CC BY
25
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОСТЕОПОРОЗА: II. Статины и формирование кости
Г.Я. ШВАРЦ
ООО Институт прикладной фармакологии, г. Москва
А щ Современные исследования, направленные на g € изучение молекулярных механизмов формирова-Щ1 ния кости, касаются, прежде всего, вопросов ме-11 стной регуляции функций костьобразующих клеток - остеобластов (ОБ).
Важную роль в этой регуляции играют так называемые факторы роста, к числу которых относятся инсули-ноподобные факторы роста (ИПФР-I и ИПФР-II), факторы роста из фибробластов (ФРФ-1 и ФРФ-2), а также трансформирующие факторы роста - р (ТФРр), включающие и группу костных морфогенетических белков (КМБ) [29]. Эта последняя из перечисленных групп факторов роста представлена 6 индивидуальными белками (от КМБ-2 до КМБ-7 соответственно), обладающими способностью стимулировать органогенез скелета, по-стнатальный рост и формирование костей, рост хряща и других видов соединительной ткани, активировать костьформирующую активность ОБ [29]. В этой связи ведутся как исследования по созданию лекарственных средств на основе рекомбинантного КМБ-2 человека [17,18], так и поиск экзогенных активаторов (стимуляторов) биосинтеза КМБ, способных повышать костеоб-разование при остеопорозе.
В последнее время было установлено, что подобными свойствами обладают вещества, являющиеся ингибиторами фермента гидроксиметилглютарил коэнзим А-редуктазы (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A-reductase, HMG-CoA-reductase, ГМГ-КоА-редуктаза), объединяемые общим названием статины - вещества, в течение последних двух десятилетий широко применяемые в кардиологии из-за способности оказывать анти-атеросклеротический эффект за счет нормализующего влияния на липидный обмен и состояние сосудистой стенки [1, 6 и др.].
Установление способности ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы стимулировать формирование кости in vitro и in vivo связано с работами группы исследователей из отдела эндокринологии Техасского университета под руководством G. Mundy [5,15]. Как было установлено, указанные эффекты статинов реализуются за счет повышения экспрессии гена КМБ-2 в клетках кости.
Факторы роста включены в костный матрикс и высвобождаются в процессе разрушения последнего в рамках процесса резорбции. Они принимают участие в регуляции практически всех реакций костного ремодели-рования, и особенно в процессе формирования новой кости [14]. В частности, факторы роста вызыва-
ют усиление апоптоза остеокластов (ОК) и хемотаксис предшественников ОБ к местам костной резорбции, стимулируют пролиферацию последних, что сопровождается увеличением популяции зрелых ОБ, способных осуществлять нормальное костеобразование. В отличие от других факторов роста, КМБ осуществляют диффе-ренцировку ОБ, включая стимуляцию экспрессии ими структурных белков кости, таких, как коллаген I типа, и последующую минерализацию костного матрикса. Наибольшей костьформирующей активностью обладает КМБ-2. В этой связи был изучен промоутер гена КМБ-2, который в дальнейшем использовали в качестве мишени для оценки новых соединений, способных стимулировать его транскрипцию и соответственно диффе-ренцировку ОБ. В результате исследований, проведенных с использованием трансгенных мышей с внедренным промоутером КМБ-2, было установлено, что способностью стимулировать транскрипцию последнего обладает ингибитор ГМГ-КоА- редуктазы - ловастатин. Подобные свойства были обнаружены и у других ста-тинов (симвастатина, мевастатина, аторвастатина и др.). Исключение составил правастатин, не оказывающий влияния на активность промоутера КМБ-2 [5].
Прежде чем перейти к анализу данных, касающихся механизмов действия статинов на кость, необходимо охарактеризовать биологическую роль ГМГ-КоА-редуктазы в цикле мевалоновой кислоты - одном из ключевых путей метаболизма (см. схему), конечным продуктом которого является холестерин - вещество, относящееся к классу липидов и являющееся основным компонентом мембран ряда типов клеток, липопротеинов плазмы крови, а также химическим предшественником желчных кислот и стероидных гормонов (глюкокортикоидных, половых, Б-гормона и др.). ГМГ-КоА-редуктаза представляет собой фермент, катализирующий реакцию превращения ГМГ-КоА в мевалоновую кислоту (мевалонат) (см. рис.)
Скорость - лимитирующая стадия данного цикла -образование мевалоната, реакция, катализируемая ГМГ-КоА-редуктазой, активность которой тормозится природными ингибиторами - холестерином и самим мева-лонатом, а также синтетическими веществами, наиболее активными из которых являются статины. Образование и дальнейшие превращения мевалоновой кислоты осуществляются в большинстве клеток организма, в том числе и в клетках кости. При этом некоторые промежуточные продукты цикла мевалоновой кислоты оказывают влияние на состояние и функции как ОК, так и
Р-Гидрокси-Р-метилглютарил-КоА
^ М— ГМГ-КоА-редуктаза
Мевалоновая к-та ^^
I
Амино-БФ
Изопентенил-пирофосфат
Геранил-пирофосфат Фарнезил-пирофосфат
СТАТИНЫ
\
Геранил-геранил-пирофосфат Сквален
/
Геранил-геранили- ▼ ▼
рованные белки Каротиноиды Холестерин
Основные звенья цикла мевалоновой кислоты и точки приложения действия статинов и аминосодержащих бисфосфонатов (амино-БФ).
Обозначения: прерывистые линии - сокращенный цикл превращений
ОБ. В частности показано, что ряд белков клеток кости подвергаются посттрансляционному пренилированию с фарнезилом и геранилизопреноидами (т.е. модификации липидных молекул, включающей ковалентное связывание фарнезилированных или геранил-геранилиро-ванных изопреноидов с остатками цистеина в С-конце-вой области белковых молекул), что позволяет им участвовать в формировании клеточной мембраны [30]. Большинство указанных белков, включая белок Ras (семейство G-белков), в пренилированном состоянии играют важную роль в функционировании ОК, поддержании их активности и прикреплении к кости в местах резорбции. Среди внутриклеточных эфиров фосфорной кислоты особенно важны фарнезилпирофосфат (ФПФ) и геранил-геранил-пирофосфат (ГГПФ), которые участвуют в осуществлении везикулярного транспорта, образовании и формировании цитоскелета ОК и их ре-зорбирующей активности [3].
Тормозящее воздействие на ферменты, участвующие в биосинтезе ФПФ и ГГПФ (фарнезилдифосфат синте-тазы, пренил-протеин трансферазы), оказывают амино-содержащие бисфосфонаты (амино-БФ), такие, как ален-дронат, ибандронат и ризедронат, тогда как не содержащий аминогруппы клодронат подобными свойствами не обладает [11, 22, 23]. Как было показано, в экспериментах in vitro на культуре ОК и мышиных макрофагах линии J774 указанные аминосодержащие БФ ингибируют посттрансляционную модификацию (пренилирование) белков, включая ГТФ-ассоциированный белок Ras, с ФПГ и ГГПФ и тормозят образование ОК. Более того, вызываемый алендронатом апоптоз клеток J774 инги-бировался добавлением в культуральную среду ФПФ или ГГПФ. Таким образом, тормозящее воздействие на биосинтез фарнезила и геранилизопреноидов и, соответственно, на посттрансляционное пренилирование та-
ких белков, как Ras, играет роль в механизме антире-зорбтивного действия (включая образование ОК и стимуляцию их апоптоза) аминосодержащих БФ. Статины, например, использованный в упомянутой выше работе [11] мевастатин, также вызывают апоптоз ОК и клеток J774, а добавление ФПФ и ГГПФ устраняет указанный эффект. Однако, в отличие от аминосодержащих БФ, мевастатин не тормозит активность ферментов-синте-таз изопреноидов, а является ингибитором другого фермента в цикле мевалоновой кислоты - ГМГ-КоА-редук-тазы. В пользу таких представлений свидетельствуют и данные другого исследования, проведенного на эксплан-тах длинных костей плодов мышей - экспериментальной модели для оценки действия БФ in vivo [23]. В этом исследовании мевастатин ингибировал резорбцию кости в концентрациях, сходных с одним из активных современных аминосодержащих БФ - ибандронатом. Указанный эффект полностью устранялся добавлением мевалоновой кислоты и ГГПФ, но не ФПФ. Кроме того, мевалоновая кислота и ГГПФ стимулировали базальную костную резорбцию, тогда как фарнезол таких свойств не проявлял. Было показано также, что подтвержденный цитологически антирезорбтивный эффект ибанд-роната полностью устраняется ГГПФ и лишь в незначительной степени мевалонатом и фарнезолом, что указывает на различные точки действия БФ и мевастатина в цикле мевалоновой кислоты. В этом исследовании был сделан вывод о том, что геранил-генералирование белков (но не фарнезилирование) является важным механизмом резорбирующего действия ОК, а в механизме антирезорбтивного действия аминосодержащих БФ имеется компонент, связанный с влиянием на образование ГГПФ. Кроме того, как показано недавно, сходное по строению с ГГПФ ациклическое синтетическое соединение - геранил-гераниловая кислота (ГГК), рассматриваемая как представитель ациклических ретиноидов, в опытах in vitro на кокультуре клеток костного мозга мышей и первичных ОБ тормозила пролиферацию клеток линии МС3Т3-Е1, а также усиливала дифференци-ровку ОБ, о чем свидетельствовало повышение уровней таких маркеров этого процесса, как щелочная фос-фатаза и мРНК остеопонтина [26]. Кроме того, в этих экспериментах ГГК ингибировала образование ОК, вызываемое добавлением в кокультуру клеток 1,25(ОН)2Б3. Воздействие ГГК на стромальные клетки линии ST2 восстанавливало вызываемое 1,25(ОН)2Б3 и простагланди-ном Е2 торможение экспрессии мРНК остеопротегери-на. ГГК, кроме того, ингибировала образование ОК, активированное М-КСФ и RANKL в культуре макрофа-гальных клеток костного мозга. И, наконец, в опытах in vivo ГГА повышала МПКТ бедренной кости у быстро-стареющих мышей линии SAMP6.
Представленные данные, касающиеся участия продуктов цикла мевалоновой кислоты и близких к ним соединений в образовании и функционировании клеток кости, а также в механизме действия аминосодержащих БФ, свидетельствуют о том, что торможение образова-
ния мевалоната уменьшает образование ОК и снижает их резорбирующую активность.
В ходе экспериментальных исследований по оценке влияния статинов на кость был сделан ряд важных наблюдений [5, 20]. Первое из них касается собственно способности этой группы препаратов вызывать увеличение формирования кости на культуре костной ткани свода черепа новорожденных мышей. Было показано, что 24-часовая инкубация указанной культуры с ловас-татином, аторвастатином, флувастатином (концентрация 1 |M) и особенно с церивастатином (концентрация 0,06 |lM) вызывала отчетливое накопление ОБ и рост кости в период последующих 4-14 дней наблюдения. Единственным препаратом из исследованной группы статинов, не оказывающим влияния на кость в этих опытах, был правастатин. Изучение причин указанного явления позволило установить, что пра-вастатин, в отличие от других статинов, не проникает в клетки кости (едиственным типом клеток, в которые он проникает, являются гепатоциты). Было установлено также, что стимулирующие костеобра-зование статины в клетках кости, как и в клетках других тканей, подвергаются внутриклеточному метаболизму с участием эстераз с превращением в форму соответствующих р-гидроксикислот, которые и обладают способностью ингибировать ГМГ-КоА-редуктазу [5]. В экспериментах in vivo на взрослых нормальных мышах введение статинов в область черепного свода (1 раз в день в течение 5 дней) вызывало к 5 дню наблюдения увеличение на 3050% массы этой кости, без заметных изменений в других частях скелета. Особый интерес представляют данные, свидетельствующие о том, что введение внутрь ловастатина (10 мг/кг/дн) и церивастатина (0,1 мг/кг/дн) в течение 35 дней овариоэктомирован-ным крысам (модель постменопаузального остеопо-роза (ОП) ) вызывало статистически достоверное увеличение массы кости на 38% и 43% соответственно и её адекватную минерализацию. Сходные данные были получены и в другом исследовании на указанной модели при использовании церивастатина, введение которого в течение 6 недель сопровождалось увеличением минеральной плотности костной ткани (МПТК), скорости образования новой кости, экспрессии мРНК остеокальцина, а также повышением прочности костей и их устойчивости к переломам [28]. Применение симвастатина в течение 3 месяцев сопровождалось повышением прочности позвонков взрослых крыс [16]. Таким образом, было показано анаболическое действие статинов на кость как in vitro, так и in vivo, в том числе на модели эст-рогендефицитного ОП. Показано также, что in vitro це-ривастатин ингибирует костную резорбцию, стимулированную ПТГ [20]. Однако в работе Staal et al. [20]., наряду с подтверждением тормозящего влияния стати-нов на костную резорбцию in vitro, не было отмечено достоверного защитного действия церивастатина на
модели остеопороза у крыс, вызванного тиро-парати-реоидэктомией. По-видимому, патогенез экспериментального ОП у крыс, вызываемого овариоэктомией и ти-ропаратиреоидэктомией, имеет существенные различия.
Имеется три группы фактов, касающихся механизмов, лежащих в основе анаболического действия стати-нов на кость.
Первая из них связана с уже отмеченной способностью этих препаратов стимулировать транскрипцию гена КМБ-2. Указанный механизм был показан in vitro с использованием культуры клеток остеобластической линии из костей черепного свода, полученных от трансгенных мышей. Кроме того, на культуре остеобласти-ческих клеток человека линии MG63 ловастатин и особенно симвастатин в концентрациях 2-5 mM при 24-часовой инкубации повышали в 2-4 раза уровень внутриклеточной экспрессии мРНК КМБ-2, не оказывая в то же время заметного влияния на образование мРНК другого КМБ - КМБ-4 [5].
Другая группа фактов связана с влиянием статинов на метаболизм мевалоновой кислоты. Показано, что стимулирование ими костеобразования in vitro четко коррелирует с выраженностью ингибирующего влияния на активность ГМГ-КоА-редуктазы [20]. В исследовании на культуре костей черепного свода новорожденных мышей добавление мавалоната, ФПФ или ГГПФ инги-бировало стимулирующий костеобразование эффект статинов, что указывает на то, что данный эффект является результатом торможения одного или более звеньев цикла мевалоновой кислоты этими ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы [5]. Более того, в связи с тем, что ГГПФ извращает этот эффект, ингибирование пренилирования за счет геранил-геранилирования должно играть ведущую роль в стимулировании костеобразования стати-нами. Имеется ряд белков, использующих для активации эту форму пренилирования. К таким белкам относятся ГТФазы, такие, как Rho, Rac и Rap. Данные белки играют важную роль в пролиферации и дифференци-ровке клеток, и различные изменения в их состоянии оказывают влияние на активность соответствующих клеток и тканей. Исходя из этого, влияние статинов на пренилирование белков рассматривают как основу ряда их вторичных эффектов [12, 21, 27].
Указанный механизм имеет непосредственное отношение к третьей группе механизмов костьформирую-щего действия статинов - влиянию на активность фермента NO-синтетазы. Как было показано, в эндотели-альных клетках статины (ловастатин и симвастатин) за счет ингибирования пренилирования белка Rho ГТФазы повышают активность NO-синтетазы и соответственно образования оксида азота (NO) [9, 10], который способствует костеобразованию как в эксперименте, так и при постменопаузальном ОП [7, 8]. Как показано Mundy et al. [15], усиление костеобразования у мышей под влиянием статинов сопровождается одновременным повышением в остеобластах экспрессии как мРНК NO синтетазы, так и мРНК КМГ-2,
развивающейся к 6 часу после действия препаратов и прекращающейся до 24 часов наблюдения. Сходные наблюдения были сделаны и в культуре остеобластичес-ких клеток человека линии MG63 [5].
Хотя не все стороны механизма действия статинов на кость достаточно ясны, эта группа препаратов представляет несомненный интерес с точки зрения анаболической терапии ОП. В пользу этого свидетельствует ряд клинических данных о положительном действиии статинов на состояние костей у пациентов с ОП. Так, в исследовании [4] было зарегистрировано 7-8%-ное повышение МПКТ в позвонках и шейке бедренной кости у женщин в постменопаузе, принимавших статины, по сравнению с пациентками, не проводившими данную терапию. При анализе историй болезни 91 611 пожилых пациентов, из которых 28 340 в момент исследования принимали липидпонижающие средства из группы статинов, а 3940 имели переломы различной локализации, было обнаружено значительное снижение риска новых переломов в группе получавших указанные препараты [13]. Подобная зависимость в группе пожилых женщин, получавших статины в течение 2 лет, отмечена и в работе [2]. Отчетливое снижение риска переломов шейки бедренной кости (на 71%) зарегистрировано в группе из 6110 лиц старше 65 лет, принимавших статины в течение 3 лет [25]. Важно отметить, что подобного эффекта не установлено при использовании ли-пидпонижающих средств нестатиновой структуры. В то же время имеются клинические наблюдения, не подтверждающие положительное влияние статинов на состояние скелета [19, 24].
Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что воздействие на разные этапы цикла мевалоновой кислоты способно как тормозить костную резорбцию, так и стимулировать костеобразова-ние. Указанные механизмы позволяют более полно охарактеризовать молекулярные основы антирезорбтив-ного эффекта амино-БФ и открывают возможности создания нового поколения лекарственных средств преимущественно анаболической направленности действия (например, статинов), способных повышать ко-стеобразование при ОП.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шварц Г.Я. Современное состояние лекарственной терапии атеросклероза // Хим.-фарм. журн. 1990. № 8. С. 13-22.
2. Chan K.A., Andrade S.E., Boles M. et al. Inhibitors of hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A reductase and risk of fracture among older women // Lancet. 2000. V. 355. P. 2185-2188.
3. Coxon F.P., Helfrich M.H., Van't Hof R. et al. Protein geranylgenylation is required for osteoclast formation, function, and survival: Inhibition by bisphosphonates and GGTI-298 // J/Bone Miner.Res. 2000. V. 15. P. 1467-1476.
4. Edwards C.J., Hart D.J., Spector T.D. Oral statins and increased bone mineral density in postmenopausal women // Lancet. 2000. V. 355. P. 2218-2219.
5. Garrett I.R., Gutierrez, Mundy G.R. Statins and bone formation / / Curr. Pharm. Design. 2001. V. 7. P. 715-736.
6. Hilleman D.E., Phillips J.O., Mohiuddin S.M. et al. A population based treat-to-target pharmacoeconomic analysis of HMG-CoA reductase inhibitors in hypercholesterolemia // Clin. Ther. 1999. V. 21. P. 536562.
7. Jamal S.A., Browner W.S., Bauer D.C., Cummings S.R. Intermittent use of nitrates increases bone mineral density: the study of osteopororic fractures // J.Bone Miner.Res. 1998. V. 13. P. 1755-1759.
8. Koyama A., Otsuka E., Inouse A. et al. Nitric oxide accelerates the ascorbic acid-induced osteoblastic differentiation of mouse stromal ST2 cells by stimulating the production of prostaglandin E(2) // Eur. J. Pharmacol. 2000. V. 391. P. 225-231.
9. Laufs U., La Fata V., Liao J.K. Inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaril (HMG)-CoA reductase blocks hypoxia-mediated down-regulation of endothelial nitric oxide synthase // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 31725-31729.
10. Laufs U., Liao J.K. Post-transcriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase mRNA stability by Rho GTPase // J. Biol. Chem.
1998. V. 273. P. 24266-24271.
11. Luckman S.P., Hughes D.E., Coxon F.P. et al. Nitrogen-containing bisphosphonates inhibit the mevalonate pathway and prevent post-translational prenylation of GNP-binding proteins, including Ras // J. Bone Miner. Res. 1998. V. 13. P. 581-589.
12. Masamura K., Oida K., Kanehara H. et al. Pitavastatin-induced thrombomodulin expression by endothelial cells acts via inhibition of small G proteins of the Rho family // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2003. V. 23. P. 512-517.
13. Meier C.R., Schlienger R.G., Kraenzlin M.E. et al. HMG-CoA-reductase inhibitors and the risk of fractures // JAMA. 2000. V. 283. P. 3205-3210.
14. Mundy G.R. Osteoblast function and the mechanism of action of bone-forming agents. In:Osteoporosis'96., Elsevier., Amsterdam., S.E. Papapoulos et al., eds.,1996. P. 17-28.
15. Mundy G., Garrett R., Harris S. et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins // Science. 1999. V. 286. P. 1946-1949.
16. Oxlund H., Andreassen T.T. Simvastatin given per orally to adult rats increases the compressive strength of vertebral bodies // J. Bone Miner. Res. 2000. V. 15, Suppl. 1. S. 549.
17. Saito N., Okada T., Horiuchi H. et al. Local bone formation by injection of recombinant human bone morphogenetic protein-2 constained in polymer carriers // Bone. 2003. V. 32. P. 381-386.
18. Schmidmaier G., Wildemann B., Cromme F. et al. Bone morphogenetic protein-2 coating of titanium implants increases biomechanical strength and accelerates bone remodeling in fracture treatment: a biomechanical and histological study in rats //Bone. 2002. V. 30. P. 816-822.
19. Sirola J., Sirola J., Honnkanen R. et al. Relation of statin use and bone loss: a prospective population-based cohort study in early postmenipausal women // Osteoporosis Int. 2002. V. 13. P. 537-541.
20. Staal A., Frith J.C., French M.H. et al. The ability of statins to inhibit bone resorbtion is directly related to their inhibitory effect on HMG-CoA Reductase activity // J. Bone Miner. Res. 2003. V. 18. P. 88-96.
21. Takemoto M., Liao J.K. Pleiotropic effects of 3-hydroxy-3-methylglutaril (HMG)-Coenzyme A reductase inhibitors. 2001. V. 21. P. 1712-1719.
22. Van Beek E., Lowik C., Van der Pluijm G., Papapoulos S. The role of geranylgeranylation in bone resorption and its suppression by bisphosphonates in fetal bone explants in vitro: A clue to the mechanism of action of nitrogen-containing bisphosphonates // J. Bone Miner. Res.
1999. V. 14. P. 722-729.
23. Van Beek E., Pieterman E., Cohen L. et al. Farnesyl pyrophosphate synthase is the molecular target of nitrogen-containing bisphosphonates // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 264. P. 108-111.
24. Van Staa T.P., Wegman S., de Vries et al. Use of statins and risk of fractures // JAMA. 2001. V. 285. P. 1850-1855.
25. Wang P.S., Solomon D.H., Mogun H., Avorn J. HMG-CoA-reductase inhibitors and the risk of hip fractures in elderly patients // JAMA. 2000. V. 283. P. 3211-2116.
26. Wang X., Wu J., Shidoji Y. et al. Effect of geranylgeranoic acid in bone: induction of osteoblast differentiation and inhibition of osteoclast formation // J. Bone Miner. Res. 2002. V. 17. P. 91-100.
27. Wassmann S., Laufs U., Baumer A.T. et al. Inhibition of geranylgeranylisation reduces angiotensine II-mediated free radical production in vascular smooth muscle cells:Involvement of angiotensine AT1 receptor expression and Rac1 GTPase // Mol. Pharmacol. 2001. V. 59. P. 646-654.
28. Wilkie D., Bowman B., Lyga A. et al. Cerivastatin increases cortical bone formation in OVX rats // J. Bone Miner. Res. 2000. V. 15, Suppl.1. S. 549.
29. Wozney J.M., Rosen V. Bone morphogenetic protein and morphogenetic protein gene family in bone formation and repair // Clin. Orthop. 1998. V. 346. P. 26-37.
30. Zhang F.L., Casey P.J. Protein prenylation: Molecular mechanisms and functional consequences // Annu. Rev. Biochem. 1996. 65. P. 241-269.
