в одной позиции, что указывает на присутствие одного гена в виде аллеля, характерного для этого штамма.
Что касается устойчивости всех изученных нами штаммов к фуразолидону, то не исключается, что она обусловлена продуктом гена nfsA, хотя сведения о связи между его экспрессией и реальной устойчивостью холерных вибрионов к нитрофура-нам в литературе отсутствуют.
По одному штамму были устойчивы к цефтри-аксону и налидиксовой кислоте, по 2 — к рифам-пицину и триметоприм/сульфаметоксазолу при полном отсутствии соответствующих генов. И наоборот, все 3 штамма, содержащие catB9, были чувствительны к хлорамфениколу. Аналогичные несоответствия были выявлены S. Lepuschitz и со-авт. при изучении штаммов НАГ-вибрионов, выделенных из природного водоёма [8], несмотря на использование ими не только базы данных CARD, но и ResFinder6. Авторы считают, что на сегодняшний день эти базы являются недостаточно надёжными для оценки устойчивости НАГ-вибрионов и нуждаются в существенном пополнении.
С другой стороны, экспрессия генов не является единственным способом защиты от антимикробных агентов. Практически все холерные вибрионы, в том числе изученные нами штаммы, имеют эф-флюкс-помпы, препятствующие проникновению антибиотиков в бактериальную клетку [30]. Кроме того, устойчивость зависит от внешних факторов и сложных регуляторных механизмов, требующих отдельного изучения.
В связи с вышеизложенным на данном этапе при выборе адекватного препарата для этиотропной
6 URL: http://www.genomicepidemiology.org
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
терапии НАГ-инфекций следует полагаться в основном на фенотип.
Заключение
Проведённый анализ показал, что все изученные штаммы-возбудители отитов обладают достаточными наборами детерминант факторов патоген-ности для успешной реализации патогенетического потенциала, что, впрочем, характерно и для большинства НАГ-вибрионов, причастных к развитию других форм заболеваний (как внекишечных, так и кишечных). Эти наборы могут варьировать от штамма к штамму, но отсутствие одних генов может компенсироваться наличием других, что определяет способность вызывать различные патологические процессы в организме человека. Кроме того, НАГ-вибрионы как естественные обитатели поверхностных водоёмов хорошо приспособлены к длительному существованию в объектах окружающей среды за счёт целого ряда факторов персистен-ции, причём эти функции часто присущи факторам патогенности, поэтому мы назывем их факторами патогенности/персистенции. Продукция таких факторов находится под контролем ряда регуляторных белков, запускающих либо блокирующих экспрессию в зависимости от пребывания в той или иной экологической нише [1].
Несмотря на то что внекишечные формы НАГ-инфекций носят спорадический характер и не передаются от человека к человеку, выявление в последние годы штаммов-возбудителей на территории России вызывает настороженность и указывает на необходимость повышения внимания к данной группе микроорганизмов. В связи с этим представляется целесообразным включение тестов на присутствие НАГ-вибрионов в схему бактериологического анализа при отитах и других внеки-шечных инфекциях, этиологическим фактором которых могут быть эти микроорганизмы. В случаях их выделения требуется оперативное определение чувствительности к антибиотикам, что позволит обеспечить применение оптимальной схемы лечения больных или осуществить её своевременную коррекцию.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Монахова Е.В., Архангельская И.В. Холерные вибрионы неО1/неО139 серогрупп в этиологии острых кишечных инфекций: современная ситуация в России и в мире. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; (2): 14-23. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-2-14-23
2. Schirmeister F., Dieckmann R., Bechlars S., Bier N., Faru-que S.M., Strauch E. Genetic and phenotypic analysis of Vibrio cholerae non-O1, non-O139 isolated from German and Austrian patients. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2014; 33(5): 76778. https://doi.org/10.1007/s10096-013-2011-9.
3. van Bonn S.M., Schraven S.P., Schuldt T., Heimesaat M.M., Mlynski R., Warnke P.C. Chronic otitis media following infec-
tion by non-O1/non-O139 Vibrio cholerae: a case report and review of the literature. Eur. J. Microbiol. Immunol. (Bp). 2020; 10(3): 186-91. https://doi.org/10.1556/1886.2020.0001310.155 6/1886.202000013
4. Kechker P., Senderovich Y., Ken-Dror S., Laviad-Shitrit S., Arakawa E., Halpern M. Otitis media caused by V. cholerae 0100: a case report and review of the literature. Front. Microbiol. 2017; 8: 1619. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01619
5. Leroy A.G., Lerailler F., Quilici M.L., Bourdon S. Vibrio cholerae non-01/non-0139 otitis in metropolitan France. Med. Mal. Infect. 2019; 49(5): 359-61. https://doi.org/10.1016/j.medmal.2019.03.003 (in French)
6. Diaz-Menendez M., Alguacil-Guillen M., Bloise I., Garcia-Pallares M., Mingorance J. A case of otitis externa caused by non-01/non-0139 Vibrio cholerae after exposure at a Mediterranean bathing site. J. Rev. Esp. Quimioter. 2018; 31(3): 295-7.
7. Vezzulli L., Grande C., Reid P.C., Helaouet P., Edwards M., Hofle M.G., et al. Climate influence on Vibrio and associated human diseases during the past half-century in the coastal North Atlantic. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016; 113(34): E5062-71. https://doi.org/10.1073/pnas.1609157113
8. Lepuschitz S., Baron S., Larvor E., Granier S.A., Pretzer C., Mach R.L., et al. Phenotypic and genotypic antimicrobial resistance traits of Vibrio cholerae non-01/non-0139 isolated from a large Austrian lake frequently associated with cases of human infection. Front. Microbiol. 2019; 10: 2600. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02600
9. Титова С.В., Монахова Е.В., Алексеева Л.П., Писанов Р.В. Молекулярно-генетические основы биопленкообразования как составляющей персистенции Vibrio cholerae в водоемах Российской Федерации. Экологическая генетика. 2018; 16(4): 23-32. https://doi.org/10.17816/ecogen16423-32
10. Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Водопьянов С.О., Мишань-кин Б.Н., Олейников И.П., Кругликов В.Д. и др. Молекулярная эпидемиология Vibrio cholerae — разработка алгоритма анализа данных полногеномного секвенирования. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2016; 21(3): 146-52. https://doi.org/10.18821/1560-9529-2016-21-3-146-152
11. Rule C.S., Park Y.J., Delarosa J.R., Turley S., Hol W.G.J., McColm S., et al. Suppressor mutations in type II secretion mutants of Vibrio cholerae: inactivation of the VesC protease. mSphere. 2020; 5(6): e01125-20. https://doi.org/10.1128/mSphere.01125-20
12. Crisan C.V., Hammer B.K. The Vibrio cholerae type VI secretion system: toxins, regulators and consequences. Environ. Microbiol. 2020; 22(10): 4112-22. https://doi.org/10.1111/1462-2920.14976
13. Монахова Е.В., Архангельская И.В., Титова С.В., Писанов Р.В. MSHA-подобные пили нетоксигенных штаммов холерных вибрионов. Проблемы особо опасных инфекций. 2019; (3): 75-80.
https://doi.org/10.21055/0370-1069-2019-3-75-80
14. Awasthi S.P., Asakura M., Chowdury N., Neogi S.B., Hine-noya A., Golbar H.M., et al. Novel cholix toxin variants, ADP-ribosilating toxins in Vibrio cholerae non01/non0139 strains, and their pathogenicity. Infect. Immun. 2013; 81(2): 531-41. https://doi.org/10.1128/IAI.00982-12
15. Lugo M.R., Merrill A.R. The father, son and cholix toxin: the third member of the DT group mono-ADP-ribosyltransferase toxin family. Toxins (Basel). 2015; 7(8): 2757-72. https://doi.org/10.3390/toxins7082757
16. Монахова Е.В., Архангельская И.В., Писанов Р.В., Титова С.В. Особенности первичной структуры цитотоксина MARTX нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae разных серогрупп. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; (3): 73-7. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2018-3-73-77
17. Vaitkevicius K., Rompikuntal P.K., Lindmark B., Vaitke-vicius R., Song T., Wai S.N. The metalloprotease PrtV from
Vibrio cholerae. FEBS J. 2008; 275(12): 3167-77. https://doi.org/10.nn/j.1742-4658.2008.06470.x
18. Park B.R., Zielke R.A., Wierzbicki I.H., Mitchell K.C., Wit-hey J.H., Sikora A.E. A metalloprotease secreted by the type II secretion system links Vibrio cholerae with collagen. J. Bacteriol. 2015; 197(6): 1051-64. https://doi.org/10.1128/JB.02329-14
19. Syngkon A., Elluri S., Koley H., Rompikuntal P.K., Saha D.R., Chakrabarti M.K., et al. Studies on a novel serine protease of a AhapAAprtV Vibrio cholerae O1 strain and its role in hemorrhagic response in the rabbit ileal loop model. PLoS One. 2010; 5(9): e13122.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013122
20. Hatzios S.K., Abel S., Martell J., Hubbard T., Sasabe J., Mu-nera D., et al. Chemoproteomic profiling of host and pathogen enzymes active in cholera. Nat. Chem. Biol. 2016; 12(4): 26874. https://doi.org/10.1038/nchembio.2025
21. Gadwal S., Johnson T.L., Remmer H., Sandkvist M. C-terminal processing of GlyGly-CTERM containing proteins by rhom-bosortase in Vibrio cholerae. PLoS Pathog. 2018; 14(10): e1007341. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1007341
22. Монахова Е.В., Федоренко Г.М., Мазрухо А.Б., Писа-нов Р.В., Крутиков В.Д., Маркина О.В. и др. Изучение биологического действия цитотонического фактора Cef холерных вибрионов на моделях in vitro и in vivo. Проблемы особо опасных инфекций. 2012; (1): 62-5.
23. Blokesch M. Competence-induced type VI secretion might foster intestinal colonization by Vibrio cholerae: intestinal interbacterial killing by competence-induced V. cholerae. Bioessays. 2015; 37(11): 1163-8. https://doi.org/10.1002/bies.201500101
24. Pukatzki S., Provenzano D. Vibrio cholerae as a predator: lessons from evolutionary principles. Front. Microbiol. 2013; 4: 384. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00384
25. Dong T.G., Ho B.T., Yoder-Himes D.R., Mekalanos J.J. Identification of T6SS-dependent effector and immunity proteins by Tn-seq in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2013; 110(7): 2623-8.
https://doi.org/10.1073/pnas.1222783110
26. Shin O.S., Tam V.C., Suzuki M., Ritchie J.M., Bronson R.T., Waldor M.K., et al. Type III secretion is essential for the rapidly fatal diarrheal disease caused by non-O1, non-O139 Vibrio cholerae. mBio. 2011; 2(3): e00106-11. https://doi.org/10.1128/mBio.00106-11
27. Dzeijman M., Serruto D., Tam V.C., Sturtevant D., Diraphat P., Faruque S.M., et al. Genomic characterization of non-O1, non-O139 Vibrio cholerae reveals genes for a type III secretion system. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(90): 3465-70. https://doi.org/10.1073/pnas.0409918102
28. Shi L., Fujihara K., Sato T., Ito H., Garg P., Chakrabarty R., et al. Distribution and characterization of integrons in various serogroups of Vibrio cholerae strains isolated from diarrhoeal patients between 1992 and 2000 in Kolkata, India. J. Med. Microbiol. 2006; 55(Pt. 5): 575-83. https://doi.org/10.1099/jmm.0.46339-0
29. Verma J., Bag S., Saha B., Kumar P., Ghosh T.S., Dayal M., et al. Genomic plasticity associated with antimicrobial resistance in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2019; 116(13): 6226-31. https://doi.org/10.1073/pnas.1900141116
30. Das B., Verma J., Kumar P., Ghosh A., Ramamurthy T. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae: understanding the ecology of resistance genes and mechanisms. Vaccine. 2020; 38(Suppl. 1): A83-92. https://doi.org/10.10167j.vaccine.2019.06.031
REFERENCES
1. Monakhova E.V., Arkhangel'skaya I.V. Cholera vibrios of no-nO1/nonO139 serogroups in etiology of acute intestinal infections: current situation in Russia and around the world. Proble-
ORIGINAL RESEARCHES
my osobo opasnykh infektsiy. 2016; (2): 14-23. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-2-14-23 (in Russian)
2. Schirmeister F., Dieckmann R., Bechlars S., Bier N., Faruque S.M., Strauch E. Genetic and phenotypic analysis of Vibrio cholerae non-O1, non-O139 isolated from German and Austrian patients. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2014; 33(5): 767-78. https://doi.org/10.1007/s10096-013-2011-9.
3. van Bonn S.M., Schraven S.P., Schuldt T., Heimesaat M.M., Mlynski R., Warnke P.C. Chronic otitis media following infection by non-O1/non-O139 Vibrio cholerae: a case report and review of the literature. Eur. J. Microbiol. Immunol. (Bp). 2020; 10(3): 186-91. https://doi.org/10.1556/1886.2020.0001310.155 6/1886.2020.00013
4. Kechker P., Senderovich Y., Ken-Dror S., Laviad-Shitrit S., Arakawa E., Halpern M. Otitis media caused by V. cholerae O100: a case report and review of the literature. Front. Micro-biol. 2017; 8: 1619. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01619
5. Leroy A.G., Lerailler F., Quilici M.L., Bourdon S. Vibrio cholerae non-O1/non-O139 otitis in metropolitan France. Med. Mal. Infect. 2019; 49(5): 359-61. https://doi.org/10.1016/j.medmal.2019.03.003 (in French)
6. Diaz-Menendez M., Alguacil-Guillen M., Bloise I., Garcia-Pallares M., Mingorance J. A case of otitis externa caused by non-01/non-0139 Vibrio cholerae after exposure at a Mediterranean bathing site. J. Rev. Esp. Quimioter. 2018; 31(3): 295-7.
7. Vezzulli L., Grande C., Reid P.C., Helaouet P., Edwards M., Höfle M.G., et al. Climate influence on Vibrio and associated human diseases during the past half-century in the coastal North Atlantic. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016; 113(34): E5062-71. https://doi.org/10.1073/pnas.1609157113
8. Lepuschitz S., Baron S., Larvor E., Granier S.A., Pretzer C., Mach R.L., et al. Phenotypic and genotypic antimicrobial resistance traits of Vibrio cholerae non-O1/non-O139 isolated from a large Austrian lake frequently associated with cases of human infection. Front. Microbiol. 2019; 10: 2600. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02600
9. Titova S.V., Monakhova E.V., Alekseeva L.P., Pisanov R.V. Molecular genetic basis of biofilm formation as a component of Vibrio cholerae persistence in water reservoirs of Russian Federation. Ekologicheskaya genetika. 2018; 16(4): 23-32. https://doi.org/10.17816/ecogen16423-32 (in Russian)
10. Vodop'yanov A.S., Pisanov R.V., Vodop'yanov S.O., Mishan'-kin B.N., Oleynikov I.P., Kruglikov V.D., et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae — development of the algorithm for data analysis of whole genome sequencing. Epidemi-ologiya i infektsionnye bolezni. 2016; 21(3): 146-52. https:// doi.org/10.18821/1560-9529-2016-21-3-146-152 (in Russian)
11. Rule C.S., Park Y.J., Delarosa J.R., Turley S., Hol W.G.J., McColm S., et al. Suppressor mutations in type II secretion mutants of Vibrio cholerae: inactivation of the VesC protease. mSphere. 2020; 5(6): e01125-20. https://doi.org/10.1128/mSphere.01125-20
12. Crisan C.V., Hammer B.K. The Vibrio cholerae type VI secretion system: toxins, regulators and consequences. Environ. Mi-crobiol. 2020; 22(10): 4112-22.
https://doi.org/10.1111/1462-2920.14976
13. Monakhova E.V., Arkhangel'skaya I.V., Titova S.V., Pisanov R.V. MSHA-like pili of non-toxigenic Vibrio choleraе strains. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2019; (3): 75-80. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2019-3-75-80
14. Awasthi S.P., Asakura M., Chowdury N., Neogi S.B., Hine-noya A., Golbar H.M., et al. Novel cholix toxin variants, ADP-ribosilating toxins in Vibrio cholerae nonO1/nonO139 strains, and their pathogenicity. Infect. Immun. 2013; 81(2): 531-41. https://doi.org/10.1128/IAI.00982-12
15. Lugo M.R., Merrill A.R. The father, son and cholix toxin: the third member of the DT group mono-ADP-ribosyltransferase toxin family. Toxins (Basel). 2015; 7(8): 2757-72. https://doi.org/10.3390/toxins7082757
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
16. Monakhova E.V., Arkhangel'skaya I.V., Pisanov R.V., Tito-va S.V. Peculiarities of primary martx cytotoxin structure in non-toxigenic Vibrio cholerae strains of different serogroups. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2018; (3): 73-7. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2018-3-73-77 (in Russian)
17. Vaitkevicius K., Rompikuntal P.K., Lindmark B., Vaitkevi-cius R., Song T., Wai S.N. The metalloprotease PrtV from Vibrio cholerae. FEBS J. 2008; 275(12): 3167-77. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2008.06470.x
18. Park B.R., Zielke R.A., Wierzbicki I.H., Mitchell K.C., Withey J.H., Sikora A.E. A metalloprotease secreted by the type II secretion system links Vibrio cholerae with collagen. J. Bacteriol. 2015; 197(6): 1051-64. https://doi.org/10.1128/JB.02329-14
19. Syngkon A., Elluri S., Koley H., Rompikuntal P.K., Saha D.R., Chakrabarti M.K., et al. Studies on a novel serine protease of a AhapAAprtV Vibrio cholerae O1 strain and its role in hemor-rhagic response in the rabbit ileal loop model. PLoS One. 2010; 5(9): e13122. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013122
20. Hatzios S.K., Abel S., Martell J., Hubbard T., Sasabe J., Mune-ra D., et al. Chemoproteomic profiling of host and pathogen enzymes active in cholera. Nat. Chem. Biol. 2016; 12(4): 268-74. https://doi.org/10.1038/nchembio.2025
21. Gadwal S., Johnson T.L., Remmer H., Sandkvist M. C-ter-minal processing of GlyGly-CTERM containing proteins by rhombosortase in Vibrio cholerae. PLoS Pathog. 2018; 14(10): e1007341. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1007341
22. Monakhova E.V., Fedorenko G.M., Mazrukho A.B., Pisanov R.V., Kruglikov V.D., Markina O.V., et al. Study of biological effect of cho-cell elongating factor of Vibrio cholerae on models in vitro and in vivo. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; (1): 62-5. (in Russian)
23. Blokesch M. Competence-induced type VI secretion might foster intestinal colonization by Vibrio cholerae: intestinal inter-
bacterial killing by competence-induced V. cholerae. Bioessays. 2015; 37(11): 1163-8. https://doi.org/10.1002/bies.201500101
24. Pukatzki S., Provenzano D. Vibrio cholerae as a predator: lessons from evolutionary principles. Front. Microbiol. 2013; 4: 384. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00384
25. Dong T.G., Ho B.T., Yoder-Himes D.R., Mekalanos J.J. Identification of T6SS-dependent effector and immunity proteins by Tn-seq in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2013; 110(7): 2623-8. https://doi.org/10.1073/pnas.1222783110
26. Shin O.S., Tam V.C., Suzuki M., Ritchie J.M., Bronson R.T., Waldor M.K., et al. Type III secretion is essential for the rapidly fatal diarrheal disease caused by non-O1, non-O139 Vibrio cholerae. mBio. 2011; 2(3): e00106-11. https://doi.org/10.1128/mBio.00106-11
27. Dzeijman M., Serruto D., Tam V.C., Sturtevant D., Diraphat P., Faruque S.M., et al. Genomic characterization of non-O1, non-O139 Vibrio cholerae reveals genes for a type III secretion system. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(90): 3465-70. https://doi.org/10.1073/pnas.0409918102
28. Shi L., Fujihara K., Sato T., Ito H., Garg P., Chakrabarty R., et al. Distribution and characterization of integrons in various serogroups of Vibrio cholerae strains isolated from diarrhoeal patients between 1992 and 2000 in Kolkata, India. J. Med. Mi-crobiol. 2006; 55(Pt. 5): 575-83. https://doi.org/10.1099/jmm.0.46339-0
29. Verma J., Bag S., Saha B., Kumar P., Ghosh T.S., Dayal M., et al. Genomic plasticity associated with antimicrobial resistance in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2019; 116(13): 6226-31. https://doi.org/10.1073/pnas.1900141116
30. Das B., Verma J., Kumar P., Ghosh A., Ramamurthy T. Antibiotic resistance in Vibrio cholerae: understanding the ecology of resistance genes and mechanisms. Vaccine. 2020; 38(Suppl. 1): A83-92. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.06.031
Информация об авторах
Монахова Елена Владимировнам — д.б.н., г.н.с. отдела микробиологии холеры и других острых кишечных инфекций Ростов-ского-на-Дону противочумного института, Ростов-на-Дону, Россия, monakhova_ev@antiplague.ru, https://orcid.org/0000-0002-9216-7777
Водопьянов Алексей Сергеевич — к.м.н., с.н.с. лаб. молекулярной биологии природно-очаговых и зоонозных инфекций Ростов-ского-на-Дону противочумного института, Ростов-на-Дону, Россия, https://orcid.org/0000-0002-9056-3231
Кругликов Владимир Дмитриевич — д.м.н., начальник отдела микробиологии холеры и других острых кишечных инфекций Ро-стовского-на-Дону противочумного института, Ростов-на-Дону, Россия, https://orcid.org/0000-0002-6540-2778
Селянская Надежда Александровна — к.м.н., с.н.с. отдела микробиологии холеры и других острых кишечных инфекций Ро-стовского-на-Дону противочумного института, Ростов-на-Дону, Россия, https://orcid.org/0000-0002-0008-4705 Писанов Руслан Вячеславович — к.б.н., зав. лаб. молекулярной биологии природно-очаговых и зоонозных инфекций Ростовско-го-на-Дону противочумного института, Ростов-на-Дону, Россия, https://orcid.org/0000-0002-7178-8021
Носков Алексей Кимович — к.м.н., директор Ростовского-на-Дону противочумного института, Ростов-на-Дону, Россия, https://orcid.org/0000-0003-05502221
Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.
Статья поступила в редакцию 30.12.2021; принята к публикации 28.03.2022; опубликована 30.08.2022
Information about the authors
Elena V. MonakhovaM — D. Sci. (Biol.), chief researcher, Department of microbiology of cholera and other acute intestinal infections, Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute, monakhova_ev@antiplague.ru, https://orcid.org/0000-0002-9216-7777
Alexey S. Vodop'yanov — Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of molecular biology of natural focal and zoonotic infections, Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute, https://orcid.org/0000-0002-9056-3231
Vladimir D. Kruglikov — D. Sci. (Med.), Head, Department of microbiology of cholera and other acute intestinal infections, Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute, https://orcid.org/0000-0002-6540-2778
Nadezhda A. Selyanskaya — Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Department of microbiology of cholera and other acute intestinal infections, Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute, https://orcid.org/0000-0002-0008-4705
Ruslan V. Pisanov — Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of molecular biology of natural focal and zoonotic infections, Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute, https://orcid.org/0000-0002-7178-8021
Alexey K. Noskov — Cand. Sci. (Med.), Director, Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute, https://orcid.org/0000-0003-05502221
Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.
The article was submitted 30.12.2021; accepted for publication 28.03.2022;
published 30.08.2022
