CC BY
72
2015, том 17 [11]
УДК 615.26:615.451.3:616-003.214
МОДИФИКАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ ИЗ СИЛИКОНОВОГО КАУЧУКА:
ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ
Т.И. Карпунина , Д.Э. Якушева , Д.М. Кисельков ,
12
М. С. Великанова , Р.М. Якушев
1ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера» Минздрава России, г. Пермь, Россия, 614990 2
ФБУН «Институт технической химии» УрО РАН, г. Пермь, Россия, 614013
Аннотация. Проведена модификация поверхности полидиметилсилоксана (ПДМС) комбинированными физико-химическими методами. Методы заключаются в ионно-лучевой обработке с последующей прививкой акриловой кислоты и взаимодействии с химическими реагентами. Предполагается, что в результате модифицирования на поверхности появляются аминогруппы и координационно-связанные с аминогруппами ионы цинка. Методом оптической микроскопии изучено образование биопленок клиническими штаммами Staphylococcus epidermidis и Klebsiella pneumonia на исходной и модифицированных поверхностях. Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о значительном снижении микробной контаминации модифицированной поверхности силиконового каучука. Возможно применение предложенного способа для антибактериальной обработки медицинских изделий из силиконового каучука.
Ключевые слова: биоплёнки, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumonia, силиконовый каучук, модифицирование, ионно-лучевая обработка.
Введение. Начало широкого практического применения кремнийорганических соединений относится к сороковым годам ХХ в. Эти полимеры нашли широкое применение в разных областях, в том числе в производстве разнообразных медицинских изделий. В этой сфере силиконовый каучук, или полидиметилсилоксан, практически не имеет себе равных среди других полимерных материалов благодаря комплексу уникальных свойств: биоинертности и биостабильности,
гемосовместимости и устойчивости к стерилизационным воздействиям. Можно сказать, что практически нет ни одной области хирургии, в которой не использовались бы изделия из силиконового каучука, и нет ни одной области человеческого тела, в которую бы эти изделия не вводились на различные сроки [1]. С привлечением в медицинскую практику искусственных материалов существенное значение приобрела проблема инфекций, ассоциированных с образованием био-
—---------------------------—
~ 1 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
On line scientific @ educational Bulletin “Health and Education Millennium”, 2015. Vol. 17. No 11
--------£4040^9--------—
пленок на поверхности изделий медицинского назначения [2]. Несмотря на всестороннее изучение механизма формирования таких микробных сообществ, разработку подходов к профилактике их образования, многообещающих результатов, оптимальных методов предупреждения пленкообразования пока не существует [3; 4]. Как считает А.В. Голуб [5], «...в настоящий момент мы являемся свидетелями формирования новой ветви профилактической и терапевтической медицины, нуждающейся в разработке фармацевтических и нефармацевтических методов предупреждения образования биопленок или разрушения образовавшихся». Исследователями многих стран предпринимаются попытки снизить колонизационные и пленкообразующие эффекты контаминирующей микрофлоры за счет структурной и химической модификации поверхности, введения различных соединений с бактерицидными свойствами в поверхностный слой силиконовых изделий. Такой подход представляется актуальным и перспективным в решении проблемы имплант- и катетер-ассоциированных инфекций.
Целью настоящего исследования являлась комбинированная физическая и химическая обработка поверхности синтезированных лабораторных образцов полидиметилси-локсана (ПДМС) и сравнительное изучение формирования биопленок клиническими штаммами Staphylococcus epidermidis и Klebsiella pneumonia на исходной и модифицированных поверхностях.
Материалы и методы. Лабораторные образцы ПДМС синтезировались по следующей методике. К 100 масс. частям силокса-нового олигомера марки СКТН-1 добавляется 3 масс. части сшивающего агента — тетраэтоксисилана и 0,3 масс. части катализатора — дибутилдилаурината олова. Полученная смесь тщательно перемешивается и заливается в стеклянные или полимерные формы, выдерживается при комнатной температуре до полного отверждения в течение суток, ва-
куумируется в течение 2 час для удаления низкомолекулярных примесей. Полученные пластины толщиной 2—3 мм вынимают из формы и нарезают скальпелем на образцы размером примерно 10x10 см.
Образцы ПДМС помещались в вакуумную камеру ионно-лучевой установки (разработка Института электрофизики УрО РАН) и обрабатывались ионами азота в импульснопериодическом режиме. Задавались следующие параметры обработки: ускоряющее напряжение 20 кВ, плотность тока 3 мА/см2, частота импульсов 5 Гц, длительность импульса 0,3 мс, доза обработки 1014 ион/см2 (1000 импульсов).
Последующее химическое модифицирование поверхности, активированной ионным пучком, осуществлялось в несколько стадий.
1. Выдержка в акриловой кислоте в течение 1 часа;
Следующие стадии проводились по методике, описанной в [6], с небольшими модификациями.
2. Приготовили реакционную смесь, содержащую эпихлоргидрин в слабощелочной водно-спиртовой среде. Поместили образцы и перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 6 часов;
3. Промытые дистиллированной водой образцы поместили в водный раствор этилендиамина и перемешивали на магнитной мешалке при температуре 50—60 °С в течение 2 часов.
Таким способом получили образцы № 1, поверхность которых функционализирована аминогруппами (в дальнейшем способ модифицирования № 1). Образцы № 2 отличаются тем, что добавляется стадия 4, в результате которой происходит комплексообразование поверхностных аминогрупп с ионами цинка (в дальнейшем способ модифицирования № 2):
4. Образцы поместили в водный 20%-ный раствор ZnCl2 и перемешивали на магнитной мешалке при температуре 50 °С в течение 1 часа.
~ 2 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
Карпунина Т.И. и др. Модификация поверхности медицинских изделий из силиконового каучука...
—-----------------------■—
Из исследуемых образцов были изготовлены диски диаметром 5 мм, которые после стерилизации помещали в 96-луночные плоскодонные планшеты («Медполимер», Россия) из полистирола. В лунки вносили по 150 мкл суточной бульонной культуры бактерий, предварительно стандартизованной до 2,0 по McFarland и разведенной в LB-бульоне 1 : 100. В качестве отрицательного контроля вносили по 150 мкл стерильного LB-бульона. Опыт ставили в 4-х повторностях. Планшеты закрывали крышкой и инкубировали статически во влажной камере в термостате при температуре 37 °С в течении 48—96 ч. После экспозиции из лунок удаляли планктонные клетки и диски тщательно промывали
дистиллированной водой. Образовавшиеся биопленки окрашивали 0,1% раствором водного генцианвиолета. Пленкообразование оценивали с помощью оптического микроскопа Olympus BX-51 (Япония).
Результаты и обсуждение. Как показали исследования (рис. 1 а, б), на поверхности исходного ПДМС и грамположительные, и грамотрицательные бактерии проявляли способность к формированию биопленок. Как и можно было ожидать, K. pneumonia формировали более массивные микроконсорциумы с гомогенной и плотной структурой, очевидно, благодаря активному синтезу полимерного межмикробного матрикса.
а
X
б
Рис. 1. Биопленки, сформированные на исходной поверхности образца ПДМС (а) грамположительными (S. epidermidis) и (б) грамотрицательными (K. pneumonia) бактериями
Использованные способы химической модификации поверхности литьевых образцов из ПДМС во всех случаях снижали интенсивность пленкообразования, однако степень выраженности наблюдаемых эффектов различалась. Отличия обусловливались как физико-химическими свойствами поверхностного слоя анализируемых образцов, так и индивидуальными особенностями исследуемых бактериальных штаммов.
Способ модифицирования № 1, т.е. введение в структуру макромолекул поверхностного слоя аминогрупп, в большей степени снижал пленкообразующую способность K. pneumonia (рис. 2 б), причем по прошест-
вии 2-х суток адгезированные клетки клебси-елл практически не регистрировались и только к концу 4-х суток стали обнаруживаться единичные, либо ассоциированные в небольшие группы бактерии. Интенсивность пленкообразования снижалась и у эпидермальных стафилококков (рис. 2 а), хотя спустя 96 часов на большей части анализируемой поверхности образца можно было увидеть не только одиночные, но и образующие многоклеточные скопления шаровидные клетки.
Способ обработки № 2, т. е. введение в структуру поверхностного слоя комплексных соединений цинка, также приводил к подавлению пленкообразования, но прослежен-
—---------------------------—
~ 3 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
On line scientific @ educational Bulletin “Health and Education Millennium”, 2015. Vol. 17. No 11
—-------£4040^9--------—
ные тенденции в отклике грамположитель-ных (рис. 2 в) и грамотрицательных (рис. 2 г) бактерий на преобразование химической структуры и топографии поверхности образцов отличались от установленных в первом случае. Такая обработка в большей степени влияла на пленкообразующую способность стафилококков по сравнению с клебсиеллами.
Обращало на себя внимание обилие более или менее выраженных микротрещин на обработанной поверхности, что в ряде случаев, на наш взгляд, могло служить триггером пленкообразования, поскольку неспецифическая адгезия — начальный этап в формировании биопленки — в значительной степени обусловлена зарядом колонизируемого объ-
екта. Однако даже наличие микротрещин не приводит к нивелированию антибактериального эффекта предложенных способов химической модификации поверхности ПДМС. Повреждения поверхностного слоя связаны с достаточно высокой дозой ионно-лучевой обработки данных образцов — 1000 импульсов. Отмечается также изменение цвета — исходный образец бесцветный, а после ИЛО — желтоватый вследствие образования углеродных графитоподобных структур. То есть наблюдаемые внешние изменения связаны с процессами частичной деструкции и сшивания макромолекул и карбонизации, обычно протекающих в поверхностном слое полимерных материалов после ИЛО [7].
а
б
в
г
Рис. 2. Формирование биопленок S. epidermdis (а, в) и K. pneumonia (б, г) на поверхности образца ПДМС, модифицированного способами № 1 и 2 соответственно
~ 4 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
Карпунина Т.И. и др. Модификация поверхности медицинских изделий из силиконового каучука...
------------------------■—
Поэтому предполагается, что дальнейшая отработка технологии комбинированного модифицирования позволит применить более щадящую дозу ИЛО с точки зрения топологии и химической структуры поверхности или заменить это воздействие плазмой тлеющего разряда.
Заключение. Как следует из полученных результатов, модификация предлагаемыми способами поверхности ПДМС в значительной степени влияет на формирование биопленок представителями различных бактериальных таксонов. Прослеженные эффекты могут быть связаны как с гидрофилизацией поверхности, так и изменением поверхностного заряда образцов, что снижает неспецифическую адгезию микробных клеток и в большей степени влияет на начальных этапах пленкообразования. В дальнейшем сдерживающим фактором могут служить бактерицидные свойства химических соединений, и функциональных групп привитых на поверхность полимерного изделия. Таким образом, полученные в данной работе предварительные результаты свидетельствуют о снижении микробной контаминации модифицированной поверхности силиконового каучука. Целесообразно продолжить комплексные исследования с использованием физико-химических способов модификации поверхности полимерных материалов медицинского назначения, направленные на по-
давление и предупреждение формирования биопленок бактериями — возбудителями инфекций.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 14-03-96013р_урал_а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Advanced polymers in medicine. Ed. by F. Puoci. Springer. 2015. 513P.
2. Treter J., Macedo A.J. Catheters: a suitable surface for biofilm formation // Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. Ed. by A. Mendez-Vilas. Formatex Research Center. 2011. P. 835—842.
3. Campoccia D., Montanaro L., Arciola C.R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces // Biomaterials. 2013. V. 34. P. 8533—8554.
4. Green J.D., Fulghum T., Nordhaus M.A. Review of immobilized antimicrobial agents and methods for testing // Biointerfaces. 2011. V. 6. No 4. P. 13—28.
5. Голуб А.В. Бактериальные пленки — новая цель терапии? // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2012. Т. 14. № 1. С. 23—29.
6. Mekewi M., El-Sayed A.A., Amin M.S., Said H.I. Imparting permanent antimicrobial activity onto viscose and acrylic fibers // Int J Biol Macro-mol. 2012. V. 50. P. 1055—1062.
7. Ektessabi A.M., Sano T. Sputtering and thermal effect during ion microbeam patterning of polymeric films // Rev. Sci. Instrum. 2000. V. 71. Is. 2. P. 1012—1015.
SURFACE MODIFICATION OF SILICON RUBBER MEDICAL DEVICES:
PROBLEMS AND PERSPECTIVES
T.I. Karpunina , D.E. Yakusheva , D.M. Kiselkov ,
12 M.S. Velikanova , R.M. Yakushev
1Perm State Medical University by academician E.A. Vagner, Perm, Russia 2
Institute of Technical chemistry, The Ural Branch of Russian academy of sciences, Perm, Russia
Annotation. Modification of polydimethylsiloxane (PDMS) surface by combined physical and chemical methods has been carried out. The method consists in ion-beam treatment followed by grafting of acrylic acid and interaction with chemicals. As a result, aminogroups and coordination compounds of the zinc(II) ion have been
-----------------------
~ 5 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
On line scientific @ educational Bulletin “Health and Education Millennium”, 2015. Vol. 17. No 11
---------£4040^9---------—
assumed to appear on the polymer surface. The biofilms of Staphylococcus epidermidis and Klebsiella pneumonia clinical strains adhered to the initial and modified surfaces has been studied by optical microscopy. In this paper microbial contamination of surface modified silicone rubber was shown to be significantly reduced. This modification technique can be suggested for antibacterial treatment of medical devices made of silicon rubber.
Key words: biofilms, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumonia, silicone rubber, modification, ion-beam treatment.
REFERENCES
1. Advanced polymers in medicine. Ed. by F. Puoci. Springer. 2015. 513 P.
2. Treter J., Macedo A.J. Catheters: a suitable surface for biofilm formation. “Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances” ed. by A. Mendez-Vilas. Formatex Research Center. 2011. Pp. 835— 842.
3. Campoccia D., Montanaro L., Arciola C.R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials, 2013, vol. 34, pp. 8533—8554.
4. Green J.D., Fulghum T., Nordhaus M.A. Review of immobilized antimicrobial agents and
methods for testing. Biointerfaces, 2011, vol. 6, no 4, pp. 13—28.
5. Golub A.V. Bacterial biofilms — new aim of therapy? Rus. J. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy, 2012, vol. 14, no. 1, pp. 23—29. (In Russian).
6. Mekewi M., El-Sayed A.A., Amin M.S., Said H.I. Imparting permanent antimicrobial activity onto viscose and acrylic fibers. Int J Biol Macromol, 2012, vol. 50, pp. 1055—1062.
7. Ektessabi A.M., Sano T. Sputtering and thermal effect during ion microbeam patterning of polymeric films. Rev. Sci. Instrum., 2000, vol. 71, Is. 2, pp. 1012—1015.
