CC BY
30
УДК 616.517:612.015
Т.Г. Рукша, В.И. Прохоренков, А.Б. Салмина, А.А. Савченко
МОДУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ЛИГАНДАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ БЕНЗОДИАЗЕПИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ*
Красноярская государственная медицинская академия М3 РФ Красноярский государственный университет
Исследована экспрессия и функциональная активность периферических бензодиазепиновых рецепторов в нейтрофилах периферической крови больных псориазом и здоровых людей. Инкубация ней-трофилов с лигандом периферических бензодиазепиновых рецепторов - ингибитором связывания диазепама - приводит к стимуляции “респираторного взрыва” нейтрофилов периферической крови у больных псориазом, но не у здоровых людей.
Ключевые слова: псориаз, периферические бензодиазепиновые рецепторы, ингибитор связывания диазепама
Псориаз - широко распространенное кожное заболевание с характерной воспалительной реакцией в эпидермисе и дерме, гиперпролиферацией кератино-цитов. Известно, что при псориазе происходит инфильтрация эпидермиса лимфоцитами, взаимодействие которых с кератиноцитами, вероятно, является инициирующим фактором в развитии воспаления [3, 7]. С другой стороны, некоторые авторы считают, что к миграции лимфоцитов в эпидермис и запуску каскада патологических реакций приводит участие различных суперантигенов. Было выявлено, что нанесение на кожу больных псориазом стрептококкового и стафилококкового токсинов вызывает повышение экспрессии НЬЛ-БК и увеличение уровня мРНК фактора некроза опухоли-а [8]. Известно также, что в эпидермисе больных псориазом определяются скопления нейтрофилов. Одной из особенностей патогенеза псориаза является развитие системных иммунопатологических реакций.
Существуют данные о высокой экспрессии периферических бензодиазепиновых рецепторов в фагоцитирующих клетках периферической крови, которые характеризуются также высокой генерацией активных форм кислорода. Обнаружена корреляция между резистентностью клеток к цитотоксическому эффекту Н2О2 и экспрессией периферических бензодиазепиновых рецепторов [4]. Вероятна роль периферических бензодиазепиновых рецепторов в защите клеток от повреждения свободными радикалами. Эк-стернализация фосфатидилсерина, характерная для апоптоза, в фагоцитах опосредована активностью НАДФН-оксидазы, генерирующей активные формы кислорода [2]. Таким образом, экспрессия периферических бензодиазепиновых рецепторов в фагоцитирующих клетках может быть важным компонентом регуляции запрограммированной клеточной гибели
после выполнения этими клетками функции фагоцитоза и презентации антигена.
С учетом вышеизложенного мы исследовали функциональную активность нейтрофилов периферической крови больных псориазом методом хемилюми-несценции, а также экспрессию в них периферических бензодиазепиновых рецепторов и модуляцию активности нейтрофилов лигандом периферических бензодиазепиновых рецепторов.
Методика. Исследования выполнены на образцах периферической крови 30 больных с диагнозом -“Вульгарный псориаз”, проходивших стационарное лечение в Красноярском краевом кожновенерологическом диспансере, и 15 человек - контрольной группы.
Среди пациентов 50% были мужчины, 50% - женщины. Средний возраст пациентов составил 34,2+2,8 лет. Больные получали традиционную десенсибилизирующую терапию.
Венозную кровь у больных псориазом и у здоровых людей забирали в количестве 15 мл между 8 и 9 часами утра натощак; добавляли 80 ЕД гепарина. Лейкоцитарный супернатант после осаждения переносили в чистые центрифужные пробирки и трижды отмывали в растворе Хенкса по 5 минут при 1500 об/мин. После третьего центрифугирования удаляли супернатант; оставшиеся клетки ресуспензировали в растворе Хенкса в концентрации 1 млн клеток на 1 мл среды. Состав реакционной смеси - 100 мкл люмино-ла, 400 мкл раствора Хенкса (380 мкл в случае индуцированной хемилюминесценции с добавлением 20 мкл зимозана), 400 мкл клеток. Производилась оценка спонтанной и зимозаниндуцированной хемилюминесценции в течение 90 мин на 36-канальном хеми-люминесцентном анализаторе СЬ 3604 (СКТБ “Наука”, Красноярск). Регистрация результатов и управ-
* Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для молодых докторов наук № МД-305.2003.04 (А.Б.С.).
ление хемилюминесцентным анализатором осуществлялись через микроЭВМ IBM/PC/AT.
В отдельных сериях экспериментов исследование спонтанной и индуцированной хемилюминесценции производилось на фоне инкубации клеток с ингибитором связывания диазепама (лигандом периферических бензодиазепиновых рецепторов) (Sigma) (10 нМ, 100 нМ).
Моноклональные антитела к периферическим бензодиазепиновым рецепторам были любезно предоставлены профессором V. Papadopoulos (Ge- orge Town University, USA). В качестве вторичных антител использована система детекции “Super Stain System” (HRP)-DAB (IDLabs Inc., Canada).
Для определения экспрессии периферических бензодиазепиновых рецепторов в нейтрофилах приготавливали тонкий мазок суспензии лейкоцитов, окрашивали его согласно протоколу иммуноцитохи-мического исследования [1], затем докрашивали ядра гематоксилином. Количество клеток с экспрессией периферических бензодиазепиновых рецепторов оценивалось на 100 нейтрофилов.
Статистическая обработка результатов исследований проведена с использованием критерия W Уилкоксона.
Результаты. У больных псориазом отмечалось достоверное увеличение показателей спонтанной и индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови, причем в стадии регресса значение этих показателей уменьшалось, не достигая, однако, уровня контрольной группы.
Инкубация нейтрофилов с ингибитором связывания диазепама в дозе 10 и 100 нмоль в течение 90 мин не вела к изменению интенсивности “дыхательного взрыва” нейтрофилов периферической крови в контрольной группе. Однако при инкубации с ингибитором связывания диазепама (10 нмоль, 90 мин) нейтрофилов крови больных псориазом в стадии прогрессии заболевания отмечалось достоверное увеличение показателя площади кривой спонтанной хемилюминесценции (S) (рис.). Выраженность ответа нейтрофилов на действие лиганда периферических бензодиазепиновых рецепторов в этой дозе не менялась при достижении ремиссии. При увеличении дозы агониста до 100 нмоль его эффект нивелировался.
При иммуноцитохимическом исследовании лейкоцитов периферической крови мы обнаружили, что экспрессия периферических бензодиазепиновых рецепторов определялась практически во всей популяции нейтрофилов и у здоровых людей, и в группах больных псориазом независимо от длительности заболевания или стадии процесса (табл.). Периферические бензодиазепиновые рецепторы определялись на цитоплазматической мембране и во внутриклеточных структурах.
Заключение. Определяемая нами увеличенная функциональная активность нейтрофилов периферической крови, регистрируемая по уровню интенсивности “дыхательного взрыва”, на фоне проводимой терапии изменялась незначительно. Это подтвержда-
ет, что клиническое улучшение не всегда сразу коррелирует с изменениями выраженности патологических реакций, происходящих в организме.
С другой стороны, усиленная активность нейтрофилов периферической крови в стадии прогрессирования псориаза может отражать характер “антигенной нагрузки”. В стадии регресса на роль таких антигенов, с нашей точки зрения, могут претендовать антигенные молекулы, сконцентрированные на поверхности апоптотических телец и мембранных микрочастиц, формируемых при гибели клеток. Эти структуры несут на себе большое количество клеточных, в т. ч. модифицированных, антигенов и могут становиться причиной аутоиммунной патологии, по аналогии с механизмом, описанным при системной красной волчанке: в гибнущих путем апоптоза кератино-цитах внутриклеточные антигены в силу невыясненных механизмов формируют кластеры на поверхности мембранных микрочастиц (результат блеббинга плазматической мембраны) и апоптотических телец. При неэффективности клиренса телец или микрочастиц тканевыми фагоцитами (например, при дефиците СЦ белка системы комплемента) эти структуры поступают в системный кровоток и становятся причиной аутоиммунизации [6].
Таким образом, уровень хемилюминесценции нейтрофилов крови может отражать не только степень активности процесса в коже, но и эффективность внутридермального фагоцитоза, активированного апоптозом кератиноцитов.
Кроме того, повышение уровня спонтанной хемилюминесценции нейтрофилов, увеличение продукции ими активных форм кислорода у больных псориазом указывают на изменения редокс-статуса организма, регистрируемые при этом заболевании. Отмечено, что ухудшение течения псориаза связано с усугублением окислительного стресса, увеличением образования продуктов перекисного окисления липидов, снижением интенсивности работы антиоксидан-тных систем кератиноцитов [5].
Селективный лиганд периферических бензодиазепиновых рецепторов (ингибитор связывания диазепама) обладает индуцирующим эффектом в отношении спонтанной хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови у больных псориазом, но не у здоровых людей. Наличие периферических бензодиазепиновых рецепторов в фагоцитирующих клетках, а также изменение их активности под воздействием агонистов периферических бензодиазепиновых рецепторов указывают на иммуномодулирующий эффект их лигандов при псориазе и патогенетическую роль периферических бензодиазепиновых рецепторов при этом заболевании. Вероятно, изучение роли периферических бензодиазепиновых рецепторов в патогенезе кожных заболеваний и модуляция их активности - перспективное направление дерматологии и патофизиологии. Что нуждается в дополнительных исследованиях.
1 2 3 4 5
Рис. Показатели спонтанной хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови у больных псориазом и здоровых людей.
1 - больные псориазом с длительностью заболевания менее 10 лет (до лечения), 2 - больные псориазом с длительностью заболевания менее 10 лет (после лечения), 3 - больные псориазом с длительностью заболевания более 10 лет (до лечения), 4 - больные псориазом с длительностью заболевания более 10 лет (после лечения), 5 - контрольная группа; ** - достоверно по отношению к показателям без инкубации с ингибитором связывания диазепама
NEUTROPHIL FUNCTIONAL ACTIVITY MODULATION WITH PERIPHERAL BENZODIAZEPINE RECEPTORS LIGANDS
T.G. Ruksha, V.I. Prokhorenkov, A.B. Salmina,
A.A. Savchenko
Expression and functional activity of peripheral benzodiazepine receptors were studied in peripheral blood neutrophils of patients with psoriasis and in healthy people. Neutrophils incubations with DBI (perihperal benzodiazepine receptor ligand) increased the level of “respiratory burst” in psoriatic patients but not in healthy people.
ЛИТЕРАТУРА
1. Эллиниди B.H. Практическая иммуногистохимия: Метод. рекоменд. / В.Н. Эллиниди, Н.В. Аниксеева, НА. Максимова. СПб., 2002. 36 с.
2. Arroyo A., Modriansky M., Serikan F.B., Bello R.L. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. № 51. P. 49965-49975.
3. Bos J., De Rie M. // Immunol Today. 1999. Vol. 20. P. 40-45.
4. Carayon P., Portier M., Dussossoy D., Bord A. // Blood. 1996. Vol. 87. № 8. P. 3170-3178.
5. Rocha-Pereira P., Santos-Silva A., Rebelo I. et al. // Clin. Chim. Acta. 2001. Vol. 303 (1-2). P. 33-39.
6. Rosen A., Casciola-Rosen L., Ahearn J. // J. Exp. Med. 1995. Vol. 181. P. 1557-1561.
7. Strange P., Cooper K.D., Hansen E.R., Fisher G. // J. Invest. Dermatol. 1993. Vol. 101. P. 695-700.
8. Travers J., Hamid Q., Norris D. et al. // J. Clin. Invest. 1999. Vol. 104. P. 1181-1189.
Таблица
Экспрессия ПБР в нейтрофилах периферической крови
Показатели До лечения После лечения Контроль
Длительность заболевания 0-10 лет 11-20 лет 0-10 лет 11-20 лет
Уровень экспрессии, % 95,6 97,0 98,2 98,0 97,0
