CC BY
9DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-33-129-136 УДК 582.28:613.5
В. В. Карманова1,3, Т. Г. Шабашова', М. Г. Синявская2, Ю. Г. Гигиняк3
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОМИЦЕТОВ СЛУЖЕБНО-ЖИЛЫХ МОДУЛЕЙ СТАНЦИЙ «ГОРА ВЕЧЕРНЯЯ» И «МИРНЫЙ» (ВОСТОЧНАЯ АНТАРКТИДА)
Институт экспериментальной ботаники имени В. Ф. Купревича НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: veronikarmanova@gmail.com 2Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 3Научно-практический центр НАН Беларуси по биоресурсам Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
В результате микологического исследования служебно-жилых модулей белорусской станции «Гора Вечерняя» и российской станции «Мирный» выявлено 9 видов микромицетов, принадлежащих к 7 родам отдела Ascomycota. Для определения видовой принадлежности применялись анатомо-морфологические и молекуляр-но-генетические методы. Большинство обнаруженных видов — это микромицеты с конидиальным спороноше-нием. Доминирующими являются виды Aspergillus niger и Orbicula parietina (первая находка для Антарктиды). Виды Geotrichum candidum, Aspergillus niger и Cladosporium cladosporioides могут представлять опасность для здоровья человека, при определенных условиях (чаще всего при сильном иммунодефиците, метаболических и гормональных нарушениях, травматических повреждениях кожи и слизистых) вызывая геотрихозы, аспер-гиллезы и феогифомикозы соответственно. Определены температурозависимые особенности роста: установлено, что большинство выделенных микромицетов являются мезофильными организмами.
Ключевые слова: антарктические микромицеты, микобиота полярных станций, станция «Гора Вечерняя», психрофилия, экстремофильные микромицеты, аллергенные микромицеты.
Введение
Антарктида представляет собой относительно свободный от антропогенной нагрузки регион. Однако в результате возрастающей человеческой деятельности на материке происходит модификация микобиоты как в окрестностях исследовательских станций, так и внутри них. Споры грибов могут попадать в служебные и жилые модули станций вместе с продуктами питания и строительными материалами. А ненадлежащие санитарные условия помещений благоприятствуют развитию привнесенных микромицетов.
Отмечается, что экстремальные антарктические условия вызывают иммунодепрессивные состояния у полярных исследователей, что может приводить к увеличению риска развития инфекционных заболеваний, аллергий и аутоиммунных расстройств. Микромицеты и их метаболиты могут вызывать микозы, а также провоцировать развитие аллергических реак-
ций. По разным оценкам, от 6 до 15% всего населения планеты сенсибилизированы к ми-кромицетам. В этой связи для улучшения качества жизни и работы человека в Антарктиде необходим контроль численности условно-патогенных, токсигенных и аллергенных грибов.
Исследования помещений арктических станций показали, что в аэромикоте наиболее часто встречаются виды Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans, Cladosporium cladosporoides, Pénicillium aurantiogriseum и P. canescens [1], а на различных материалах внутри помещений (стены, потолок, мебель) преобладают Penicillium expansum, P. brevicompactum, P. herqueri, P. purpurogenum, P. waksmanii и Cladosporium cladosporioides [2]. При этом доля условно-патогенных видов для аэромикоты составила 65% [1], а для предметов внутри помещений — 87% [2]. В другой работе изучалась микобиота помещений арктических и антарктических станций.
Было установлено преобладание таких видов, как Alternaría alternata, Aspergillus niger, Cladosporium cladosporioides, Geomyces pannorum, Penicillium aurantiogriseum, P. chrysogenum, Р. lanosum, P. spinulosum, Rhodotorula sp. [3]. Следует отметить, что исследования микобиоты полярных станций проводятся в основном в районе Арктики, в то время как микобиоте антарктических станций уделяется значительно меньше внимания.
Регулярный контроль численности и разнообразия микромицетов в служебных и жилых модулях антарктических станций необходим не только для снижения риска микогенной сенсибилизации полярников, но и для выявления закономерностей формирования микобиоты полярных помещений, а также оценки ее влияния на микобиоту материка в целом. Не ис-
ключено, что служебно-жилые модули могут быть источником распространения микромицетов за пределы исследовательских станций Антарктиды [1].
Материалы и методы
В рамках работы был выполнен микологический анализ 17 образцов пыли, изолированных из жилых модулей белорусской антарктической станции «Гора Вечерняя» (67°39'35" ю. ш., 46°09'18" в. д., оазис Холмы Тала, Земля Эндерби) (рис. 1) [2] и 5 образцов обоев из модулей российской станции «Мирный» (66°33'20" ю. ш., 93°00'11" в. д.).
Микробиологические методы идентификации грибного разнообразия включали прямой посев фрагментов субстрата на питательную среду (картофельный агар с дрожжевым экс-
Рис. 1. Расположение белорусской антарктической станции «Гора Вечерняя»
трактом) в трехкратной повторности с последующим культивированием образцов в разных температурных условиях (4 °С, 18 °С и 25 °С) [3]. Видовая принадлежность устанавливалась после изучения анатомо-морфологических особенностей выделенных штаммов с помощью микроскопа Olympus и определителей [4-9]. Методика приготовления КА с дрожжевым экстрактом: 200 г очищенных клубней картофеля кипятили в 1 л воды на протяжении 15 мин. Полученный отвар распределяли в предварительно простерилизованные кол-
бы по 250 мл. Для получения 3% среды в колбу добавляли 7,5 г агара. Дрожжевой экстракт добавляли в количестве 3 г на колбу.
Для выделения грибной ДНК использовался протокол с 5% Chelex [10].
Для проведения амплификации использовалась ПЦР-смесь следующего состава: 2 мкл грибной ДНК (50-100 нг); 7,5 мкл готовой смеси ArtMix (АртБиоТех); 5 pmol прямого прай-мера ITS1 (5' TCC GTA GGT GAA CCT GCG G '3) (Праймтех); 5 pmol мкл обратного праймера ITS4 (5' TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC '3)
(Праймтех); 3,5 мкл воды.
Амплификация проводилась в термоцикле-ре C1000 (BioRad) в объеме 15 мкл по следующему режиму: 95 °С — 2 мин (1 цикл), 40 циклов: 95 °С — 10 сек, 58 °С — 15 сек, 67 °С — 15 сек (1 цикл), 12 °С — до остановки.
Разделение продуктов амплификации проводилось в 2% агарозном геле с использованием 1хТАЕ-буфера, окрашивание бромистым этидием. Визуализация результатов электрофореза осуществлялась на приборе Gel Doc XR (BioRad).
Переочистка продуктов ПЦР для проведения сиквенсовой реакции осуществлялась с помощью экзонуклеазы I (Exo I) и рекомбинантной щелочной фосфатазы (rSAP), согласно рекомендации производителя (Thermo Fisher).
Определение последовательности ДНК проводилось по методу Сэнгера. Сиквенсовая
реакция проводилась c набором BrilliantDye Terminator v3.1 (Nimagen) по протоколу от фирмы производителя.
Подготовленный и высушенный фрагмент ДНК растворялся в формамиде и отдавался в центр «Геном» Института генетики и цитологии НАН Беларуси для секвенирования на приборе ABI 3100 Genetic Analyser. Полученные нуклеотидные последовательности анализировались с помощью программ Finch TV и Chromas, BLASTn.
Результаты и их обсуждение
В результате исследования было выделено 25 штаммов микромицетов, относящихся к 9 видам отдела Ascomycota, большинство из которых — микромицеты с конидиаль-ным спороношением (табл. 1). Выявленные микромицеты демонстрируют температуро-
Таблица 1
Видовой разнообразие микромицетов, выделенных из служебно-жилых модулей станций
«Гора Вечерняя» и «Мирный»
ID образца Микромицет Место сбора
Станция «Гора Вечерняя»
ID1 Нет роста ЦУБ, кают-компания, на музыкальном центре
ID2 Aspergillus niger Tiegh., Orbiculaparietina (Schrad.) S. Hughes* ЦУБ, прихожая, на огнетушителе
ID3 Penicillium chrysogenum Thom, Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries ЦУБ, прихожая, на коробе
ID4 Aspergillus niger Tiegh., Orbicula parietina (Schrad.) S. Hughes* ЦУБ, телефонный отсек, под книжной полкой
ID5 Aspergillus niger Tiegh., Orbicula parietina (Schrad.) S. Hughes* ЦУБ, кухонный отсек, напротив посудомойки, на планочке
ID6 Стерильный светлоокрашенный мицелий ЦУБ, телефонный отсек, на подоконнике
ID7 Penicillium citrinum Thom ЦУБ, жилой отсек, на телевизоре
ID8 Aspergillus niger Tiegh., Orbicula parietina (Schrad.) S. Hughes* ЦУБ, кают-компания, на тостере
ID9 Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries ЦУБ, кухонный отсек, на коробе
ID10 Нет роста ЦУБ, кухонный отсек, напротив посудомойки, на подоконнике
ID11 Aspergillus niger Tiegh., Orbicula parietina (Schrad.) S. Hughes* ЦУБ, инструментальный отсек, на верстаке
ID12 Geotrichum candidum Link ЦУБ, на холодильнике
ID13 Aspergillus niger Tiegh., Orbicula parietina (Schrad.) S. Hughes* ЦУБ, около входа в кают-компанию, над календарем
ID14 Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries ЦУБ, вход в жилой отсек, над дверью
Окончание таблицы 1
ID образца Микромицет Место сбора
ID15 Geotrichum candidum Link ЦУБ, на аккумуляторе
ID16 Penicillium sp. ЦУБ, на двери в кают-компанию
ID17 Aspergillus niger Tiegh., Orbicula parietina (Schrad.) S. Hughes* ЦУБ, кают-компания, на этажерке
Станция «Мирный»
ID1.0 Heydenia alpina Fresen.* Фрагменты обоев в служебном помещении станции
ID2.0 Ramularia sp.*
ID3.0 Heydenia alpina Fresen.*
ID4.0 Heydenia alpina Fresen.*
ID5.0 Heydenia alpina Fresen.*
Примечание. * — ДНК-идентификация проведена путем секвенирования по Сэнгеру
зависимые особенности роста. Подавляющее большинство обнаруженных видов грибов являются мезофильными, с температурным оптимумом 25-30 °С. Так, при культивировании в термостате (20-28 °С) наблюдается активный рост микромицетов из родов Aspergillus, Penicillium, Cladosporium и Geotrichum. При культивировании образцов при комнатной температуре и в холодильнике (3-5 °С) формируются колонии Orbicula parietina, Heydenia alpina, Ramularia sp., C. cladosporioides (рис. 2). Среди обнаруженных видов — Aspergillus niger, Geotrichum candidum и Cladosporium cladosporioides могут представлять опасность для здоровья человека. A. niger способен расти в широком диапазоне температур от 6 °С до 47 °С (оптимум 35-37 °С). На сегодняшний день A. niger не выделяется как возбудитель микозов и микоаллергозов у человека. Однако имеются данные о способности A. niger вызывать легочные инфекции (аспергиллезы) у людей с тяжелым иммунодефицитом. Также сообщалось, что в тропических регионах A. niger вызывает инфекции уха (отомикозы) при его попадании в наружный слуховой проход. Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США A. niger классифицирован как GRAS (Generally Recognized As Safe) [12].
Geotrichum candidum представляет собой сапрофитные дрожжи, колонизирующие кожу, дыхательные пути и пищеварительный тракт человека. Данный вид растет при температурах от 5 до 38 °С (оптимум 25 °С). G. candidum
способен вызывать оппортунистические микозы (геотрихозы) у людей с ослабленным иммунитетом [13].
Cladosporium cladosporioides — это космо-политный, сапрофитный вид, наиболее часто выделяемый из почвы, воздуха и растительного материала. С. cladosporioides растет в широком диапазоне температур (от -5 до +35-37 °С) с оптимумом 18-28 °С. Способен вызывать оппортунистические микозы (фео-гифомикозы). Феогифомикозы — это микозы, вызываемые темнопигментированными ми-кромицетами (РЫаЬр^га, Cladophialophora, ЕхорМа1а). Однако данный вид, как А. niger и G. Candidum, представляет опасность только для лиц с ослабленным иммунитетом или тяжелым иммунодефицитом.
Особый интерес представляет вид ОгЫсиШ рапеИпа — это сумчатый сапрофитный космо-политный вид, обнаруживаемый на различных субстратах природного (почва, растения) и промышленного (пластик, бетон, бумага) происхождения. Долгое время вид О. рапеИпа занимал неопределенное положение в отделе Ascomycota, так как он имеет очень тонкие, быстро исчезающие сумки (аски) (рис. 3), которые долгое время не удавалось обнаружить. В 2005 году был проведен молекулярный анализ SSU и LSU рДНК, показавший, что О. рапеПпа относится к семейству Ругепота1асеае (порядок Pezizales) [14]. Согласно литературным данным, О. рапеПпа относится к психрофильным микромицетам, что подтверждается в нашем исследовании, поскольку данный гриб растет
№4 4°С 18"С 25 "С
7 дней Роста нет Роста нет
10 дней •
14 дней Шжш
Orbicula parietina Orbicula parietina Aspergillus niger
Рис. 2. Культивирование микромицетов, выделенных из пробы пыли ГО4, в разных температурных условиях
Рис. 3. 8-споровые аски Orbicula parietina
в диапазоне температур от 4 °С до 18 °С, вместе с этим наиболее интенсивное образование колоний наблюдается, когда культивирование происходит при более низких температурах. Данный штамм был впервые выделен для микофлоры Антарктиды.
В результате молекулярно-генетического анализа из культурального образца была получена нуклеотидная последовательность, которая на 100% идентична ITS-району гриба Orbicula parietina (MH855303.1) из Blast (рис. 4) [11].
Score 626 bits[447)
Query 1
Sbjct 471
Query 61
Sbjct 411
Query 121
Sbjct 331
Query 1S1
Sbjct 291
Query 241
Sbjct 231
Query ЗЭ1
Sbjct 171
Query 361
Sbjct 111
Query 421
Sbjct 51
Expect Identities Gaps Strand _447/447(100%] _0/447(0%)__Plus/Minus
TCGC CATT GAATTTCGAAGAGGATT CCAATAAATTGGCTTC C ATCTCC AAGACCAAGCAA 60
Mill II III I I llllllllllllllllllll I I III I I I I I
TCGC CATT GAATTTC GAAGAG GATT CCAATAAATTGGCTTC C ATCTC C AAGACCAAGCAA 412 TAGG TAAACCTAAGCTTGAGTGATT TTAATGACGCTCGAAC AGGCATGCC TC CCGGAATA 12 0
IIMMIIIII I I III III llllll MINI I III I I I I I I I I I
TAGG TAAACC TAAGC TTGAGTGATT TTAATGACGC TCGAACAGGCATGCC TC CCGGAATA 352
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
CCAGGAGG CGCAATGTGCG TTCAAAGATTCGATGATTCAC TGAATTCTGCAATTCACACT 292
lllllllllll lllllll I I Mill II
AC TTAT CG С ATTTCGС TGC GTTCTT CATC GATGCGAGAAC С AAG AG АТС С GTTG TTGAAA 232
I I I III I III II II II II III I II II I I
GTTTTAAAGTTTATGTATAAAC AATATTCAGACAAAATTCAAAAAAAAC AGAGTTTATAA 17 2
Mil I I I III llllllllllllllllllllll I I III lllllll
TTAC CTCC CGTGAGCAC ТССС СAACAG CTGTTCCTAAAAACAGCGCCAGAGGGAAC TTGC 112
lllllllllll Mill Mill I I I III lllllllllllllllllll
GT TCACAGTCTC AC GAAAGС AACAGGTAGAAATACGCAGATTGG GTTTAC AGAAGATTAA 3 2
Mil I III I lllllll
TTCTATATTTTTTAATGATCCTTCCGC 25
Рис. 4. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей неизвестного культурального образца
и образца MH855303.1 (Orbinaparietina) из Blast
Заключение В микобиоте станции «Гора Вечерняя» при-
С помощью анатомо-морфологических сутствуют условно-патогенные и токсигенные
и молекулярно-генетических методов выяв- виды. Geotrichum candidum, Aspergillus niger
лено 9 видов микромицетов из 7 родов отдела и Cladosporium cladosporioides могут пред-
Ascomycota. Большинство обнаруженных ставлять опасность для людей с ослабленным
видов — это анаморфы сумчатой стадии иммунитетом, вызывая геотрихозы, аспергил-
микромицетов отдела Ascomycota. Следует лезы и феогифомикозы соответственно [15].
отметить, что микобиота служебно-жилых Вид Orbicula parietina (Schrad.) S. Hughes
модулей формируется в основном за счет впервые отмечен для Антарктиды. космополитных инвазивных видов, связанных
с человеческой деятельностью. В результате Список использованных источников
микологического анализа было выявлено, 1. Кирцидели, И. Ю. Почвообитающие
что в служебно-жилых модулях станции микроскопические грибы в экосистемах
«Гора Вечерняя» преобладают мезофильные Арктики и Антарктики: дис. ... докт. биол.
микромицеты, растущие в диапазоне от наук: 03.02.12 / И. Ю. Кирцидели. - СПб,
5-10 °С до 38 °С (оптимум 25-30 °С). Исклю- 2019. - 459 с.
чение составляют виды O. parietina, Heydenia 2. Власов, Д. Ю., Тешебаев, Ш. Б., Зе-
alpina и Ramulariasp., формирующие колонии ленская, М. С. Микологическое поражение
при 5-18 °С. материалов в помещениях как фактор риска
для здоровья полярников / Д. Ю. Власов, Ш. Б. Тешебаев, М. С. Зеленская, И. Ю. Кир-цидели, Ю. В. Рябушева // Гигиена и санитария. - 2019. - Т. 98. - № 1. - С. 17-21.
3. Кирцидели, И. Ю., Власов, Д. Ю., Баран-цевич, Е. П. Микроскопические грибы в воздушной среде Арктических и Антарктических станций / И. Ю. Кирцидели, Д. Ю. Власов, Е. П. Баранцевич // Успехи медицинской микологии. - 2014. - Т. 13. - С. 59-61.
4. Билай, В. И. Методы экспериментальной микологии: справочник / В. И. Билай [и др.]; под общ. ред. В. И. Билай - Киев: Навукова думка, 1982. - 233 с.
5. Билай, В. И, Курбацкая, З. А. Определитель токсинообразующих грибов / В. И. Билай, З. А. Курбацкая - Киев: Навукова думка, 1990. - 236 с.
6. Билай, В. И., Коваль, Э. З. Аспергиллы / В. И. Билай, Э. З. Коваль - Киев: Наукова думка, 1988. - 204 с.
7. Литвинов, М. А. Определитель микроскопических почвенных грибов / М. А. Литвинов - Л.: Наука, 1967. - 303 с.
8. Domsch, K. H., Gams, W., Anderson, T.-H. Compendium of soil fungi 2nd ed. / K. H. Domsch, W. Gams, T.-H. Anderson. - Germany: IHW-Ver-lag Eching, 2007. - 672 p.
9. Search Index Fungorum [Electronic resource] / Index Fungorum.org / - Mode of access:
http://www.indexfungorum.org/names/Names. asp. - Date of access: 16.08.2022.
10. Hirata, T., Takamatsu, S. Nucleotide diversity of rDNA internal transcribed spacers extracted from conidia and cleistothecia of several powdery mildew fungi / T. Hirata, S. Takamatsu // Mycoscience. - 1996. - Vol. 37. - № 3. -P. 283-288.
11. BLAST [Electronic resource]. National Center for Biotechnology Information. Mode of access: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ - Date of access: 16.08.22.
12. Schuster, E. S. On the safety of Aspergillus niger - A review / E. S. Schuster // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2002. -Vol. 59. - P. 426-435.
13. Eliskases-Lencher, F. Yeasts and molds. Geotrichum candidum / F. Eliskases-Lencher [et al.] // Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition). - 2011. - Vol. 2. - P. 1 229-1 234.
14. Galan, R., Oltra, M. Orbicula parietina (Pezizales) un curioso ascomicete con apariencia de mixomicete / R. Galan, M. Oltra // Bol. Soc. Micol. - 2011. - Vol. 35. - P. 17-23.
15. Леонтьев, Д. В. Медицинская микология с основами микотоксикологии. Учебник для высших учебных заведений / Д. В. Леонтьев [и др.]; под ред. Д. В. Леонтьева - Харьков: Запорожский Национальный Медицинский университет, 2010. - 142 с.
V. V. Karmanova1,3, T. G. Shabashova1, M. G. Sinyavskaya2, Yu. G. Giginyak3
MOLECULAR BIOLOGICAL STUDY OF MICROMYCETES AT SERVICE AND LIVING MODULES OF THE STATIONS "MOUNT VECHERNYAYA"
AND "MIRNY" (EAST ANTARCTICA)
1V. F. Kuprevich Institute of Experimental Botany of the National Academy of Sciences of Belarus 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: veronikarmanova@gmail.com 2Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus 3Scientific and Practical Center of the National Academy of Sciences of Belarus for Bioresources 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus
As a result of the mycological study of the service and living modules of the Belarusian station "Mount Vechernyaya" and the Russian station "Mirny", 9 species of micromycetes were identified, belonging to 7 genera of the Ascomycota phylum. To determine the affiliation of species, anatomo-morphological and molecular genetic methods were used. Most of the found species are micromycetes with conidial sporulation. The dominant species are Aspergillus niger and Orbicula parietina (the first find for Antarctica). The species Geotrichum candidum, Aspergillus niger and Cladosporium cladosporioides can pose a danger to human health under certain conditions (most often with severe immunodeficiency, metabolic and hormonal disorders, traumatic injuries of the skin and mucous membranes), causing geotrichosis, aspergillosis and pheogyphomycosis respectively. The temperature-dependent features of growth were determined: it was found that most of the isolated micromycetes are mesophilic organisms.
Keywords: antarctic micromycetes, mycobiota of polar stations, Mount Vechernyaya station, psychrophilia, extremophilic micromycetes, allergenic micromycetes.
Дата поступления в редакцию: 06 сентября 2022 г.
