CC BY
26
2014, Т. 4, № 1
Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»
вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме. Забор крови осуществляли на 3, 5, 7, 14 и 21 сутки после иммунизации, по 6 животных опытной и контрольной группы в каждый период исследования. Методом ИФА в сыворотке крови определяли интерлейкин-1а (IL-1a), интер-лейкин-4 (IL-4), фактор некроза опухоли (TNFa). Для определения IL использовали наборы фирмы «eBioscience» Австрия. Результаты измеряли на спектрофотометре при длине волны 480 нм. При попадании вакцинного штамма против бруцеллеза в организм лабораторных животных незначительное повышение цитокина отмечается уже с первых суток развития вакцинного процесса. К 7 суткам этот показатель повышался до 7,24+1,50 пг/мл по сравнению с контрольными значениями 4,97+0,49 пг/ мл. Наиболее высоких величин достигал к 14 суткам 44,60+5,02 пг/мл. На 21 сутки уровень IL-1a снижался до 29,34+3,22 пг/мл, однако статистически оставался еще значительно выше нормы 4,23+0,36 пг/мл (p < 0,05). При развитии иммунного ответа у мышей на вакцинный штамм B. abortus 19 BA отмечается незначительное повышение уровня IL-4 на 7 сутки 6,10+0,96 пг/мл по сравнению с контролем 2,17+0,06 пг/мл, к 14 суткам снижался до 3,44+0,82 пг/мл, а к 21 суткам уровень IL-4 достигал контрольных величин 2,73+0,25 пг/мл. Также изучение динамики синтеза TNFa выявило увеличение этого цитокина на 3 и 5 сутки после иммунизации белых мышей противобруцеллез-ной вакциной до 15,83+2,43 пг/мл и 16,78+2,76 пг/ мл соответственно по сравнению с контролем (12,98+0,82 пг/мл). К 14 суткам уровень TNFa составлял 21,00+3,24 пг/мл, а к 21 суткам соответствовал контрольным значениям 12,93+0,81 пг/мл. Таким образом, исследование выявило наибольшее увеличение IL-1 и TNFa на 14 сутки, повышение уровня IL-4 на 7 сутки.
G/[P]-ТИПЫ РОТАВИРУСА А В г. НИЖНЕМ НОВГОРОДЕ: 2012-2014 гг.
Т.А. Сашина1,2, О.В. Морозова1,2, Н.А. Новикова1,2
1ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора 2 ФГБОУ ВПО Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
К пяти годам ротавирусы (род Rotavirus, семейство Reoviridae) поражают 95% всех невакциниро-ванных детей во всем мире и являются ведущей причиной острого гастроэнтерита (ОГЭ) в этой возрастной группе. В 2012—2014 гг. на территории Нижнего Новгорода сохраняется высокий уровень заболеваемости РВГЭ, что определило необходимость объяснения сложившейся ситуации. На основе различий в нуклеотидной последовательности генов, кодирующих белки наружного капсида VP7 и VP4, определяют G-и Р-генотипы ротавируса. У человека и животных различают не менее 27 G-и 37 Р-генотипов.
Целью данной работы явилось определение G-и P-типа ротавирусов, выявленных в г. Н. Новгороде в 2012—2014 гг., и анализ их распределения. Типирование проводили методами РНК-ПААГ и ОТ-ПЦР с использованием наборов специфичных праймеров, описанных в работах Das B.K. et al. (1994),
Gentsch J.R. et al. (1992), Новикова Н.А. и др. (2007). При исследовании 1342 образцов фекалий детей, госпитализированных с первичным диагнозом ОКИ, ротавирусы были обнаружены в 263 случаях (19,6%). Доступными для молекулярно-генетической характеристики были 213 изолятов. Выявлены штаммы пяти G-генотипов (G1, G2, G4, G3 и G9) и четырех Р-генотипов (P[4], P[6], P[8] и P[9]), которые определялись в комбинациях G4P[8] (75,1%, 4 гено-варианта), G1P[8] (12,1%, 5 геновариантов), G2P[4] (4,7%, 4 геноварианта), G3P[8] (0,5%, 1 геновариант), G9P[8] (1,9%, 1 геновариант), относящихся к наиболее распространенным в мире, и редких G3P[6] (1,9%, 1 геновариант) и G3P[9] (3,8%, 1 геновариант). Среди геновариантов с преобладающей комбинацией G4P[8], в сезон 2012—2013 гг. доминирующее положение занимали штаммы с 85-м ЭФ-типом РНК (76%), в начале эпидсезона 2013—2014 гг. выявлялись преимущественно штаммы с 52-м ЭФ-типом РНК (74%). Следовательно, активная циркуляция ротавируса типа G4P[8] в изучаемый период времени поддерживалась сменой генетического варианта.
Таким образом, в период 2012—2014 гг. в Нижнем Новгороде циркулировали ротавирусы семи G/[P]-типов, доминирующее положение занимали штаммы с комбинацией G4P[8]. Полученные результаты имеют значение для разработки стратегии вакцино-профилактики РВГЭ в Нижнем Новгороде.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНТЕРОВИРУСОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ
А.В. Севостьянова1, Т.А. Гаврилова2, Т.И. Борисова1, Р.В. Адельшин1, Е.И. Андаев1
1 Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
2 Управление Роспотребнадзора по Иркутской области, г. Иркутск
В Иркутской области сезонный подъем заболеваемости энтеровирусными инфекциями (ЭВИ) обусловлен циркуляцией разных серотипов эн-теровирусов. Молекулярно-генетическим методом изучены 10 штаммов энтеровирусов, выделенных из клинического материала от больных, проживающих на территории области, и два штамма, изолированных из проб сточных вод очистных сооружений г. Иркутска. Расшифрована и проанализирована нуклеотидная последовательность фрагмента гена VP-1 энтеровирусов длиной 766 п.н. Филогенетический анализ показал, что штаммы, выделенные в Иркутской области, образуют отдельный кластер в группе энтеровирусов ECHO 6 и имеют существенное сходство (92,4—94,7%) со штаммом E-6 26035 E-burg (Екатеринбург, 2006 г.). Вирус ECHO 6 является эндемичным для региона и с 1977 г. ежегодно выделяется из объектов окружающей среды и периодически из клинического материала.
Нуклеотидные последовательности двух штаммов Коксаки В4 (КВ4), выделенные от больных в 2011 г. в г. Иркутске, оказались в одном кластере с изолятами из Белоруссии, Франции и Финляндии (2001—2005 гг.). Вирусологический мониторинг энтеровирусов показал, что циркуляция вируса КВ4 на территории Иркутской области продолжается с 2006 г.
Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»
Инфекция и иммунитет
Нуклеотидная последовательность вируса Кокса-ки В5 (КВ5) входит в кластер с изолятами из Китая, выделенными в 2009 г., идентичность составляет 95%. Филогенетический анализ позволяет предположить занос данного типа вируса из Китая.
Молекулярно-эпидемиологический мониторинг энтеровирусов, изолированных в 2011 г. в Иркутской области, позволил получить генетическую характеристику штаммов с их территориальной приуроченностью и повысить эффективность эпидемиологического анализа заболеваемости ЭВИ в регионе. Высокая частота выявления вирусов ECHO 6 показала значительную роль этого варианта в возникновении спорадической заболеваемости в 2011 г. среди населения Иркутской области.
Проведенный молекулярно-генетический анализ свидетельствует, что на территории Иркутской области циркулируют варианты энтеровирусов, как эндемичные для нашей территории (ECHO 6), так и те, происхождение которых связано с заносом из Европы и Азии в разные годы (КВ4, КВ5).
ОЦЕНКАУСТОЙЧИВОСТИ КЛЕТОЧНОЙ АССОЦИАЦИИ ESCHERICHIA COLI КХЛОРИДУ БЕНЗАЛКОНИЯ
П.В. Слукин12, В.Б. Родин1, В.А. Чугунов12, Е.В. Детушева1, Е.Н. Кобзев12
1ФБУН ГНЦприкладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область 2Пущинский государственный естественно-научный институт, г. Пущино, Московская область
В настоящее время существует значительное количество методов оценки чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (АМП). Большинство из этих методов оценивают действие АМП на планктонные (свободно живущие) клетки. В естественных условиях микроорганизмы чаще всего существуют в форме клеточных ассоциаций (КА), в том числе биопленок (БП). Поэтому в практике необходимы методы оценки действия АМП на КА микроорганизмов различных типов.
В связи с этим целью данного исследования была разработка метода оценки действия АМП на КА, пригодного для практического применения.
Суть предлагаемого метода заключается в том, что КА формируется на плотной питательной среде (ППС) без АМП, при этом возможно получение КА с требуемыми параметрами: количество клеток, поверхностная плотность микроорганизмов, возраст и даже видовой состав. Далее часть выращенной КА переносится на ППС с АМП, путем аппликации бумажным купоном. Использование аппликатора позволяет стандартизовать посевную дозу КА и избежать нарушения пространственной структуры КА. По окончании культивирования проводят визуальную оценку наличия роста микроорганизмов вокруг аппликатора, в случае отсутствия роста делается высев из его смыва на ППС без АМП. Минимальная концентрация, при которой не отмечается видимый рост, считается минимальной подавляющей концентрацией АМП. Минимальная концентрация, при которой отсутствуют микроорганизмы на аппликаторе при смыве, считается минимальной бактерицидной концентрацией АМП.
Данный метод был апробирован при оценке чувствительности КА и планктонных клеток
Escherichia coli АТСС 25922 к широко используемому в практике АМП — бензалкония хлориду (БКХ). Оценка чувствительности планктонных клеток проводилась на ППС стандартным методом (МУК 4.2.1890-04), оценка чувствительности КА — методом, описанным выше. Были подобраны условия, при которых количество и поверхностная плотность микроорганизмов для КА и планктонной формы были равны. При этом устойчивость КА E. coli к БКХ оказалась в три раза выше, чем планктонных клеток.
Таким образом, предложенный нами метод позволил выявить более высокую устойчивость ассоциации клеток E. coli к БКХ.
РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ АНАЛИЗА РОЛИ ЗАМЕН В ПРИРОДНЫХ ВАРИАНТАХ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ И ВИРУЛЕНТНОСТИ L. MONOCYTOGENES
К.А. Собянин, Р.Р. Адгамов, С.А. Ермолаева
ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ, Москва
Факультативный внутриклеточный паразит Listeria monocytogenes вызывает листериоз — сапро-нозное инфекционное заболевание человека и животных. Критическим этапом развития инфекции является активная инвазия возбудителя в нормально нефагоцитирующие эукариотические клетки, прежде всего, эпителиальные клетки и гепатоциты. Активная инвазия осуществляется за счет взаимодействия факторов патогенности L. monocytogenes, белков InlA и InlB, с поверхностными эукариотиче-скими рецепторами Е-кадхерином и фактором роста гепатоцитов Met соответственно. Е-кадхерин и Met являются консервативными белками, присутствующими у всех видов млекопитающих, хотя для этих белков наблюдается определенная межвидовая дивергенция. Бактериальные белки InlA и InlB характеризуются природными вариантами, найденными у штаммов L. monocytogenes, выделенных из разных источников. Выявленные замены могут влиять на эффективность взаимодействия InlA и InlB с эу-кариотическими рецепторами.
До настоящего времени исследований по изучению влияния замен в последовательности InlA и InlB на взаимодействие L. monocytogenes с видовыми вариантами рецепторов и, соответственно, на эффективность инвазии возбудителя в клетки разных видов млекопитающих, не проводилось.
Целью данной работы являлась разработка системы, которая позволила бы оценить различия в эффективности инвазии L. monocytogenes в эука-риотические клетки различного происхождения в зависимости от замен в последовательностях ин-терналинов. Для объективной оценки эффективности влияния аминокислотных замен в природных последовательностях inlA и inlB необходимо было получить изогенные варианты L. monocytogenes для каждого варианта. Двенадцать аллельных вариантов интерналина В, и 4 аллельных варианта интер-налина А, отличающихся аминокислотными заменами, были получены в ПЦР на матрице различных штаммов L. monocytogenes. ПЦР-продукты были клонированы в шаттл-вектор вектор pTRKH2, уже содержащий промоторную область, что позволи ло устранить эффекты от различий в уровне экспрес-
