CC BY
72
&___________
ПРАКТИКУМ
БИОМЕДИЦИНА • № 6 2007, с. 161-163
Модификация метода реципрокной трансплантации кожи у лабораторных мышей
Т.Б.Бескова
Научный Центр Биомедицинских Технологий РАМН, Москва
Изменена форма трансплантата. В результате этого сокращёно время операции и уменьшена смертность оперируемых мышей.
Ключевые слова: трансплантация кожи, инбредные мыши, гомозиготность.
Метод реципрокной изотрансплантации кожи широко применяется при разведении линейных мышей и крыс для контроля генетической однородности [1, 2] и для идентификации гаплотипов инбред-ных линий [3, 7]. Существует целый ряд методов, используемых в тех же целях: изучение генов окраски, применение имму-ногенетических и биохимических маркеров (электрофорез белков крови, методы, основанные на полимеразной цепной реакции), мандибулярный анализ, анализ кариотипа (для линий с хромосомными перестройками), определение доли при-центромерного гетерохроматина [5-8]. Поскольку совместимость тканей является полигенным признаком, достоинства метода трансплантации кожи заключаются в контроле гомозиготности по большому числу генов, позволяющем своевременно обнаружить генетическое засорение и слабые генетические различия, обусловленные остаточной гетерозиготностью или мутациями. Кроме того, этот метод даёт возможность повторно использовать животных для подтверждения результата и относительная прост в техническом смысле.
Руководства по применению метода издавались многократно, очень подробно методика описана З. К. Бландовой [1]. Поэтому здесь я остановлюсь только на некоторых изменениях, к которым пришла в результате собственного практиче-
ского опыта. Вероятно эти советы будут полезны не только начинающим, но и тем, кто, практикует этот метод уже давно, но не в таком объеме, чтобы «набить руку» до автоматизма.
Как правило, набольшее затруднение вызывает определение времени наркоза, так чтобы животное не погибло и не проснулось раньше времени. Переносимость применяемого обычно эфирного наркоза не только различна у разных линий, но зависит еще от многих факторов: пола, возраста, состояния животного, даже от атмосферных процессов во время операции. В любом случае желательно сократить пребывание животного под наркозом до минимума. Как ускорить проведение операции? Во-первых, сэкономить время можно, изменив форму трансплантата и главное — соответствующего «окошка» — ложа. Как известно, по классической методике пересадки кожи с хвоста на бок рекомендуется у наркотизированной мыши на подготовленном поле в области спины выстричь 2-3 квадратных окошка размером 10-12 кв. мм. Эту (основную!) часть работы можно ускорить в четыре раза, если окошки делать не прямоугольными, а овальными, для чего следует, оттянув кожу пинцетом, сделать ножницами одноединственное режущее движение непосредственно под кончиками пинцета. Ножницы должны быть развернуты вдоль
тела животного. Разумеется, с овальным окошком плохо совместим трансплантат прямоугольной формы. Но почти идеально, учитывая растяжимость кожи, в овал ложится ромб. Сделать трансплантат ромбовидной формы не составит большой сложности. Для этого кожу, снятую с ампутированного кончика хвоста и разрезанную на продольные полосы, нужно далее нарезать на кусочки, развернув ножницы к продольной оси этих полос не под прямым, а под острым углом — трансплантаты получатся ромбическими (рис.).
В
Рис. Выкраивание трансплантатов ромбовидной формы
Стрелкой указано направление ножниц при нарезании трансплантатов из полоски кожи, снятой с хвоста, по отношению к продольной оси (линия А.В.) этой полоски.
Во-вторых, ускорить ход операции помогает предварительное приготовление повязок. Согласно методике, после пересадки трансплантатов, прежде чем перебинтовать животное лейкопластырем, на операционное поле накладывают четырехслойную
стерильную марлевую салфетку и закрепляют ее коллодием. Но, поскольку коллодий в настоящее время практически вышел из употребления, приходится прикреплять марлю к лейкопластырю, которым перебинтовывается животное. Чтобы не тратить время, в течение которого животное находится под наркозом, на отматывание, отрезание лейкопластыря и прикрепление к нему салфетки, следует подготовить повязки до того, как дать животному наркоз. Накануне операции автоклавируют обычные стеклянные банки объемом 0,8 или 1 литр, предварительно накрыв их металлическими крышками и плотно обернув бумагой. После подготовки трансплантатов отрезают кусок лейкопластыря и, прикрепив к нему марлю, опускают в стерильную банку так, чтобы конец с салфеткой не касался дна. Противоположный конец закрепляют у горловины банки и прикрываю ее крышкой. Можно подготовить сразу 3-4 таких повязки в одной банке и вести операции «конвейером». Кстати можно для повязок использовать и готовый бактерицидный пластырь, но в этом случае поверх он также закрепляется обычным 3-сантиметровым лейкопластырем, а стерильные салфетки все равно должны быть под рукой на случай кровоточивости ложа.
И последнее. Иногда для того, чтобы после операции помочь мыши поскорее выйти из наркоза, некоторые экспериментаторы дуют в мордочку животному, производя нечто вроде искусственного дыхания «изо рта в рот». Следует помнить, однако, о разнице в частоте дыхания человека и мыши. В подобном случае лучше подносить животное мордочкой к струе воздуха от вентилятора.
Всего за период с апреля 1997 г. по март 2005 г. в ходе плановых проверок племенных ядер мышей инбредных линий коллекционного фонда по классической методике было прооперировано 91 животное, а по модифицированной — 57. При
этом гибель животных, находившихся под наркозом сократилась с 9,9% ± 3,1 до 3,5% ± 2,5. Различие достоверно по второму порогу вероятности Р > 0,01, расчёты производили по методу Фишера [4]. Уровень отторжения трансплантатов по техническим причинам сократился с 8,7% до 4,8%, но разность не достоверна из-за малого количества мышей, прооперированных по видоизменённой методике. Предполагается накопление данных в ходе дальнейших проверок животных на генетическую однородность.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко А.М., Шмидт Е.Ф. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. М.: «Наука», 1983, с. 143-156.
2. Бландова З.К., Шмидт Е.Ф, Ратькин А.Э. Исследование гомозиготности мышей инбредных линий коллекционного фонда НИЛ Биомоделей АМН СССР. Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медикобиологических исследований, часть I. М., 1988, с. 63-68.
3. Ратькин А.Э., Бландова З.К. Идентификация гаплотипа Н-2 некоторых линий мышей из коллекционного фонда НИЛЭБМ АМН СССР. Проблемы сохранения и поддержания генетических коллекций лабораторных животных. Пущино, 1991, с. 52-58.
4. Плохинский Н.А. Биометрия. М.: Изд-во Московского университета, 1970, с. 130-132.
5. Cheah Y.C., Nadeau J.H., Pugh S., Paigen B. New murine polymorphisms detected by random amplified polymorphic DNA (RAPD) PCR and mapped by use of recombinant inbred strains. Mamm. Genome, 1994, v.5, No 12, 762-767.
6. Iakouboba O.A., Olsson C.L., Dains K.M., Choi J., Kalcheva I., Bentley L.G., Gunanan M., Hillman D., Louie J., Machrus M., West D.B. Microsatellite marker panels for use in high-throughput genotiping of mouse crosses. Physiol. Genomics., 2000, v. 3, p. 145-148.
7. Klein J. H-2 Mutations: Their Genetics and Effect on Immune Functions, Advances in immunology. N.-Y.: 1978, v. 26, p. 64-67.
8. Namura T., EsakiK., Tomita T. Manual for genetic monitoring of inbred mice. ICLAS. Univ. Tokyo Press., 1984, p. 181-182.
MODIFICATION OF SKIN GRAFTING METHOD IN LABORATORY MICE T.B. Beskova
The Research Center for Biomedical Technologies of BAMS, Moscow
Key words: skin grafting, inbred mice, homozygosis.
The form of graft was changed. In consequence that, the duration of operations were diminished and the mice death-rate time during of operation was reduced.
