CC BY
40
RegiiLatGry Mechanisms
in Biosystems
Regulatory Mechanisms
in Biosystems
ISSN 2519-8521 (Print) ISSN 2520-2588 (Online) Regul. Mech. Biosyst., 8(2), 259-264 doi: 10.15421/021740
Molecular mechanisms of metabolic disorders in the organs of rats
of different ages affected by sodium nitrite in the context of tobacco intoxication
P. H. Lyhatskyi, L. S. Fira, D. B. Fira, I. P. Kuzmak
I. Horbachevsky Ternopil State Medical University, Ternopil, Ukraine
Article info
Received 24.03.2017 Received in revised form
22.04.2017 Accepted25.04.2017
I. Horbachevsky Ternopil State Medical University, majdan Voli, 1, Ternopil, 46001, Ukraine. Tel.: +38-0352-524-492. E-mail: ludafira@mail.ru
Lyhatskyi, P. H., Fira, L S., Fira, D. B., & Kuzmak, I P. (2017). Molecular mechanisms of metabolic disorders in the organs of rats of different ages affected by sodium nitrite in the context of tobacco intoxication. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 8(2), 259-264. doi:10.15421/021740
Among pollutants a significant threat is posed by heavy metals, nitrate fertilizers and industrial waste. However, people also contribute to this threat through bad habits such as smoking and alcohol. All these factors affect health and can cause death. The aim of this study was to investigate the content of reactive oxygen species, markers of cytolysis of hepatocytes, cardoza and the degree of endogenous intoxication in the organism of rats affected by nitrite of sodium on the background of tobacco intoxication. The experiments were carried out on white rats, which were divided into three age categories: immature, mature and old, who for 30 days were exposed to tobacco smoke. The research animals were divided into three groups. One of them for 24 hours before the end of the experiment was given sodium nitrite, the second group was given sodium nitrite 72 hours before the end of the experiment. 30 days after poisoning we tested the contents of reactive oxygen species in neutrophils, cytolysis of erythrocyte membrane was investigated by erythrocytic index of intoxication, hepatocytes and cardiocytes - aminotransferase activity. The degree of endogenous intoxication was evaluated by the content of average weight molecules in blood serum. Poisoning of rats with sodium nitrite in the background of the 30 day intoxication by tobacco smoke led to a significant formation of ROS in neutrophils of rats of different age groups. We investigated the activity of aminotransferases in the blood serum and the above organs of rats after exposing them to sodium nitrite and 30 day tobacco smoke. In the blood serum of adult and aged rats, the activity of alanine aminotransferase increased in these conditions by 2.1 and 1.6 times, respectively. Sodium nitrite, which was an additional factor in the intoxication of the rats of all age groups by smoke, caused more pronounced changes in the activity of the studied enzyme in the blood serum. In the liver and myocardium of rats of different ages was observed a reliable decrease of this index was observed in all experimental groups. Trere was a significant increase in the serum of rats at different ages of aspartate aminotransferase activity. Aspartate aminotransferase activity in the myocardium of all experimental animals showed a reduction by 1.2-1.3 times after smoke inhalation and 1.5-1.6 times with simultaneous intoxication of the rats by sodium nitrite and tobacco smoke. Sodium nitrite, as an additional toxin raised the penetration capacity of erythrocytes among rats poisoned with smoke.By the end of the experiment, the erythrocyte index of intoxication increased in all age groups: immature rats by 31.7%, mature - by 36.0%, in old rats - by 23.6%. The next step of our research was to investigate the markers of endogenous intoxication - average molecular weight. After the simultaneous intoxication of rats by sodium nitrate and tobacco smoke, at the end of the experiment the content of average weight molecules was X = 254 and of average mass X= 280 in the blood serum of rats of all age groups increased by 3.1-3.3 times compared with the intact control group. Immature rats proved most sensitive to the action of sodium nitrite and tobacco.
Keywords: reactive oxygen species; aminotransferases; endogenous intoxication; molecules of average weight
Молекулярш мехашзми метаболiчних порушень в органах щурiв pi3Horo вжу, уражених натр^ штритом на тютюново'1 штоксикацп
П. Г. Лихацький, Л. С. Ф1ра, Д. Б. Ф1ра, I. П. Кузьмак
Тернотльський державний медичний утверситет Шет I. Я. Горбачевського МОЗ Украти, Тернотль, Украта
Ураження щурiв натрто штритом на rai 30-денж» штоксикацп тютюновим димом зумовило посилене утворення активних форм кисню в нейтрофшах кровг Отруення токсикованих димом щурiв натрто штритом протягом 72 год. спричинило значне збшьшення вмюту активних форм кисню га^вняно з штактними тваринами. Найвиразнше зб^шення вм^у активних форм кисню вiдмiчене у статевонезрших щурiв (утрич^. Ц сполуки проявляють деструктивний вплив на бюмакромолекули в оргашзм^ викликають цитсшз гепатоцит^в, кардюципв та еритроципв, про що свщчить збшьшення активносп амiнотрансфераз у сироватщ кровi та зниження 1х у печшщ та мюкардг Встановлено тдвищення активносп ашнотрансфераз у сироватщ кровi щурiв уах вжових груп - найчутлившими до
цих показниюв виявились молодi особини. Аналопчно найвиразнiше зниження активностей амiнотрансфераз спостершали у печiнцi та мiокардi статевонезрших тварин. Протягом дослщження вiдмiчено зб^шення проникностi еритроцитарних мембран щурiв уах вiкових категорiй. До юнця експерименту проникнють еритроцитарно! мембрани виразно збшьшилась у молодих i статевозрiлих щурiв. Еритроцитарнi мембрани старих тварин виявились найстшюшими до ди токсичних чинниюв. За ураження щурiв тютюновим димом i натрiю нiтритом посилюються катаболiчнi процеси та поглиблюеться ендогенна штоксикащя, маркери яко! - молекули середньо! маси. За одночасного ураження тварин обома токсикантами у сироватщ кровi спостерiгаеться значне збiльшення вмiсту молекул середньо! маси обох фракцiй (фракщя СМЬ в яюй переважають ланцюгсга амiнокислоти, та фракцiя СМ2, в якш переважають ароматичнi амiнокислоти). Зб^шення вмiсту молекул середньо! маси в сироватщ кровi тварин усiх вжових груп виявилось на одному рiвнi. Найчутливiшi до ди тютюнового диму та штриту натрiю виявились статевонезрш особини.
Ключовi слова: активн форми кисню; амiнотрансферази; ендогенна iнтоксикацiя; молекули середньо! маси
Вступ
Тютюновий дим належить до найагресивн1ших «проок-сидантних полютатгв». KpiM нжотину, в оргатзм людини надходять понад 4 000 piзних токсичних речовин. У газоподб-нiй частинi тютюнового диму мютяться такi високотоксичнi хiмiчнi компонента як щанистий водень, метан, летюч нпра-ти, окис азоту, аншн, толуощин, деяи полшиктчш ароматичш сполуки вуглецю, низка окиснених сполук - альдепдв, фено-лiв, кислот, складних эфipiв (Wipfli and Samet, 2009; Pappas, 2011; Behera et al., 2014). Агресившсть диму зумовлена не тль-ки газоподбними х1м1чними активними сполуками, яким влас-тива канцерогенна дя (формальдепд, бензтрен), а й елемен-тами твердо! фази цигаркового диму (сполуками кадмгю, нже-лю, полоню, деякими шшими важкими металами) (Hagstad et al., 2014; Shihadeh et al., 2015; Pikas, 2015).
Отримано також свщчення про те, що не тiльки активне палшня, а й забруднення атмосфери примщень тютюновим димом - фактор ризику у виникненш р1зних захворювань (Stangherlin et al., 2009; Hagstad et al., 2014).
Шд час куршня вщбуваеться генеpацiя активних форм кисню (О2-, О21-, ОН-, R02, ОН2, Н2О2 тощо), як1 вщграють важливу роль у багатьох ф1з1олог1чних (Valavanidis et al., 2009; Westbrook et al., 2010) i бюхмчних процесах: pегуляцii тонусу судин, клiтиннiй протферащ, сингез1 простагландин1в, передач сигналiв вщ мтжклпинних сигнальних молекул на регуляторы системи, що контролюють експpесiю генв, м1кробоцидн1й да фагоцитов (Varela-Carver et al., 2010; Ignatowicz et al., 2012).
В основ1 патогенно! до забрудненого полютантами або тютюновим димом повпря лежить оксидантна агре^ на слизову оболонку дихальних шляыв активними формами кисню, до-ксидами азоту та арки, iншими виьними радикалами (Churg et al., 2008; Halima et al., 2009; Luchese et al., 2009), що викликае активащю перекисного окиснення лш|тв i пошкодження бюло-пчних мембран (Ray et al., 2012; Pickering et al., 2013).
У зв'язку з широким використанням нпратних добрив у сиьському господарств1 та !х миращею у Грунтов1 води та харчов1 продукти поширення нпратних отруень набуло ещде-мчного значення. Шдвищений вмтст нiтpатiв у продуктах став реальним фактом сучасного життя.
Литературы дан свщчать, що за гемчно! гiпоксii, спричинено! введеним натpiю ттригом (Yrhashev, 2009; Jensen, 2010; Buehler et al., 2011), у тканинах тварин простежуеться нагромадження piвня активних форм кисню та штенсифжащя процеов ПОЛ. Нлритна iнтоксикацiя супроводжуеться вираженим мембраноток-сичним ефектом (El-Sheikh and Khalil, 2011; Ivanov et al., 2014; Baek et al., 2015). У реальному житт нервдко зустр1чаеться комбь нована дiя декiлькох токсичних чинниюв на органзм. Повсякден-но людина тддаеться впливу цих речовин.
Мета нашого дослщження - оцшита вмст активних форм кисню, маркери цитолзу гепатоциттв, кардоцитв i ступшь ендогенно! штоксикаци в оргатзт щуpiв, уражених нпритом натрта на тл тютюново! штоксикаци.
Матерiал i методи дослвджень
Для проведения дослвджень використовували бiлих безпо-родних щуpiв-самцiв, яких утримували на стандартному ращош
BiBapiK> Тернопшьського державного медичного утверсигету. Щури подiленi на три в1ков1 категори: перша - статевонезрт, масою тша 60-80 г, друга - статевозрт, масою тла 180-200 г, третя - старi щури, масою тла 300-320 г. Кожна вiкова група складалася i3 двох щдгруп: штактний контроль i дослдна група. Щурiв дослдних груп протягом 30 дб поддавали впливу тютюнового диму. Доипдт тварини подлет ще на три групи. Однш i3 них за 24 год. до заюнчення експерименту вводили натрто ттриг у доз! 45 мг/кг маси тша, другiй - натрто ттриг (за 72 год. до евтаназй). Третю групу щурiв поддавали токсичному впливу тльки тютюнового диму. Модель залежносп в!д хротчно! дй тютюнового диму створювали за допомогою герметично1 камери об'емом 30 л, що дозволило обкурювати тварин у вшьних умовах. Тютюновий дим, що утворювався гцд час горшня шести сигарет «Прима срiбна (синя)» (з умстом 0,6 мг нiкотину та 8 мг смоли), через отвори в камер! подавали всередину. У камерi одночасно перебували шiсть тварин протягом 6 хвилин. Тварин контрольно1 групи також розмшували протягом 6 хвилин у гермешчнш камера але не тдлягали дй тютюнового диму.
Через 30 дб пiсля початку ураження тварин тютюновим димом 1х виводили з експерименту шляхом евтаназй тд тюпенталовим наркозом.
Для дослщження брали кров, сироватку кровi, печшку та мюкард тварин. 1з досщдних тканин готували 10% гомогенат на фiзiологiчному розчинi.
Вм1ст активних форм кисню (АФК) визначали в нейтрофь лах кровi методом Maruschak (2012). Популяцто нейтрофiлiв кровi отримували за допомогою центрифугування на подвгй-ному градieнтi щiльностi 1,077 i 1,093 фжолу-верографшу. Пiсля 40 хв центрифугування за температури 4 °С i швидкосг! 1 500 об./хв утворювалися двi 1нтерфази. Верхня 1нтерфаза (на меж! «плазма - верифжол», щшьтстю 1,077) складалася з мононуклеарних клпин: 80% л!мФоцит!в, 15-18% моноцит!в i незначного (2-3%) додатка гранулоцитiв. Нижня гнтерфаза (на межг град^ентгв розчишв щ!льн!стю 1,077-1,092) являла собою на 98-100% популящю нейтрофiлiв. Життeздатнiсть клпин у тесп з трипановим ситм складала 98-99%. Аналiз зразк1в rai-тин для визначення АФК нейтрофшв проводився на проточному цитометрi Epics XL (Beckman Coulter, США) з допомогою 2,7-дипдродихлорфлюоресцеш дацетату. Значення до-слiджуваного параметра виражали у вiдсотках (iнтенсивнiсть св!гшня на клпину). Цитол!з еритроцитарно1 мембрани дослщ-жували за еритроцитарним гндексом штоксикацп (Ell) (Tohay-baev et al., 1988), гепатопипв i кард^опитгв - за активтстю ам1нотрансфераз (АсАТ i АлАТ) в реакцй з 2,4-динпрофенш-гiдразином (Reitman and Frankel, 1957; Tarrant et al., 2013). Ступшь ендогенно! штоксикапи оЦнювали за вмстом молекул середньо1 маси (МСМ) у сироватщ кров!, зокрема двох фракЦй (СМ! i СМ2) (Nikolaichik, 1989; Winchester and Audia, 2006).
П!д час проведення досл!джень користувались загальними принципами експеримент!в на тваринах, схваленими на Национальному конгрес! з бюетики (Ки!в, Укра!на, 2001) та узгодже-ними з положеннями Свропейсько! конвенцй про захист хре-бетних тварин, яких використовують для експериментальних та шших наукових п!лей (Страсбург, Францш, 1985) (Simon and Wilkinson, 2007; Gross and Tolba, 2015). Статистичну об-робку даних проводили за допомогою програми Statistica 6.0 з використанням параметричного критер!ю ANOVA та непара-
мeтpичнoгo ^mcpm Вiлкoкcoнa для зв'язaниx вибipoк. Змши ввяжяли дocтoвipними зa P < 0,05.
Результати
Gтpyeння нaтpiю нiтpитoм na тл1 30-дoбoвoï iнгoкcикaцiï тютюжшим димйм викликaлo знaчнe yтвopeння aктивниx фopм киcню в nempc^rnax кpoвi щypiв piзниx вiкoвиx ipyn (тябл. 1).
Haйчyтливiшими дй да тoкcикaнтa виявилиcь cтaтeвoнeзpiлi щypи, в якиx умют aкгивниx фopм кишю y кpoвi збiльшивcя y 2,6 paзa, мeнш чутливими - crapi ocoбини (дaний пoкaзник nepe-вищyвaв piвeнь iнгaкгниx твapин y 2,1 paзa). У cтaтeвoзpiлиx щypiв вмют aкгивниx фopм киcню лишe в 1,6 paзa пepeвищyвaв нopмy. Пиля пoтpanляння дй opгaнiзмy дoдaткoвoгo тoкcикaнтa
нaтpiю нiтpигy piвeнь дocлiджyвaнoгo ^Ka^ma знaчнo тдви-щyвaвcя. Ha 30-ту дoбy тютюнoвoï iнгoкcикaЦï тя 24 гад. oтpyeн-ня нaтpiю нiтpитoм вмicт aктивниx фopм киcню виявивcя дeщo вищим пopiвнянo з тaким y щypiв, якиx п1ддявяии ттльки впливу тютюнoвoгo диму . Уpaжeння тoкcикoвaниx димйм rnypib нaтpiю нiтpитoм пpoтягoм 72 год. зумйвилй знaчнe збiльшeння вмicтy яктивниx фopм киcню пopiвнянo з итакшими твapинaми. У стя-тeвoнeзpiлиx rnypib цeй пoкaзник збiльшивcя yтpичi, у cтaтeвo-зpiлиx i crapm - у 2,0 тя 2,6 paзa, вiдпoвiднo.
Gчeвиднo, тяга пiдвищeння кoнцeнтpaщï aктивниx фopм кжню - нacлiдoк змiшeння piвнoвaги мтж npoцecaми ïx утво peння тя дeтoкcикaцiï тя мoжe бути пepeдyмoвoю пopyшeння фyнкцioнaльнoï aктивнocтi клгшн, poзвиткy пaтoлoгiчниx ^o-цeciв в opгaнiзмi.
Таблиця 1
Вмicт aктивниx фефм киcню (%) у нeйгpoфiлax ^erni щypiв piзнoгo вшу,
ypaжeниx нaтpiю нiтpитoм, ня тт 30-дoбoвoï iнгoкcикaцiï тютюнавим димйм (M i m; n = 6)
Тфмш дocлiджeння cтягeвoнeзpiлi Tpym дocлiдннx твapин cтaтeвoзpiлi crapi
йтактш шypн 15,06 i 0,71 18,47 i 0,22 19,87 i 0,86
30-гя дoбя ypaжeння тюгюнoвнм днмoм 39,25 i 1,29*** 29,54 i 0,50*** 41,89 i 0,78***
30-гя дoбя ypaжeння тюгюнoвнм днмoм + 24 год. oтpyeння нятpiю нiтpитoм 43,52 i 1,47*** 32,53 i 0,74*** 46,47 i 0,53***
30-гя дoбя ypaжeння тюгюнoвнм димим + 72 год. oтpyeння нaтpiю нiтpнтoм 45,78 i 0,84* 37,86 i 0,67*** 52,18 i 1,20***
Примтка: bipoi^rn змши м:ж iнтaктними щypями тя щ^ями, ypaжeними тoкcикянтями: * - P < 0,05, *
Вяжливя чястиня нaшиx дocлiджeнь - oщнювaння дecтpyк-тивниx npoцeciв в ypaжeниx oбpaними тoкcичними peчoвинa-ми ткaнинax. Ми дocлiдили aктивнicть aмiнoтpaнcфepaз -мapкepниx eнзимiв пeчiнки тя мioкapдa в cиpoвaтцi кpoвi тя вищeнaзвaниx opFamx щypiв пicля oднoчacнoгo ypaжeння ïx нятpiю нiтpигoм тя тютюнйвим димйм (тябл. 2, 3).
Зя 30-дoбoвoгo ypaжeння тютюнйвим димйм няйбшьш! змши яктивнocтi aлянiнямiнoтpянcфepaзи вiдмiчeнi у ^porna'tiii кpoвi cтятeвoнeзpiлиx rnypib: ien пoкaзник у ник збiльшивcя у 4,5 paaa, пopiвнянo з piвнeм у iнгaктниx шypiв. У cиpoвaтцi кpoвi cuare-вoзpiлиx i craprn шypiв якшвнють aлянiнямiнoтpянcфepaзи збшь-шилacь зя дяниx умйв у 2,1 тя 1,6 paaa, вiдпoвiднo. Ш^то нiтpит, який oтpимaли oтpyeнi димйм щурт вcix вiкoвиx ^ул, викликяв cильнi змши яктивнocтi дocлiджyвянoгo eнзимy у cнpoвятцi кpoвi. Чepeз 72 год. пиля ййго пoтpяnляння дй opгaнiзмy eнзим щдви-щив aRmEmciL у 6,5 paaa у cтaтeвoнeзpiлиx шypiв i в 2,9 pœa у двox iншиx гpyпax mapm (тябл. 2). У пeчiнцi тя шypiв
piзнoro вжу cпocтepiгaли вipoгiднe знижeння цьoгo пoкaзникя в ycix дocлiдниx ^^ax. Haйвиpaжeнiшe знижeння aктивнocтi эля-
* - P < 0,01, *** - P < 0,001.
нiнaмiнoтpaнcфepaзи вiдмiчeнe у шчшщ cтяpиx шypiв, яю Gnp^ мувяли йбидвя тoкcикянти, я тepмiн дocлiджeння cтянoвив 72 год. OTpyœra нятpiю нiтpитoм ня тл1 30-дoбoвoï iнтoкcикяliï тютюнйвим димйм. У мioкapдi шypiв ycix дocлiдниx ^уп знижeння aктивнocтi aлянiнямiнoтpaнcфepaзи cтaнoвилo близью 50%.
Шд чac дocлiджeння aктивнocтi acпяpтятямiнoтpaнcфepaзи виявлeнo aнaлoгiчнi змши. У cиpoвaтцi кpoвi шypiв piзнoгo вшу aктивнicть eнзимy зaзнaля знячнoгo щдвищeння (тябл. 3). Ияйчутлив^шими виявилиcь crapi шypи. Цeй пoкaзник у ню пiдвишивcя пicля oтpyeння димйм yipmi, я нaпpикiнцi дocлiд-жeння тд чяc ypяжeння oбoмя тoкcикaнгями - yп'ятepo. Вipo-гiднe збiльшeння (P < 0,001) aктивнocтi дocлiджyвaнoгo ernH-му вiдмiчeнe й у ^ox iншнx вiкoвнx гpyпяx.
У шчшщ шypiв пicля iнгoкcикaцiï тютюнoвнм димйм вщ-мiчaлн зннжeння aктнвнocтi acпяpтятямiнoтpaнcфepaзн у 1,7, 1,6 тя 1,4 paзa вiдпoвiднo у cтятeвoнeзpiлиx, cтaтeвoзpiлиx i cтяpиx шypiв. В ocтaннiй тepмiн дocлiджeння впливу o6ox ток-cнкaнгiв яктивнicть eнзнмy зннзнляcь у 2,5 paзa у пeчiнцi щypiв piзннx вiкoвнx гpyп.
Таблиця 2
Активтсть aлaнiнямiнoтpaнcфepaзн у cнpoвятцi »porni (мкмйль/л год.), пeчiнцi тя мioкapдi (мкмйль/кг год.) шypiв piзнoгo вшу, ypaжeниx нятpiю нiтpнгoм, ня rai 30^o6g®oï iнгoкcикaцiï тютюнoвнм димйм (M i m, n = 6)
Дocлiднi Тфмш дocлiджeння Tpym дocлiдннx твapин
зpaзки cтягeвoнeзpiлi cтaтeвoзpiлi crapi
Iнтaктнi шypн 0,56 i 0,02 1,10 i 0,11 1,45 i 0,12
30-гя дoбя ypaжeння тютюнoвнм днмoм 2,52 i 0,19*** 2,36 i 0,14*** 2,27 i 0,20***
Cиpoвaткa кpoвi 30-гя дoбя ypaжeння тютюнoвнм днмoм + 24 год. oipy^^ нятpiю нiтpнтoм 3,03 i 0,18*** 2,76 i 0,16*** 3,41 i 0,24***
30-гя дoбa ypaжeння тютюнoвнм днмoм + 72 год. oipy^^ нятpiю нiтpнтoм 3,62 i 0,31*** 3,15 i 0,21*** 4,17 i 0,37***
Imara-m шypн 6,98 i 0,10 6,60 i 0,27 8,03 i 0,28
30-гя дoбя ypaжeння тютюювим днмoм 4,26 i 0,28*** 4,65 i 0,46*** 4,02 i 0,39***
^WRa 30-гя дoбя ypaжeння тютюювим димим + 24 год. oipy^^ нятpiю нiтpнтoм 3,37 i 0,26*** 3,74 i 0,27*** 2,66 i 0,14***
30-гя дoбя ypaжeння тютюнoвнм днмoм + 72 год. OTpy^^ нятpiю нiтpнтoм 2,10 i 0,14*** 3,45 i 0,13*** 2,05 i 0,15***
Iнтaктнi щypи 3,91 i 0,16 4,67 i 0,34 4,38 i 0,09
30-гя дoбя ypaжeння тютюнoвнм димим 3,04 i 0,13*** 2,93 i 0,11*** 3,23 i 0,13***
Mioкapд 30-гя дoбя ypaжeння тютюнoвнм димим + 24 год. oтpyeння нaтpiю нiтpнтoм 2,23 i 0,10*** 2,44 i 0,10*** 2,78 i 0,18***
30-гя дoбя ypaжeння тютюювим ди^м + 72 год. OTpy^^ нятpiю нiтpнтoм 1,92 i 0,11*** 2,32 i 0,13*** 2,07 i 0,14***
Примтка: див. тябл. 1.
Таблиця 3
Активтсть аспартатамшотрансферази у сироватщ KpoBi (мкмоль/л год.), печ1нщ та мюкарда (мкмоль/кг год.) щур1в pi3Horo в1ку, уражених натр1ю нiтритом, на rai 30-добовоï iнтоксикацiï тютюновим димом (M ± m, n = 6)
Дослщн1 зразки
Термiн дослщження
Групи дослщних тварин
статевонезрщ1 статевозр1л1 стар1
0,93 ± 0,08 0,63 ± 0,03 0,66 ± 0,05
1,71 ± 0,11*** 1,58 ± 0,10*** 1,98 ± 0,14***
3,67 ± 0,09*** 2,52 ± 0,15*** 2,62 ± 0,14***
4,14 ± 0,13*** 3,04 ± 0,12*** 3,30 ± 0,11***
4,37 ± 0,17 4,23 ± 0,22 4,68 ± 0,29
2,63 ± 0,13*** 2,57 ± 0,13*** 3,39 ± 0,08***
2,07 ± 0,10*** 1,95 ± 0,07*** 2,35 ± 0,17***
1,73 ± 0,10*** 1,67 ± 0,08*** 1,91 ± 0,15***
7,45 ± 0,25 7,37 ± 0,17 7,23 ± 0,45
6,23 ± 0,33** 5,63 ± 0,34*** 6,00 ± 0,33
5,62 ± 0,33*** 4,95 ± 0,18*** 5,23 ± 0,29***
4,97 ± 0,37*** 4,56 ± 0,20*** 4,75 ± 0,20***
Iнтактнi щури
30-та доба ураження тютюновим димом Сироватка 30-та доба ураження тютюновим димом + кровi 24 год. отруення натрiю нiтритом
30-та доба ураження тютюновим димом + _72 год. отруення натрто нпритом_
Печ1нка
Iнтактнi щури
30-та доба ураження тютюновим димом 30-та доба ураження тютюновим димом + 24 год. отруення натрто нпритом 30-та доба ураження тютюновим димом + 72 год. отруення натрто штритом_
Мюкард
1нтактн1 щури
30-та доба ураження тютюновим димом 30-та доба ураження тютюновим димом + 24 год. отруення натрто нпритом 30-та доба ураження тютюновим димом + 72 год. отруення натрто нiтритом_
Примтка: див. табл. 1.
Дослщження активном! аспартатамшотрансферази у мо-кардi вс1х достдних тварин показало зниження ïï в 1,2-1,3 раза пiсля отруення димом та в 1,5-1,6 раза за одночасного ураження штоксикованих щур1в натрта нiтритом.
Результати дослщжень дозволили вщмтити, що натр1ю нприт, потрапивши до органiзму отруених тютюновим димом тварин, посилюе токсичний вплив останнього. Це тдтверджу-еться посиленою генеращею активних форм кисню в нейтро-фiлах кровi, а також посиленням деструктивних процесiв у пе-ч1нщ та мiокардi, на що вказуе тдвищена активнiсть амшо-трансфераз у сироватщ кровi та зниження у названих органах. Така змша активност! ензимiв свiдчить про цитол1з гепато- та кардюципв за дй обох токсиканпв.
Ми достдили проникнуть еритроцитарних мембран тсля ураження щур1в тютюновим димом i в поеднант з натр1ю нпритом (табл. 4). Интоксикащя тютюновим димом викликае в1ропдне щдвищення (Р < 0,001) проникносп еритроцитарноï мембрани щур1в статевозр1лого та старого вшу. Проникна здатнiсть плазматичжй мембрани еритроципв статевозр1лих щур1в збшьшилась на 18,8%, старих - на 12,9% тсля отруення. Натр1ю нприт, який отримали токсикованi димом щури, ще бiльше посилив пропускну здаттсть еритроцитiв, i до юнця експерименту (72 год. ураження натрта нпритом на тт 30-до-
Таблиця 4
Проникнуть еритроцитарноï мембрани (%) у щур1в р1зного в1ку,
уражених натрта нпритом на rai 30-добовоï штоксикаци тютюновим димом (M ± m, n = 6)
бового отруення тютюновим димом) еритроцитарний шдекс штоксикаци пдвищився в ус1х вжових групах: у статевонезрiлих щур1в - на 31,7%, у статевозриих - на 36,0%о, у старих - на 23,6%.
Наступний етап досл1джень - вивчення вм1сту маркер1в ендогенжа штоксикаци - молекул середньоï маси (фракцй СМ254 та СМ280), яю у подальшому у разi збшьшення ïх кон-центрацiï в органiзмi посилюють переб1г патологiчного про-цесу, набуваючи рол! вторинних токсин1в, здшснюють вплив на життед1яльн!сть ус1х систем i оргащв. Показник р1вня молекул середнкй маси вважають основним бюхмчним маркером, що в1дображае р1вень патолопчного бшкового метабол1зму (Nikolsky et al., 2013). 1нтоксикащя тютюновим димом зумови-ла збшьшення вм1сту СМ254 у сироватщ кров! на 30-ту добу отруення у статевонезрших i старих щур1в у 2,6 раза, у статевозриих - у 2,8 раза (табл. 5). За комбшованого ураження щур1в достджуваними токсикантами (на 30-ту добу отруення тютюновим димом i 72 год. застосування натрта нпригу) вмтст СМ254 у сироватщ кров! щур1в ус1х вжових груп зб1льшився у 3,1-3,3 раза пор1вняно з 1нтактною групою тварин. Найвираз-ншими виявились зм1ни цього показника у сироватщ кров! статевонезрших щур1в (вмст СМ280 зазнав найбшьшого п1дви-щення в ус! термши достдження), аналог!чн! зм1ни виявлет тд час достдження вм1сту фракци СМ280 (рис.).
Терм1н дослщження статевонезрш Групи дослщних тварин статевозрш стар1
1нтактн1 щури 20,81 ± 2,09 17,29 ± 1,29 32,91 ± 2,36
30-та доба ураження тютюновим димом 26,04 ± 2,24 36,04 ± 2,89*** 45,83 ± 2,47***
30-та доба ураження тютюновим димом + 24 год. отруення натрто нпритом 55,21 ± 2,34*** 46,46 ± 3,96*** 49,79 ± 4,52**
30-та доба ураження тютюновим димом + 72 год. отруення натрто нпритом 52,46 ± 2,81*** 53,33 ± 2,18*** 56,46 ± 1,89***
Примтка: див. табл. 1.
Таблиця 5
Вмтст молекул середным маси (фракция СМ254) у сироватщ кров! щур1в р1зного вшу, уражених натрта нпритом на rai 30-добовоï iнтоксикацiï тютюновим димом (M ± m, n
= 6)
Терм1н дослщження статевонезрш Групи дослщних тварин статевозрш стар1
1нтактн1 щури 1,40 ± 0,12 1,10 ± 0,08 1,37 ± 0,06
30-та доба ураження тютюновим димом 3,70 ± 0,11*** 3,10 ± 0,11*** 3,57 ± 0,06***
30-та доба ураження тютюновим димом + 24 год. отруення натрто нпритом 4,17 ± 0,06*** 3,33 ± 0,10*** 3,93 ± 0,10***
30-та доба ураження тютюновим димом + 72 год. отруення натрто нпритом 4,67 ± 0,07*** 3,53 ± 0,10*** 4,23 ± 0,09***
Примтка: див. табл. 1.
ё 200
150
100
50
л /л
И 0
□ 30-та доба ТД
□ 30-та добаТД + 24 год НН
□ 30-та доба ТД + 72 год НН
статевонезр1Д1
статевозр1Д1
стареч!
Рис. Вмтст СМ280 (%) у сироватщ кров! щургв р1зного вжу, уражених натрто нпритом, на тл 30-добовоï iнгоксикацiï тютюновим димом: *** - вiрогiднi змгни (Р < 0,001) мж штактними щурами та щурами, ураженими токсикантами
Iмовiрно, тдищення конценграцiï молекул середньоï маси у сироватщ кров! зумовлене порушенням ïx елiмiнацiï з орга-нвму, посиленим утворенням у тканинах або поеднанням обох цих меxанiзмiв.
Обговорення
За да екстремальних факторiв рiзного походження (xiмiчне забруднення, iонiзуюче випромшювання, гшер- i гшоксш, ток-сичнi речовини, запальнi процеси) у живих оргатзм1в штен-сифжуеться утворення активних форм кисню (Stangherlin et al., 2009; Wright and Churg, 2010). За певних умов тдвищення ш-тенсивносп утворення активних форм кисню над швидкстю ïx детоксикацц зумовлюе пошкодження клiтин (Kuznetsov et al., 2011; Wang et al., 2013). За вираженого або тривалого стресу концентрацш активних форм кисню у кттит може тдвищу-ватися, та, починаючи з певного порогового рiвня цих сполук, мобiлiзацiя захисних систем клтини слабшае, активуються процеси, як1 спричиняють апоптоз або некроз (Ozer et al., 2008; Maruschak, 2012).
У щургв рiзного вжу, отруених натрта нiтритом на тлi 30-добовоï штоксикацп тютюновим димом, у кровi вiрогiдно зростае вмiст активних форм кисню. Найвищий вмiст агре-сивних кисневмюних сполук спостерггали у кровi статевоне-зрiлиx щурiв, що може бути пов'язано з неспроможнiстю фер-ментних систем uieï групи тварин до знешкодження токсинiв та зниження активности процесiв адапгацiï.
Один iз прояв!в токсичноï дiï метаболiтiв кисню - штенси-фжащя реакцй вiлънорадикалъного окиснення. Активащя про-цесiв вiльнорадикального окиснення за да активних форм кисню викликае посилення пероксидного окиснення лЫдав, окис-ноï модифiкацiï бшмв, деструкцiï нуклешових кислот, вуглево-д!в, що спричиняе структурнi та метаболiчнi порушення у клiтинаx. Це може спричинити цитолiз та змгни проникносп плазматичних мембран клiтин рiзниx оргашв (Panina et al., 2008; Gladwin et al., 2009).
Найефективнше стушнь ураження клiтинниx мембран вiдображаеться сшввщношенням активност! внутритом!-тинних ензимiв у клггат та поза ïï межами, оскшьки в норм! лише незначна к!льк1сть внутршнюклпинних ензим!в мститься в сироватщ кров!. Активтстъ ензим!в корелюе з! ступенем пошкодження, який може виражатися в!д патолопчного посилення проникносп мембрани клгган до некрозу. Найбiльшоï уваги заслуговують органоспециф!чш, або шдикаторш ензими, специф!чн! тш>ки для певного типу тканин (Tarrant et al., 2013; McGill, 2016).
Дослщження активносп амшотрансфераз у сироватщ кров! щургв тсля отруення ïx тютюновим димом показало тдви-
щення аланшамшотрансферази та аспартатамшотрансферази у щур!в уж вжових груп. Ураження, ускладнене даею натрта нприту, викликало бшьш виражет змши активносп дослвджува-них ензимгв у сироватщ кров! щур!в, що може свщчити про значний ступшь цитсшзу гепатоцитгв i кардюципв пшя отруення. Стар! щури виявились найчутлившими стосовно цих показниюв. У печшщ та мюкард тварин р!зних вжових катего-рш вщмчене зниження активносп амшотрансфераз тсля по-трапляння натрто нприту на тт штоксикацп тютюновим димом, що щдтверджуе прояв цитолпичного ефекту використа-них нами ксенобютиив.
Для виявлення токсичного впливу активних метаболшв кисню на кров визначено еритроцитарний шдекс штоксикацц -маркер проникносп еритроцитаржи мембрани. За да викорис-таних нами ксенобютикв збш>шуеться проникн!сть еритроци-тарнм мембрани, причому використання обох токсиканпв од-ночасно спричинюе сумацто ïx токсичного впливу. На нашу думку, таке зростання проникносп еритропитарноï мембрани може бути однею з причин тдвищеного вмсту метгемогло-бшу, яке мае мюце за нпритного ураження та показане нами у попередтх дослщженнях. Одна з причин змши проникносп клпинних мембран за до натрто нитриту та тютюнового диму -токсичний вплив ïx метаболшв на структуры компоненти саме мембран (як лквдт, так i бшков!).
Розвиток деструктивних процесгв в ураженому оргатзт спричиняе нагромадження у кров! вторинних токсичних продукт, яю утворюються тсля потрапляння до нього екзоген-них токсикантгв, i поглиблюе ендогенну штоксикацто (Winchester and Audia, 2006; Panina et al., 2008). У наших експери-ментах це тдтверджуеться в!ропдним збшьтенням вмсту в сироватщ кров! статевонезрших, статевозрших i старих щургв молекул середным маси. Шсля ураження токсикантами у сироватщ кров! тварин уах вжових груп зростае вмтст молекул середньоï маси обох фракщй (CMj - переважають ланцюгов! амшокислоти та СМ2 - переважають ароматичн амшокислоти), що може бути наслщком деградацп в орган!зм! б!лкових молекул, гормошв, п1гмент!в, нуклеотид!в, зумовленоï утворенням значим к!лькост1 вторинних токсин!в (тсля активац!! в!льно-радикальних процес!в) на rai потрапляння до орган!зму пер-винних токсикант!в.
Таким чином, виявлет нами метабол!чн! порушення п1сля отруення щургв токсикантами ускладнюються одночасним ïx впливом на орган!зм. Найб!льш виражет змгни спостершали у щур!в статевонезршого в!ку.
Отриман! нами дан! вказують на перспективн!сть подаль-ших дослщжень !з метою пошуку адекватних методв корекцiï, як1 можуть бути використат як !з л1кувальною, так i з профь лактичною метою.
Висновки
Ураження щуpiв натpiю нпритом на тт 30-добово! штоксикаци тютюновим димом супроводжуеться збiльшенням кон-центраци у нейтpофiлах кров1 активних форм кисню. Остант, проявляючи токсичний вплив на р1зт компоненти мембран i бюмакромолекули в органзм1, спричиняють змши проникно-ст мембран гепатоцитiв i каpдiомiоцитiБ, а також збiльшення проникност еритроцитарних мембран, на що вказуе щдвищення активноси у сироватщ кров1 амiнотpансфеpаз, збiльшення еритроцитарного шдексу штоксикаци. Нагромадження про-м1жних токсичних продуктв поглиблюе ендогенну штоксика-цто, маркери яко! - молекули середньо! маси. 1х вмтст у сироватщ кров1 в1ропдно зростае тсля ураження натрто нпритом на тл1 30-добово! тютюново! iнтоксикацii. Найчутливiшi до до тютюнового диму та натрто нприту - статевонезpiлi щури. Протягом усього експерименту дослщжуваш показники саме у це! групи тварин зазнали найбиьших змiн.
References
Baek, J., Zhang, X., Williams, M., Hicks, W., Buehler, P., & D'Agnillo, F. (2015). Sodium nitrite potentiates renal oxidative stress and injury in hemoglobin exposed guinea pigs. Toxicology, 333, 89-99. Behera, S., Xian, H., & Balasubramanian, R. (2014). Human health risk associated with exposure to toxic elements in mainstream and sidestream cigarette smoke. Science of The Total Environment, 472(15), 947-956. Buehler, P., Butt, O., & D'Agnillo, F. (2011). Sodium nitrite induces acute central nervous system toxicity in guinea pigs exposed to systemic cell-free hemoglobin. Biochemical and Biophysical Research Communications, 409(3), 412-417.
Churg, A., Cosio, M., & Wright, J. (2008). Mechanisms of cigarette smoke-induced COPD: Insights from animal models. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology, 294(4), L612-631. El-Sheikh, N., & Khalil, F. (2011). L-arginine and l-glutamine as immuno-nutrients and modulating agents for oxidative stress and toxicity induced by sodium nitrite in rats. Food and Chemical Toxicology, 49(4), 758-762. Festing, S., & Wilkinson, R. (2007). The ethics of animal research. Talking Point on the Use of Animals in Scientific Research European Molecular Biology Organization Reports, 8(6), 526-530. Gladwin, M., Grubina, R., & Doyle, M. (2009). The new chemical biology of nitrite reactions with hemoglobin: R-state catalysis, oxidative denitrosylation, and nitrite reductase/anhydrase. Accounts of Chemical Research, 42(1), 157-167. Gross, D., & Tolba, R. (2015). Ethics in animal-based research. European
Surgical Research, 55, 43-57. Hagstad, S., Bjerg A., Ekerljung L., Backman, H., Lindberg, A., Ronmark, E., & Lundback, B. (2014). Passive smoking exposure is associated with increased risk of COPD in never smokers. Chest, 145(6), 1298-1304. Halima, B., Sarra, K., & Kais, R. (2009). Indicators of oxidative stress in weanling and pubertal rats following exposure to nicotine via milk. Human and Experimental Toxicology, 29, 489-496. Ignatowicz, E., Wozniak, A., Kulza, M., Senczuk-Przybylowska, M., & Cimino, F. (2012). Exposure to alcohol and tobacco smoke causes oxidative stress in rats. Pharmacological Reports, 65(4), 906-913. Ivanov, I., Gluhcheva, Y., Petrova, E., & Antonova, N. (2014). Hemorheo-logical changes and hematometric erythrocyte characteristics in rats after sodium nitrite intoxication. Korea Australia Rheology Journal, 26(2), 225-228.
Jensen, F. (2009). The role of nitrite in nitric oxide homeostasis: A comparative
perspective. Biochimica et Biophysica Acta, 1787(7), 841-848. Kuznetsov, A., Kehrer, I., Kozlov, A., Haller, M., Redl, H., Hermann, M., Grimm, M., & Troppmair, J. (2011). Mitochondrial ROS production under cellular stress: Comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 400(8), 2383-2390.
Luchese, C., Pinton, S., & Nogueira, C. (2009). Brain and lungs of rats are differently affected by cigarette smoke exposure: Antioxidant effect of an organoselenium compound. Pharmacological Research, 59(3), 194—201.
Maruschak, M. I. (2012). Rol' aktivnikh form kisnyu u rozvitku i progresuvanni gostrogo urazhennya legen' v yeksperimenti [The role of reactive oxygen species in the development and progression of acute lung injury in experiments]. Medical Chemistry, 50, 104—108 (in Ukrainian).
McGill, M. (2016). The past and present of serum aminotransferases and the future of liver injury biomarkers. Experimental and Clinical Sciences International Online Journal for Advances in Science, 15, 817-828.
Nikolaichik, V., Kirkovski, V., & Main, V. (1989) Sredniye molekuly obrazova-niye i sposoby opredeleniya [Average molecules formation and methods of determination]. Laboratory Work, 8, 31-33 (in Russian).
Ozer, J., Ratner, M., Shaw, M., Bailey, W., & Schomaker, S. (2008). The current state of serum biomarkers of hepatotoxicity. Toxicology, 245(3), 194-205.
Panina, L., Terletska, S., & Kovalchuk, S. (2008). Otsinka endohennoyi intoksy-katsiyi orhanizmu za umov eksperymental'noyi hemichnoyi hipoksiyi [Evaluation of endogenous intoxication under the experimental hypoxia hemic]. Achievements of Clinical and Experimental Medicine, 2, 72-76 (in Russian).
Pappas, R. (2011). Toxic elements in tobacco and in cigarette smoke: Inflammation and sensitization. Metallomics, 3(11), 1181-1198.
Pickering, A, Vojtovich, L., & Tower, J. (2013). Oxidative stress adaptation with acute, chronic, and repeated stress. Free Radical Biology and Medicine, 55, 109-118.
Pikas, O. (2015). Pro stan kurinnya tsigarok u suchasnikh umovakh, yogo vpliv na viniknennya zakhvoryuvan' v organizmi lyudini [On the level of cigarette smoking in modern conditions, its effect on the occurrence of diseases in humans]. Bukovina Medical Journal, 76, 227-230 (in Ukrainian).
Reitman, S., & Frankel, S. (1957) Definition of biochemical indicators of the toxicity of liver. American Journal of Clinical Pathology, 28(1), 56-60.
Shihadeh, A., Schubert, J., Klaiany, J., Sabban, M., Luch, A., & Saliba, N. (2015). Toxicant content, physical properties and biological activity of waterpipe tobacco smoke and its tobacco-free alternatives. Tobacco Control, 24(1), 22-30.
Stangherlin, E., Luchese, C., Ardais, A., & Nogueira, C. (2009). Passive smoke exposure induces oxidative damage in brains of rat pups: Protective role of diphenyl diselenide. Inhalation Toxicology, 21, 868-874.
Tarrant, J., Meyer, D., & Katavolos, P. (2013). Use of optimized aminotransferase methods in regulated preclinica studies. Veterinary Clinical Pathology, 42(4), 535-538.
Tohaybaev, A., Kurhuzkyn, A., & Rykun, I. (1988) Metod diagnostiki endogennoy intoksikatsii [Method of diagnosis endohennoy intoxication Laboratory Work, 22-24 (in Russian).
Valavanidis, A., Vlachogianni, T., & Fiotakis, K. (2009). Tobacco smoke: Involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles. International Journal of Environmental Research and Public Health, 6, 445-462.
Varela-Carver, A., Parker, H., Kleinert, C., & Rimoldi, O. (2010). Adverse effects of cigarette smoke and induction of oxidative stress in cardiomyocytes and vascular endothelium. Current Pharmaceutical Design, 16, 2551-2558.
Wang, X., Fang, H., Huang, Z., Shang W., Hou, T., Cheng, A., & Cheng, H. (2013). Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany), 91(8), 917-927.
Westbrook, D., Anderson, P., Pinkerton, K., & Ballinger, S. (2010). Perinatal tobacco smoke exposure increases vascular oxidative stress and mitochondrial damage in non-human primates. Cardiovascular Toxicology, 10, 216-226.
Winchester, J., & Audia, P. (2006). Extracorporeal strategies for the removal of middle molecules. Seminars in Dialysis, 19(2), 110-114.
Wipfli, H., & Samet, J. (2009). Global economic and health benefits of tobacco control: Part 1. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 86(3), 263-271.
Wright, J., & Churg, A. (2010). Animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine, 4(6), 723-734.
Yrhashev, T., & Karimov, A. (2009). Vliyaniye nitratov na organizm cheloveka i zhivotnykh [Effect of nitrates on the organisms of humans and animals]. Nodyr, Dushanbe (in Russian).
