CC BY
17МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ И ИЗОЛЯЦИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА Е ОТ КУР С СИНДРОМОМ ГЕПАТОСПЛЕНОМЕГАЛИИ В
КАЗАХСТАНЕ
Сулейменова С.А.1, Касымбеков Е.Т.2, Хан Е.Я.3, Сейдалина А.Б.4, Есентуреева М.О.5, Баймаханова Б.Б.6
1Сулейменова Сымбат Амангельдыевна - научный сотрудник;
2Касымбеков Ермухаммет Торебекович - научный сотрудник, магистр ветеринарии;
3Хан Елизавета Яковлевна - научный сотрудник, магистр ветеринарии;
4Сейдалина Айгерим Бекболатовна - научный сотрудник, магистр биологии;
5Есентуреева Меруерт Оналбековна - младщий научный сотрудник, магистр ветеринарии; 6Баймаханова Байкен Бекарыстановна - кандидат биологических наук, заместитель директора по науке,
ТОО «НПЦмикробиологии и вирусологии», г. Алматы, Республика Казахстан
Аннотация: в статье описывается случай обнаружения вируса гепатита Е (ВГЕ) в юго-восточном регионе Республики Казахстан у домашних птиц. Также инокуляция в хорион-аллантоисную оболочку (ХАО) развиваюшегося куриного эмбриона (РКЭ) с ПЦР положительными образцами позволила изолировать ВГЕ от павших кур с гепато-лиенальным синдромом.
Ключевые слова: птица, изолят, вирус гепатита Е, гепатоспленомегалия, полимеразная цепная реакция, праймер.
Введение
Вирусный гепатит Е кур (avian hepatitis E virus, aHEV) — относительно новое заболевание кур, описанное как болезнь большой печени и селезенки (big liver and spleen disease, BLS) [1] или синдром гепато-спленомегалии (hepatitis-splenomegalie-syndrom, HSS) [2]. Болезнь большой печени и селезенки впервые описана в Австралии среди родительского стада бройлерных кур в начале 1980-х [3], позже в 1991 - 1997 гг. зарегистрировано в восточной части Канады и США [4]. Клинически оно было описано как внезапное снижение яйценоскости, разрыв печени, проявление спленомегалии, гепатомегалии и повышенной смертности [3]. Вирус BLSV был выделен в конце 1990-х гг. ВГЕ представляет собой одноцепочечный с плюс-нитевой РНК. Возбудитель BLS, HSS или синдромом разрыва печени у кур, имеет генетическое и антигенное родство с ВГЕ млекопитающих [5]. К настоящему времени ВГЕ обнаружен у нескольких разных видов диких птиц - обыкновенного канюка, сизого голубя, домового сыча, певчего дрозда, а также у дикого кролика [6, 7].
В Казахстане планомерного и систематического мониторинга ВГЕ среди домашних птиц не проводилось. В настоящее время, в связи с обнаружением все возрастающей эпидемиологической активности возбудителя гепатита Е в мире, такие мониторинговые исследования являются актуальным и необходимыми.
Целью данного исследования явилось молекулярно-генетическое обнаружение и изоляция ВГЕ у кур с синдромом гепатоспленомегалии в птицеводческих хозяйствах РК.
Материалы и методы
Пробы в виде клоакальных и трахеальных смывов от домашних птиц собирали стерильным ватным тампоном с пластиковой ручкой, также внутренние органы от павших птиц помещали во флаконы со средой 199, содержащей комплекс антибиотиков (пенициллин 2000 ед/мл, стрептомицин 2 мг/мл, гентамицин 50 мкг/мл, нистатин 50 ед/мл) и бычий сывороточный альбумин (0,5%/л).
Отбор материала и вирусологические исследования проводили по общепринятым методам согласно рекомендациям Международного Эпизоотического Бюро [8].
Пробы органов и тканей гомогенизировали в криопробирках с транспортировочной средой при помощи нержавеющих стальных шариков в автоматическом высокоскоростном гомогенизаторе закрытого типа TissueLyzer II (QIAGEN).
Выделение РНК из гомогенатов органов проводили с использованием набора QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen GmbH, Hilden) в соответствии с рекомендациями производителя. РНК экстрагировали из 140 мкл клинических образцов и элюировали в окончательном объеме 60 мкл деионизированной воды.
Вирусоспецифические РНК выявляли в биопробе в одношаговой ОТ-ПЦР с применением набора Access One-Step RT-PCR Kit (Promega) согласно инструкции с использованием праймеров к консервативному фрагменту гена хеликазы ВГЕ AHEV F-1/SD, 5'-TGTTATYACACCCACCAARACGYTG-3'; Helic R-1, 5'-CCTCRTGGACCGTWATCGACCC-3'; охватывающий фрагмент в 452 пар оснований.
Реакцию проводили в термоциклере Eppendorf Gradient при следующих параметрах: обратная транскрипция при 48°С 45 мин, начальная 2 мин денатурация при 95°С и амплификация в 40 циклов,
включающая денатурацию (94°С, 60 сек), отжиг праймеров (42°С, 60 сек) и удлинение цепи (72°С, 60 сек) с последующей окончательной элонгацией при 72°С, 10 мин.
Горизонтальный гель-электрофорез проводили в 2% растворе агарозы (Sigma, США), окрашенным бромистым этидием, в трис-ацетатном буфере при напряжении 88V (8 вольт/см) на аппарате Biostep (Великобритания). Визуализацию и документирование результатов гель-электрофореза осуществляли с помощью системы GelMax® 125 Imager (Upland, CA, США).
Для изоляции HEV использовали 8-10 дневные развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ). В скорлупе делали два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отсасывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2 - 0,5 см сбоку, со стороны эмбриона.
В каждый эмбрион через боковое отверстие на поверхность ХАО инокулировали суспензию ПЦР положительного патологического материала по 200 мкл затем отверстие закрывали парафином. Инкубацию зараженных эмбрионов, проводили при 37°С, в течение 72-96 часов.
Основные результаты исследований
Летом 2020 г в одном из птицеводческих хозяйств Алматинской области обнаружено заболевание неизвестной этиологии, сопровождавшееся гибелью кур.
Печень, селезенка, желчный пузырь и фекальные мазки отобраны от пяти тушек 12 - 16-недельных кур. Эти образцы были собраны с помощью ветеринара после вскрытия трупов, и туш были исследованы на предмет клинических симптомов, связанных с HSS; увеличение печени и селезенки, серозно-геморрагическая жидкость в брюшной полости и геморрагические очаги в ткани печени.
В результате собрано 15 образцов внутренних органов в виде печени, селезенки и желчного пузыря.
В результате ОТ-ПЦР скрининга с праймерами к консервативному фрагменту гена хеликазы ВГЕ выявлено наличие нуклеиновых кислот ВГЕ в пробах больных и павших цыплят, собранных в июле 2020 г. на одной из птицефабрик Алматинской области (рисунок 1).
1.1 2.1 3.1 1.2 2.2 3.2 4.2 5.3 К+ К+ К- 14
№ 1.1-5.3 образцы РНК, полученные из внутренних органов кур, «К+» - положительный контроль/РНК вируса ВГЕ/курица/Алматы/5/2014, «К-» - отрицательный контроль, «М» - молекулярный маркер
Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-продуктов в 2% агарозном геле, РНК ВГЕ птиц охватывающий фрагмент
охватывающий 452 пар нуклеотидных оснований
Положительные на ВГЕ материалами заражали ХАО 8-10 дневных РКЭ, репродукцию вируса контролировали с помощью ПЦР после 72-96 часов инкубации. Входе анализа вирусоспецифические РНК были обнаружены в инфицированных ХАО РКЭ. В контрольные эмбрионы оказались отрицательными на наличие РНК ВГЕ. Результаты приведены на рисунке 2.
1 2 3 4 К+ К- М
-1500 -1000 -750
-452п.о -450 -250
№ 1-4 - образцы РНК полученные из ХАО, «К+» - положительный контроль РНК ВГЕ/курица/Алматы/5/2014, «К-» - отрицательный контроль, «М» - молекулярный маркер
Рис. 2. Электрофореграмма ПЦР-продуктов в 2% агарозном геле, РНК ВГЕ птиц охватывающий фрагмент 452 пар
нуклеотидных оснований
Как видно из рисунка ожидаемые продукты 452 п.н.о., соответствующие фрагменту хеликазы гена ВГЕ, присутствовали во всех пробах ХАО.
Обсуждение полученных данных и заключение
В результате молекулярных методов диагностики в 2020 г. нами были выявлены случаи ВГЕ в Алматинской области у кур с признаками HSS и BLC. В Казахстане ВГЕ впервые обнаружен в 2014 г. в пригороде Алматы у цыплят месячного возраста с типичными патологическими повреждениями при данной инфекции [9].
Ранее Спрыгин А.В. и др. за период 2009 - 2012 гг. выявили генетически высоковариабельные 14 изолятов ВГЕ, обозначенных как российские (13 - в хозяйствах РФ, один в Казахстане). Вирус выделяли не только у птицы с признаками поражения печени, но также у клинически здоровых особей [10].
В 2016 г. ВГЕ птиц возникла во многих крупных племенных хозяйствах Китая [11]. За это время более 270 000 кур из четырех ферм в китайских провинциях Гуандун, Аньхой, Хэбэй и Цзилинь были инфицированы ВГЕ птиц. Эти пораженные поголовья животных показали несколько пиков смертности в возрасте от 1 до 5 недель, от 17 до 20 недель и от 27 до 40 недель [7]. В Пакистане в 2019 г. выделили и идентифицировали два новых штамма ВГЕ из желчи кур-несушек, проявляющих клинические симптомы, связанные с HSS [12].
Репродукция ВГЕ птиц изучена недостаточно из-за отсутствия более приемлемой клеточной линии. Одними из доступных систем для изоляции вируса являются ХАО РКЭ или первичные трипсинизированные фибробласты куриных эмбрионов. В ходе проведенных исследований нам удалось выделить на ХАО РКЭ ВГЕ птиц из патологических материалов.
Таким образом, данные молекулярной детекции и инокуляция ХАО РКЭ с ПЦР положительными образцами позволили изолировать ВГЕ от павших кур с гепато-лиенальным синдромом в некоторых птицеводческих хозяйствах РК.
Список литературы
1. Payne C.J. Big liver and spleen disease. In: Diseases of poultry /Y.M. Saif, H.J. Barnes, J.R. Glisson, A.M. Fadly, L.R. McDougald, D.E. Swayne (eds.). Ames, Iowa State Press, 2005: 1184-1186.
2. Shivaprasad H.L. Hepatitis splenomegaly syndrome. In: Diseases of poultry /Y.M. Saif, H.J. Barnes, J.R. Glisson, A.M. Fadly, L.R. McDougald, D.E. Swayne (eds.). Ames, Iowa State Press, 2003: 1186-1188.
3. Handlinger J. and Williams W. An egg drop associated with splenomegaly in broiler breeders. Avian Dis. 32, 773-778.
4. Riddell C. Hepatitis-splenomegaly syndrome. Diseases of poultry. Iowa State University Press. Ames, 1041.
5. Yugo D.M., Meng X.-J. Hepatitis E virus: foodborne, waterborne and zoonotic transmission. Int. J. Environ. Res. Public Health 10, 4507-4533. doi: 10.3390/ijerph10104507.
6. ZhangX., Bilic I., Troxler S., Hess M. Evidence of genotypes 1 and 3 of avian hepatitis E virus in wild birds // Virus Res., 2017. Vol. 228. P. 75-78.
7. Liu B., Fan M., Zhang B., Chen Y., Sun Y., Du T., Nan Y., Zhou E.M., Zhao Q. Avian hepatitis E virus infection of duck, goose, and rabbit in northwest China // Emerg. Microbes Infect., 2018. Vol. 7. P. 76.
8. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals mammals, birds and bees International Office of Epizootics, Biological Standards Commission, International Office of Epizootics, International Committee. Paris, Office international des epizooties, 2008. 6th ed.
9. Сулейменова С.А., Касымбеков Е. Т., Карамендин К.О., Нуршин К.А., Жуматов К.Х., Кыдырманов А.И. Обнаружение вирусного гепатита Е птиц на юго-востоке Казахстана // Микробиология жэне вирусология, 2019. №2 (25). С. 74-81.
10. Спрыгин А.В., Никонова З.Б., Бабин Ю.Ю., Елаткин Н.П., Пискунов А.В., Ирза В.Н. Распространение и генетическая вариабельность вируса Гепатита Е на птицефабриках в странах бывшего СССР, 2014. № 6. С. 59-66.
11. Su Q., Li Y., Meng F., Cui Z., Chang S. and Zhao P. Hepatic rupture hemorrhage syndrome in chickens caused by a novel genotype avian hepatitis E virus. Vet. Microbiol. 222. 91-97. doi: 10.1016/j.vetmic.2018.06.019.
12. Iqbal T., Rashid U., IdreesM., Afroz A., Kamili S., Purdy M.A. A novel avian isolate of hepatitis E virus from Pakistan. Virol J., 2019. Nov. 21;16(1):142. doi: 10.1186/s12985-019-1247-0. PMID: 31753030.
