CC BY
18
Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine» •
© Смолина Т.П., 2017 г. doi: 10.5281/zenodo.817841
Удк 577.114:612.112.91/.94/.95:612.017.11
Т.П. Смолина
модуляция функциональной активности nkt-лимфоцитов человека капсульным полисахаридом PSEUDOALTEROMONAS NIGRIFACIENS
НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток
С помощью цитометрического метода показано, что капсульный полисахарид (КПС), выделенный из морских бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens, оказывает активирующее действие mNKT-клетки, усиливая их дегрануляцию(экспрессия мембранного CD107а) ивнутриклеточный синтезцитокинов: IL-12, TNF-a, IFN-y, не оказывая влияния на внутриклеточный синтез IL-10.
Ключевые слова: капсульный полисахарид, морские бактерии, NKT-клетки, CD107а, внутриклеточные цитокины.
T.P. Smolina
modulation of human nkt-lymphocytes functional activity
BY CAPSULAR PoLYSACHARIDE FRoM PSEUDOALTEROMONAS NIGRIFACIENS
Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after GP Somov, Vladivostok, Russia
Using the cytometric method, it was shown that the capsular polysaccharide (PBS) isolated c marine bacteria Pseudoalteromonas nigrifaciens exerts an activating effect on NKT cells, enhancing their degranulation (expression of membrane CD107a) and intracellular synthesis of cytokines: IL-12, TNF-a, IFN-y, without affecting the intracellular synthesis of IL-10.
Keywords: capsular polysaccharide, marine bacteria, NKT cells, CD107a, intracellular cytokines.
NKT-лимфоциты, экспрессирующие как маркеры NK-клеток (CD16, CD56), так и Т-клеточные диффе-ренцировочные антигены (CD3, CD4, CD8), играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа. Поиск лигандов NKT-клеток имеет большое значение для понимания функционирования этой популяции Т-клеток. Изучение возможности воздействия на активность ]][КТ-клеток может иметь решающее значение в клинике при инфекционный заболеваниях, аутоиммунных процесса-хи в лечении злокачественных новообразований. [1,2].
Морские аэробные бактерии рода Pseudoaltero-monas продуцируют широкий набор биологически активных соединений, перспективных для биотехнологии и могут культивироваться в искусственных условиях [3]. Капсульный полисахарид (КПС), выделенный из морских бактерий Pseudoalteromonas шgrifaciens, оказывает активирующее действие на иммунокомпетентные клетки крови человека, усиливает миграционный и эффекторный потенциал клеток врожденного иммунитета [4]. Исходя из этого, представлялось перспективным исследовать влияние КПС Р. nigrifaciens на изменение функциональной активности ]КТ-клеток человека.
Цель работы: изучение влияния КПС Р nigrifaciens (штамм КММ 156) на процесс дегрануляции МКТ-клеток (экспрессия мембранного CD107а) ивнутриклеточную продукцию цитокинов: ^-12, ТЫБ-а, Ш]-у и ^-10.
Материал и методы
КПС получен из штамма КММ 156 бактерий Р. nigrifaciens, выделенных из ткани желудка дальне-
восточного двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus. КПС состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих два остатка L-рамнозы, один остаток 2-ацетамидо-2-дезокси^-глюкозы и один остаток 3-О-[^)-1-карбоксиэтил]-D-глюкозы (глюколактиловой кислоты) [5]. Глико-полимеры выделены и любезно предоставлены для исследования сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова.
Материалом для исследования служила полученная от здоровых доноров периферическая кровь с гепарином (25 ЕД/мл), которую разводили в соотношении 1:2 полной питательной средой (среда RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,01 М HEPES, 200 мМ L-глутамина, 100 мг/мл гентамицина).
Использование цельной крови не требует выделения и подготовки клеток к культивированию, устраняет неспецифическую активацию клеток на этапах сепарации, и при этом сохраняется существующий in vivo баланс различных типов клеток крови. КПС растворяли в физиологическом растворе (NaCl 0,9%) и вносили в кровь в конечных концентрациях 10 мкг/мл. В контрольные пробы вносили физиологический раствор в объеме, равном объему раствора КПС. Уровень экспрессии поверхностных молекул CD107а определяли цитометрическимметодом в программе «Cell Quest Pro» на проточном цитометре «FACS Calibur» («Becton Dickinson») c использованием моноклональных антител к молекулам CD3-FITC, CD107а-PE, CD56-APC («BeckmanCoulter»)
Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»
и соответствующих изотопических контролей. В каждой пробе анализировали не менее 104 клеток. Экспрессию молекул на поверхности клеток определяли через 4 часа.
Для оценки внутриклеточной продукции цитоки-нов цельную кровь инкубировали в течение 4 часов с 10 мкг/мл. КПС в присутствии 2 мкмоль/л монен-сина (Sigma) втечение 4 часов при температуре 37°С в полистироловых 12 х 75 ммпробиркахспробками (Falcon). Нестимулированный контроль инкубировали в тех же условиях в присутствии моненсина без добавления КПС. После инкубации клетки окрашивали антиген-специфическиемоноклональными антителами для поверхностных маркеров (CD3-FITC, CD56-APC), лизировали эритроциты (BD FACS Lysing Solution), клетки пермеабилизовали (BD FACS Permeabilizing Solution) и отмывали. Далее для выявления внутриклеточных цитокинов добавляли конъюгированные с РЕМКА к IL-12, TNF-a или1КК-у. После отмывки клетки ресуспендировали в 500 мкл 1% параформальдегида и анализировали образцы на проточном цитометре [6].
Результаты представлены как процент NKT-клеток, экспрессирующих соответствующие маркеры. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами непараметрической статистики, которые включали расчет медианы и квартильного размаха (разность значений 75-го и 25-го проценти-
ля), а также оценку различий с использованием критерия Вилкоксона для связанных групп.
Результаты и обсуждение
NKT-клетки, в отличие от других Т-клеток, могут осуществлять немедленный тип ответа на патогены без стадии антигензависимой дифференцировки, которая необходима для образования эффекторных Т-клеток. При активации NKT-клетки осуществляют быструю дегрануляцию и секрецию цитокинов, с помощью которых регулируют функции клеток врожденного иммунитета и участвуют в индукции и регуляции адаптивного иммунного ответа [7].
При активации NKT- клеток на их мембране регистрируется экспрессия маркера CD107a, который ха-рактеризуетсякактрансмембранный бело^АМР-1 (lysosomal associated membrane protein 1) и является маркером дегрануляции клеток [8]. Инкубациякле-ток крови с 10 мкг/мл КПС в течение 4 часов приводила к увеличению относительного количества NKT-клеток, экспрессирующих на поверхности CD107a, до 7,3±1,7% (контроль - 3,7±0,9%).
При увеличении концентрации КПС до 100 мкг/мл относительное количество субпопуляции CD107a-позитивных NKT-клеток возрастало до 14,0±3,1%. Исследование внутриклеточной продукции цито-кинов показало увеличение процента NKT-клеток, синтезирующих IL-12, TNF-a и IFN-y, после 20-часовой инкубации клеток крови с КПС (рис.).
Влияние КПС P. nigrifaciens на изменение внутриклеточного синтеза цитокинов NKT-лимфоцитами; * - р<0,05
Изменения относительного количества N0"-клеток, синтезирующих ^-10 под действием КПС, по сравнению с контролем не выявлено. Максимальный эффект КПС оказывал в отношенииувеличения процента NKТ-клеток, синтезирующих 1КК-у. Возможно, это связано с особенностью NKT-клеток. которые при распознавании эндогенных антигенов могут накапливать в клетках mRNA такого цитоки-на, как 1К^у, и быстро отвечать на дополнительный активационный сигнал его продукцией [9].
МКТ-клетки, продуцирующие цитокины, участвуют в регуляции иммунногоответа, который осуществляет-сяпутем активации как ТЫ-, так и ТЪ2-клеток и необходим для защиты организма от инфекций и развития опухолей. Наблюдаемое при активации КПС значительное возрастаниеуровня субпопуляций NKТ-клеток. синтезирующих №N-7, ^-12 и Т№-а, может свидетельствовать о влияния NKT-клеток на процесс дифферен-цировки CD4+ - клеток в Т-хелперы первого типа (ТЬ1) и усиления клеточно-опосредованного ответа.
70 ЗДОРОВЬЕ. МЕДИЦИНСКАЯ ЭКОЛОГИЯ. НАУКА 3 (70) - 2017
Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine»
Таким образом, КПС P. nigrifaciens, можетсти-мулировать немедленный неспецифический ответ NKT-клеток, запуская процесс дегрануляции, и регулировать адаптивный иммунный ответ за счет синтеза цитокинов IL-12, TNF-a, IFN-y.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование выполнено без привлечения спонсорских средств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Godfrey D.I., MacDonald H.R., Kronenberg M.M., Smyth M.J., Van Kaer L.NKT cells: what's in a name? Nat. Rev. Immunol. 2004; 4: 231-237. doi:10.1038/ nri1309.
2. Loza M.J, Metelitsa L.S., Perussia B.NKT and T cells: coordinate regulation ofNK-like phenotype and cytokine production. Eur. J. Immunol. 2002; 32: 3453-3462. doi: 10.1002/1521-4141(200212)32:12<3453::AID-IMMU3453>3.0.C0;2-D.
3. Bowman J.P. Bioactive compound synthetic capacity and ecological significance of marine bacterial genus Pseudoalteromonas. Mar. Drugs. 2007; 5: 220-241. doi:10.3390/md504220.
4. Смолина ТП., Запорожец ТС., Беседнова Н.Н. Изменение уровня экспрессии молекул адгезии клеток врожденного иммунитета человека гликополи-мерами морских бактерий // Антибиотики и химиотерапия. 2015; 60(34): 37-41.
5. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков А.А. и др. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonashaloplanktis KMM156 // Биоорган. химия. 1993; 19 (3): 327-336.
6. Foster B, Prussin C, Liu F, Whitmire J.K, Whit-ton J.L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry Curr. Protoc. Immunol. 2007; 6: Unit 6.24. doi: 10.1002/0471142735.im0624s78.
7. Colucci F., Caligiuri M.A, Di Santo J.P. What does it take to make a natural killer? Nat. Rev. Immunol. 2003; 3(5): 413-425. doi:10.1038/nri1088.
8. Betts M.R., Koup R.A. Detection of T-cell degranulation: CD107a and b. Methods Cell Biol. 2004; 75: 497-512. doi: 10.1016/S0091-679X(04)75020-7.
9. Matsuda J.L., Gapin L., Baron J.L., Sidobre S., Stetson D.B, Mohrs M., Locksley R.M, Kronenberg M. Mouse V alpha 14i natural killer T cells are resistant to cytokine polarization in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 8395-8400. doi:10.1073/ pnas.1332805100.
Сведения об авторе
Смолина Tатьяна Павловна - к.б.н., в.н.с., НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; e-mail: [email protected].
© Коллектив авторов, 2017 г doi: 10.5281/zenodo.820664
Удк 612.017.1; 615.371; 577.114; 578.891
Е.В. Персиянова1, Т.А. Кузнецова1, А.Л. Шутикова1, С.П. Ермакова2
усиление иммунного ответа к поверхностному антигену гепатита в Под влиянием ФУкоидАнов ИЗ бурой водоросли FUCUS EVANESCENS
1 ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», Владивосток
2 Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток
Проведена оценка влияния сульфатированных полисахаридов (фукоидана и его модифицированных образцов) из бурой водоросли Fucus evanescens на специфический иммунный ответ мышей к поверхностному антигену гепатита В (HBs-антигену). Установлено, что все образцы фукоидана, различающиеся по степени очистки и молекулярной массе, усиливают иммуногенность рекомбинантного HBs-антигена при иммунизации мышей линии BALB/c. Адъювантное действие фукоиданов сопоставимо с действием гидроксида алюминия.
Ключевые слова: иммунный ответ, профилактические вакцины, фукоиданы, адъюванты, гепатит В.
E.V. Persiyanova1, T.A. Kuznetsova1, A.L. Shutikova1, S.P. Ermakova2
THE INCREASING oF IMMUNE RESPoNSE TO SURFACE ANTIGEN oF HEPATITIS B
UNDER FUCoidan from FUCUS EVANESCENS influence
1 G.P. Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia
2 G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Vladivostok, Russia
The authors investigated the effect of sulfated polysaccharides, fucoidans, from brown algae Fucus evanescens on the specific immune response of mice to hepatitis B. It was found that fucoidans with different degrees of
