CC BY
22УДК 619:612.1:001.891.53
МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОБИЦИД-НОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРО-ФИЛОВ КРОВИ ЖИВОТНЫХ
Кораблева Т. Р., доктор ветеринарных наук, профессор; Сенчук И. В., кандидат ветеринарных наук, доцент; Скибин М. В., ассистент; Академия биоресурсов и природопользования ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского»
В статье приведены сведения о проведенной модификации методики определения активности микробицид-ной нейтрофилов крови животных, позволяющей ускорить оценку полученных результатов и увеличить точность выполненных исследований благодаря использованию в качестве детектора восстановления нитросинего тетразолия в диформазин графического редактора.
Ключевые слова: клеточный иммунитет, микробицидная активность, нейтрофилы, нитросиний тетразолий
MODIFICATION OF THE DETERMINATION METHOD OF MICROBICIDAL ACTIVITY OF NEUTROPHILS OF ANIMALS BLOOD
Korableva T. R., Doctor of Veterinary Science, Professor;
Sencnuk I. V., Candidate of Veterinary Science, Associate Professor; Skibin M. V., Assistant; Academy of Life and Environmental Sciences FSAEI HE «V. I. Vernadsky Crimean Federal University»
The article presents information of the modification of methodology for determining the microbicidal activity of blood neutrophils of animals, allowing to accelerate evaluation and increase the accuracy of the research owing to the use of the recovery detector of nitro blue tetrazole into diformazin of graphics editor.
Key words: cellular immunity, microbicidal activity, neutrophils, nitro blue tetrazole.
Введение. Одним из основных методов исследования функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов крови является тест с нитросиним тетразолием (НСТ). Он основан на способности бесцветного НСТ восстанавливаться кислородными радикалами в темно-синий диформазан.
В качестве прототипа методики нами выбран наиболее информативный способ исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови с использованием в качестве тест-системы лабораторного штамма Staphylococcus aureus P-209 (по Park B. H., Fikrig S. M., Smithwich E. M.). В ней результаты реакции регистрируют визуально или фотометрически. Однако визуальный учет НСТ-теста субъективен и не позволяет проводить количественной оценки активности нейтрофильных гранулоцитов. В то же время большинство фотометрических вариантов НСТ-теста используют токсические растворители и значительные объемы реагентов [1].
Также в литературе описаны способы определения поглотительной активности нейтрофилов периферической крови с использованием в качестве тест-системы окрашенных частиц латекса диаметром 3 мкм [2], исследования реакций бактериального фагоцитоза нейтрофилами капиллярной крови [3]. Существует также метод исследования метаболической активности нейтрофилов [4].
Каких-либо работ, описывающих экспресс-методы определения метаболической активности (показателя резерва) нейтрофилов периферической крови с использованием в качестве детектора восстановления нитросинего тетразолия в диформазан графических инструментов компьютерной программы-редактора изображений, в научной литературе не обнаружено.
Результаты и обсуждение. В основу модификации нами данной методики положено использование в качестве детектора восстановления нитросинего тетразолия в диформазан графических инструментов компьютерной программы-редактора изображений «PicPick». Результатом этого является сокращение времени, удешевление исследования без снижения чувствительности предложенного теста.
Методика подразумевает постановку стимулированного и нестимулиро-ванного (спонтанного) НСТ-теста, при этом оценка показателя резерва (ПР) микробицидной активности нейтрофилов крови проводится по определению индекса стимуляции НСТ-теста (ИС НСТ) - отношение % формазанпозитив-ных нейтрофилов в стимулированном НСТ-тесте к % формазанпозитивных нейтрофилов в нестимулированном (спонтанном) НСТ-тесте.
Реактивы. 1. 0,1% водный раствор нитросинего тетразолия (ч., х.ч., ч.д.а.): 0,1 г нитросинего тетразолия внести в мерную колбу на 100 мл и довести до метки физиологическим раствором. Тщательно перемешать!
2. 0,9 % раствор хлорида натрия (физиологический раствор). Раствор должен быть стерильным!
3. Суспензия инактивированной суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus штамм 209-Р на физиологическом растворе.
Оборудование. Термостат, пробирки, серологические планшеты, пипетки, весы, персональный компьютер, цифровой фотоаппарат.
Ход определения. Для постановки стимулированного НСТ-теста используют стабилизированную гепарином кровь, которую разливают по 0,1 мл в лунки серологических планшетов. Затем смешивают каждую пробу с 0,1 мл суспензии убитой суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus штамм 209-Р (тест-система), приготовленной на стерильном физиологическом растворе и добавляют по 0,1% водного раствора нитросинего тетразолия.
Для постановки нестимулированного НСТ-теста применяют стабилизированную гепарином кровь, которую разливают по 0,1 мл в лунки серологических планшетов, смешивают каждую пробу со 0,1 мл стерильного физиологического раствора и с 0,1 %-ным водным раствором нитросинего тетразолия (НСТ).
Для контроля следует внести в каждую лунку по 0,1 мл суспензии убитой суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus и 0,1 %-ным водным раствором нитросинего тетразолия, смешать с 0,1 мл стерильного физиологического раствора.
Для обеспечения идентичности условий проведения реакции оценки стимулированного и нестимулированного НСТ-теста необходимо использовать один микробиологический планшет.
При этом рекомендуется придерживаться следующего расположения: верхний ряд лунок планшета - контроль, второй ряд сверху - нестимулиро-ванный (спонтанный) НСТ-тест, нижний ряд лунок планшета - стимулированный НСТ-тест.
После этого проводят инкубирование в термостате в течение 30 мин. при 37±0,1 °С.
После инкубации лунки серологических планшетов с исследуемой кровью фотографируют, изображение переносят в виде файла (в формате jpg) на персональный компьютер. Результаты исследования мы предлагаем оценивать, используя программу-редактор изображения «PicPick». Выбор данного графического редактора обусловлен возможностью его бесплатного скачивания, возможностью установки на компьютер с небольшой производительностью с самыми распространенными операционными системами Microsoft Windows 10, 8.1, 8, 7, Vista, XP. В компьютерной программе «PicPick» с помощью опции «Новая задача» открывают фото-файл с зафиксированными результатами постановки НСТ-теста.
С помощью компьютерной мышки размещают курсор программы (курсор находится в опции «Графические инструменты») в центр изображения лунки с исследуемой кровью и проводят детекцию параметров цвета с помощью встроенной шкалы цветовой палитры. Устанавливают цифровые показатели, отражающие цветовую гамму красного цвета (параметр цветовой палитры обозначенный латинской буквой R) и синего цвета (параметр цветовой палитры обозначенный латинской буквой B). Определяют соотношение параметров красного и синего цвета в содержимом лунок исследуемой крови каждого животного по-отдельно-сти в стимулированном (параметр НСТс) и нестимулированном варианте постановки НСТ-теста (параметр НСТн). Расчитывают индекс стимуляции (ИС) НСТ как соотношение установленных показателей по формуле:
ИС = НСТс / НСТн.
Для определения сопоставимости полученных результатов параллельно использовали общепринятый цитологический метод определения показателей НСТ-теста (по Park B. H. at all., 1968), в котором оценка показателя резерва микробоцидной активности нейтрофилов крови проводится по определению индекса стимуляции НСТ-теста (ИС НСТ) - отношение % ПК в стимулированном НСТ-тесте к % ПК в нестимулированном (спонтанном) НСТ-тесте (где % ПК - процент формазан-позитивных клеток).
Исследование поглотительной фазы фагоцитоза и метаболической активности нейтрофилов периферической крови было проведено у больных диспепсией телят в возрасте 8-10 суток красной украинской породы (n=10). Показатели результатов оценки НСТ-теста нейтрофилов крови у телят представлены в таблице 1.
Из приведенных в таблице данных видно, что между показателями индекса стимуляции НСТ-теста, полученных по результатам общепринятого метода и модифицированной методики, отсутствует статистически достоверная разница. Это позволяет нам утверждать о сопоставимости полученных данных.
Выводы. Использование компьютерной программы редактирования изображений для детекции изменения цвета исследуемой крови при постановке НСТ-теста при восстановлении нитросинего тетразолия в синий диформазан позволяет осуществлять диагностику изменений микробицидного резерва ней-трофилов крови животных и не снижает его информативность. Способ позволяет существенно экономить время исследований, не требует дополнительных реактивов для окраски мазков крови с целью визуализации всех клеток крови, создает ранее неизвестную возможность экспресс-диагностики нарушений клеточного звена неспецифической реактивности животных, которые могут быть положены в основу диагностики различных патологических состояний.
Таблица 1. Показатели результатов оценки НСТ - теста нейтрофилов крови у телят М±m, (п=10)
Показатели общепринятого цитологического метода оценки результатов НСТ-теста (по Park B.H. at all., 1968) Показатели оценки результатов НСТ-теста с помощью компьютерной программы
стим. НСТ-тест, % спонт. НСТ-тест, % ИС НСТ стим. НСТ-тест спонт. НСТ-тест ИС НСТ
9,22±2,2 37,8±2,9 0,24±0,05 0,47± 0,06 1,66 ±0,23 0,28± 0,01
Список использованных источников:
1. Park B. H. Infection and nitroblue-tetrazolium reduction by neutrophils; a diagnostic aid / B. H. Park, S. M. Fik-rig, E. M. Smithwich // Lancet. - 1968. -Vol. 11. - № 2. - Р. 532-534.
2. Медведев А. Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза /А. Н. Медведев, В. В. Чаленко // Лабораторное дело. - 1991. - № 2. - С.19-20.
3. Диагностика изменений в микро-бицидной системе нейтрофильных гра-нулоцитов при аллергических заболеваниях / И. В. Нестерова, Л. И. Слынько, М. А. Светличная, Л. Г. Майченко // Методические рекомендации. - Краснодар, 1989. - С. 11-12.
4. Виксман М. Е. Характеристика опсонических факторов по реакции
References:
1. Park B. H. Infection and nitroblue-tetrazolium reduction by neutrophils; a diagnostic aid / B. H. Park, S. M. Fik-rig, E. M. Smithwich // Lancet. - 1968. -Vol. 11. - № 2. - P. 532-534.
2. Medvedev A. N. Method of study the absorption phase of phagocytosis / A. N. Medvedev, V. V. Chalenko // Laboratory work. - 1991. - № 2. - P. 19-20.
3. Diagnosis of changes in the micro-bicidal system of neutrophilic granulo-cytes in allergic diseases / I. V. Nesterov, L. I. Slynko, A. M. Svetlichnyi, L. G. Mis-chenko // Methodical recommendations. -Krasnodar, 1989. - P. 11-12.
4. Viksman M. E. Characteristics of panicacci factors in the reduction reaction nitro blue tetrazolium by human
восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами человека / М. Е. Виксман, А. Н. Маянский // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1980. -Т. 89. - № 2. - С. 214-215.
Сведения об авторах:
Кораблева Татьяна Рафаиловна -доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой микробиологии, эпизоотологии и ветсанэкспертизы Академии биоресурсов и природопользования ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского» e-mail: artemenkolp@gmail.ru, 295492, Республика Крым, г. Симферополь, п. Аграрное, Академия биоресурсов и природопользования ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского».
Сенчук Иван Викторович - кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры терапии и паразитологии Академии биоресурсов и природопользования ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского» e-mail: ivansenchuk_1981@mail. ru, 295492, Республика Крым, г. Симферополь, п. Аграрное, Академия биоресурсов и природопользования ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского».
Скибин Михаил Вячеславович -ассистент кафедры микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитар-ной экспертизы факультета ветеринарной медицины Академии биоресурсов и природопользования ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского» e-mail: bestvet zoo@gmail.com
neutrophils / M. E. Viksman, A. N. Ma-yansky // Bulletin of experimental biology and medicine, 1980, Vol. 89. -№ 2. - P. 214-215.
Information about the authors:
Korableva Tatiana Rafailovna -Doctor of Veterinary Science, Professor, the Head of the department of microbiology, epizootology and veterinary-sanitary examination of Academy of Life and Environmental Sciences FSAEI HE «V. I. Vernadsky Crimean Federal University», e-mail: artemenkolp@gmail.ru, Academy of Life and Environmental Sciences FSAEI HE «V. I. Vernadsky Crimean Federal University» 295492, Republic of Crimea, Simferopol, Agrarnoe.
Sinchuk Ivan Viktorovich - Candidate of Veterinary Sciences, Associate Professor department of therapy and para-sitology of Academy of Life and Environmental Sciences FSAEI HE «V. I. Ver-nadsky Crimean Federal University» e-mail: ivansenchuk_1981@mail.ru, Academy of Life and Environmental Sciences FSAEI HE «V. I. Vernadsky Crimean Federal University» 295492, Republic of Crimea, Simferopol, Agrarnoe.
Skibin Mikhail Vyacheslavovich -Assistant of the Department of Microbiology, Epizootology and Veterinary and Sanitary Expertise of the Faculty of Veterinary Medicine of the Academy of Life and Environmental Sciences FSAEI HE «V. I. Vernadsky Crimean Federal Uni-versity», e-mail: bestvetzoo@gmail.com Academy of Life and Environmental Sciences FSAEI HE «V. I. Vernadsky Crimean Federal University» 295492, Republic of Crimea, Simferopol, Agrarnoe.
