CC BY
77
УДК 579.61; 579.62
Уткина Т.М. 1, Попова Л.П. 1, Акжигитов А.С.2
1 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, Оренбург 2Оренбургский государственный аграрный университет E-mail: labpersist@mail.ru
МОДИФИКАЦИЯ ФАКТОРОВ ПЕРСИСТЕНЦИИ СТАФИЛОКОККОВ И MALASSEZIA PACHYDERMATIS ПРИ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ
Изучена модификация антилизоцимной активности и способности образовывать биопленки у стафилококков и Malassezia pachydermatis, выделенных от собак с отитами, в условиях их межмикробных взаимодействий. Установлено преимущественное обоюдное повышение экспрессии антилизоцимной активности и коэффициента биопленкообразования у изученных бактерий и грибов, а также приобретение ими способности образовывать биопленки. Полученные данные можно рассматривать как один из механизмов, способствующих образованию патобио-ценоза, на фоне которого возникает заболевание, и его хронизации.
Ключевые слова: стафилококки, Malassezia pachydermatis, антилизоцимная активность, биопленки.
Введение
В последнее десятилетие отмечается рост заболеваемости животных оппортунистическими инфекциями, вызываемыми грибковой микрофлорой [6]. Особый интерес представляют грибы рода Malassezia, являющиеся наиболее распространенными возбудителями отитов у собак. Грибы рода Malassezia, присутствуя в биоценозе, взаимодействуют с другими видами условно-патогенных микроорганизмов (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterobacteriaceae, Candida spp., Aspergillus spp.). В настоящее время накоплен фактический материал по взаимодействию Malassezia spp. с бактериями рода Staphylococcus [13]. Показано также, что рост Malassezia in vitro усиливается в присутствии стафилококков [15]. Однако, остается неизученным вопрос о влиянии данных микроорганизмов на персистентные свойства в микробной ассоциации. Одним из распространенных и часто встречающихся персистентных признаков является антилизоцимная активность микроорганизмов [2]. Важнейшим механизмом длительного выживания в условиях макроорганизма, а также внутрипопуляционной коммуникации микроорганизмов, является образование ими биопленок [9].
В связи с этим, целью данного исследования явилось изучение модификации антилизо-цимной активности и способности образовывать биопленки у стафилококков и M. pachydermatis, выделенных от собак с отитами, в условиях их межмикробных взаимодействий.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили 14 штаммов рода Staphylococcus: Staphylococcus intermedius (1 штамм), Staphylococcus xylosus (4 штамма), Staphylococcus hyicus (9 штаммов), а также 14 штаммов Malassezia pachydermatis, выделенных от 14 собак с хроническими отитами.
Исследуемый материал получали методом смывов с помощью тампона из наружного слухового прохода собак [7], засевали на среду Ли-минга-Нотманна (посевы инкубировали при 37оС в течение 48 часов), а также на кровяной агар (посевы инкубировали при 37оС в течение 18-24 часов).
Идентификацию грибов осуществляли по морфологическим и культуральным характеристикам [14], бактерии идентифицировали по морфологическим и культуральным свойствам, а также биохимическим характеристикам с использованием тест-систем «STAPHYtest».
Способность микроорганизмов к образованию биопленок определяли по степени связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах [16]. Коэффициент биопленкообразования (КБ) рассчитывали как отношение оптической плотности раствора кристаллического фиолетового, связавшегося с клетками микроорганизмов, к оптической плотности раствора в контроле. Положительными считали значения коэффициента более 1,1.
Естественные науки
Антилизоцимную активность (АЛА) микроорганизмов определяли фотометрическим методом [2].
Модификацию биологических свойств микроорганизмов исследовали при совместном культивировании в жидкой питательной среде ЬКЛ [5].
Статистическую обработку данных проводили биометрическими методами [8].
Результаты
В результате проведенных исследований было показано, что у больных животных в 60% случаев M. pachydermatis высеваются в ассоциации со стафилококками разных видов.
Все изученные штаммы стафилококков обладали антилизоцимной активностью. АЛА 5. hyicus колебалась в пределах от 0,1±0,001 мкг/мл до 0,82±0,02 мкг/мл (среднее значение признака составило 0,39±0,04 мкг/мл); у штаммов 5. xylosus значение признака колебалось от 0,1±0,003 мкг/мл до 0,7±0,03 мкг/мл (среднее значение признака 0,45±0,2 мкг/мл); у 5. mtermedшs АЛА была равна 0,5±0,01 мкг/мл.
После совместного культивирования с М. pachydermatis у 88,9% штаммов 5. hyicus способность к инактивации лизоцима увеличивалась на 18-68,3%; АЛА 50% штаммов 5. хуЬи повышалась на 42-78%. Снижение антилизоцим-ного признака отмечено у 11,1% штаммов 5. hyicus и 50% штаммов 5. xylosus на 42,9% и 22%, соответственно. Способность к инактивации лизоци-ма не изменялась у штамма 5. intermedius.
Антилизоцимная активность штаммов М. pachydermatis находилась в диапазоне от 0,8±0,01 мкг/мл до 2,0±0,05 мкг/мл, среднее значение признака составило 1,5±0,09 мкг/мл.
Под влиянием стафилококков у 57,1% штаммов грибов способность к инактивации лизоцима увеличивалась на 10-46%, у 35,7% штаммов - снижалась на 18-53%, а у 7,2% штаммов антилизоцимный признак оставался на прежнем уровне.
На следующем этапе работы было изучено взаимное влияние М. pachydermatis и стафилококков на способность образовывать биопленки.
До эксперимента лишь 5. intermedius и 11,1% штаммов 5. hyicus обладали этой способностью, КБ составлял 1,1 усл. ед. После совместного культивирования с М. pachydermatis способность образовывать биопленки приобретали все изу-
ченные штаммы S. xylosus, а также 77,8% штаммов S. hyicus. Отмечена потеря признака у 11,1% штаммов S. hyicus. У штамма S. intermedius способность к образованию биопленок сохранялась на прежнем уровне.
Среди M.pachydermatis 28,6% штаммов характеризовались способностью формировать биопленки, КБ составлял 1,1 усл. ед. После совместного культивирования со стафилококками 35,7% штаммов M. pachydermatis приобретало способность образовывать биопленки, у 7,1% штаммов коэффициент биопленкообразования повышался и составлял 1,2 усл. ед. Потеря признака отмечена у 14,3% штаммов M. pachydermatis.
Таким образом, проведенными исследованиями показано, что при межмикробных взаимодействиях изученные микроорганизмы оказывают разнонаправленное действие на факторы персистенции (стимулирующее, снижающее, индифферентное) с их преимущественным повышением.
Обсуждение
В результате проведенной работы установлено, что у больных животных в 60% случаев M. pachydermatis высеваются в ассоциации со стафилококками разных видов. Полученные данные подтверждаются исследованиями [12], показавшими, что в 50% случаев при отите у собак грибы рода Malassezia выделялись в ассоциации с бактериями рода Staphylococcus.
В условиях микробных ассоциаций между бактериями и грибами могут возникать неоднозначные взаимоотношения, что оказывает влияние на течение инфекционного процесса [6]. В подобных ситуациях многими исследователями существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности и персистенции, а также оценка характера взаимоотношений [4, 10].
Рядом авторов показано, что для оценки межмикробных взаимодействий в качестве биомишеней можно использовать персистентные свойства микроорганизмов (антилизоцимную активность и способность образовывать биопленки) [3].
Известно, что микроорганизмы, обладающие высокими значениями данных факторов персистенции, выделяются при хроническом или затяжном течении инфекционно-воспали-тельных заболеваний [1].
Уткина Т.М. и др.
Модификация факторов персистенции стафилококков..
Проведенными нами исследованиями установлено преимущественное обоюдное повышение экспрессии АЛА и КБ у изученных бактерий и грибов, а также приобретение ими способности образовывать биопленки при межмикробных взаимодействиях.
Взаимная стимуляция антилизоцимной активности и способности образовывать биопленки может быть одним из механизмов, способствующих формированию патологического микробиоценоза, на фоне которого возникает заболевание, и его хронизации.
2.10.2014
Список литературы:
1. Абрамзон О.М., Карташова О.Л., Валышев А.В. и др. Биологические свойства микроорганизмов как основа прогнозирования тяжести гнойно-воспалительных заболеваний легких и плевры // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2004. - №3. - С. 7-9.
2. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 1999. - 366 с.
3. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Перунова Н.Б. и др. Симбиоз и его роль в инфекции. Екатеринбург: УрО РАН, 2011. - 299 с.
4. Вахитов Т.Я. Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях. Автореф. дис.... докт. биол. наук. Санкт-Петербург, 2007. 40 с.
5. Ермоленко Е.И., Ждан-Пушкина С.Х., Суворов А.Н. Взаимодействие Candida albicans и Lactobacillus plantarum in vitro // Проблемы медицинской микологии. - 2004. - Т.6. - № 2. - С. 49-54.
6. Ершов П.П. Этиологическая значимость дрожжевых грибов рода Malassezia при кожных заболеваниях животных. Дис.. канд. вет. наук. Москва, 2008. 165 с.
7. Ивченко О.В. Диагностика малассезиозов животных. Дис. ... канд. вет. наук. Москва, 2010. 152 с.
8. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.
9. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Орлова О.Г. Структура и функция бактериальных биопленок симбиотических и условно-патогенных бактерий // Верхневолжский медицинский журнал. - Т.11. - Вып.4. - С. 37-42.
10. Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях: Автореф. дис.. канд. биол. наук. Оренбург, 2009. 22с.
11. Уткина Т.М., Акжигитов А.С., Нургалиева Р.М. Видовой состав и факторы персистенции микроорганизмов, выделенных от собак с отитами // Вестник ветеринарии. - 2014. - №2(69). - С.47-49.
12. Bornand V. Bacteriology and mycology of otitis externa in dogs // Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. - 1992. - № 134(7). -P.341-348.
13. Faergemann J. Atopic Dermatitis and Fungi // Clinical Microbiology Reviews. - 2002. - Vol.1. - №4. - P.545-563.
14. Mason I.S. A review of the biology of canine skin with respect to the commensals Staphylococcus intermedius, Demodex canis and Malassezia pachydermatis // Vet. Derm. - 1996. - № 7. - P.119-132.
15. O4Toole G. Biofilm formation as microbial development // Annu Rev Microbiol. - 2000. - № 54. - P.49-79.
Сведения об авторах:
Уткина Татьяна Михайловна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат биологических наук,
е-mail: pashkova070782@mail.ru
Попова Лидия Петровна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат медицинских наук,
е-mail: ploomy@list.ru
Акжигитов Абай Сансергалиевич, аспирант кафедры кафедры микробиологии и заразных болезней Оренбургского государственного аграрного университета, е-mail: abaj_akz@mail.ru
