CC BY
10
МОДИФИКАЦИЯ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА И ОКСИДА АЗОТА IN VITRO
А.К. Мартусевич, А.В. Дерюгина, А.А. Мартусевич
ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», Нижний Новгород, Россия
ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород, Россия
Abstract
We studied the influence of ozone (500 mcg/1), singlet oxygen and gaseous nitric oxide (20 and 100 ppm) on electrophoretic mobility of human erythrocytes in vitro. It was stated that exogenous agents (reactive oxygen species and nitric oxide) modified the electrokinetic properties of human erythrocytes specifically and dose-dependently. Ozone-oxygen gas mixture and high dose of nitric oxide (100 ppm) caused the decreasing of this parameter, low concentration of nitric oxide (20 ppm) did not change it, and blood processing with singlet oxygen lead to activation of electrophoretic mobility of human erythrocytes.
Изучали влияние озона (500 мкг/л), синглетного кислорода и оксида азота (20 и 100 ppm) на электрофоретическую подвижность эритроцитов человека in vitro. Показано, что экзогенные биорадикалы (активные формы кислорода и оксид азота) специфично и дозозависимо влияют на электрокинетические свойства эритроцитов человека. При этом озоно-кислородная смесь и высокие концентрации оксида азота (100 ppm) обеспечивают снижение данного показателя, более низкие количества NO (20 ppm) не оказывают на него значимого влияния, а обработка образцов крови синглетным кислородом приводит к усилению электрокинетической активности клеток крови.
Ключевые слова: эритроциты, электрофоретическая подвижность, озон, синглетный кислород, оксид азота
Известно, что активные формы кислорода (АФК) и азота, входящие в комплексное понятие «биорадикалы» [1, 2, 11], способны выступать в качестве универсальных молекулярных биорегуляторов, включающихся как в физиологические, так и патологические пути метаболизма [2, 11]. Показано их многогранное участие практически во всех компонентах обмена веществ [1, 2, 5, 7], причем результирующая биологического действия биорадикалов
непосредственно определяется дозой агента [6, 10]. Следует отметить, что в отношении этих соединений часто имеет место нелинейная зависимость «доза -эффект» [5].
С другой стороны, особенности реализации модулирующего влияния биорадикалов на живые системы, обусловленные их природой и физико-химическими свойствами, расшифрованы недостаточно полно. В частности, неизвестным остается характер воздействия биорадикалов на электрокинетические свойства эритроцитов. Ранее нашими исследованиями и работами других авторов было показано, что электрофоретическая подвижность эритроцитов (ЭФПЭ), являющаяся их количественной мерой, может рассматриваться как неспецифический индикатор состояния эритрона и его реакции на изменения гомеостаза и внешние воздействия на организм [3, 6, 8, 9, 12]. В то же время подобные сведения имеются лишь в отношении озона, причем они приводятся только в единичных публикациях [6]. На основании этого целью работы служило изучение электрофоретической подвижности эритроцитов при действии экзогенных активных форм кислорода и оксида азота на образцы крови человека in vitro.
Материал и методы исследования
Исследование выполнено на образцах крови 15 здоровых доноров. Каждый образец был разделен на 5 равных порций по 5 мл., первая из которых являлась контрольной (в ней не проводили никаких манипуляций), остальные барботировали различными газовыми смесями (единые параметры обработки для всех воздействий: объем газовой смеси - 100 мл., продолжительность барботирования - 3 мин.). Вторую порцию крови обрабатывали озоно-кислородной смесью (концентрация озона - 500 мкг/л), третью - синглетно-кислородной воздушной смесью (примененная мощность генератора - 100%), а четвертую и пятую - NO- содержащей газовой смесью (концентрация оксида азота - 20 и 100 ppm соответственно). Барботаж производили путем медленного (в течение 3 мин.) пропускания указанных газов через весь объем биологической жидкости, находящейся в стандартной стеклянной пробирке (выходное отверстие-выпускник газа находилось на дне пробирки). Продолжительность экспозиции после обработки - 5 мин.
Синтез озоно-кислородной смеси осуществляли с помощью озонатора «Медозонс-БМ» (Нижний Новгород, Россия). Генерацию холодной плазмы, насыщенной оксидом азота, выполняли аппаратом, созданным в Российском федеральном ядерном центре-Всероссийском НИИ экспериментальной физики (Саров, Россия). Воздушный поток, содержащий синглетный кислород, получали с применением аппарата «Airnergy» (Германия).
Из всех образцов крови выделяли эритроциты трехкратным отмыванием 0,85% раствором хлористого натрия с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об./мин. Измерение ЭФПЭ проводили методом микроэлектрофореза в собственной модификации [3, 6]. Суспензию эритроцитов (0,1%) помещали в 10 мМ трис-НО буфер (рН 7,4) и фиксировали перемещение клеток при силе тока 8 мА. Величину ЭФПЭ определяли по формуле: U= S/TH,
где S - расстояние, на которое перемещались клетки, Т - время перемещения клеток на расстояние S, Н - градиент потенциала.
Полученные данные были обработаны статистически в программном пакете Statistica 6.0. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Н-критерий Краскала-Уоллеса.
Результаты исследования
Установлено, что изучаемые экзогенные биорадикалы оказывают неодинаковое влияние на ЭФПЭ крови человека. Так, обе изучаемые АФК (озон и синглетный кислород) изменяют данный показатель, однако эти сдвиги разнонаправлены (рис. 1). В частности, барботирование крови озоно -кислородной смесью с концентрацией озона 500 мкг/л, что соответствует низким терапевтическим дозам [5, 7], инициирует существенное снижение значения параметра (на 22%; p<0,05 по сравнению с контрольным образцом), тогда как обработка биологической жидкости синглетно-кислородной газовой смесью вызывает умеренное повышение уровня ЭФПЭ (на 13% относительно контроля; p<0,05). Это обусловлено тем обстоятельством, что даже небольшие количества озона, введенные в биосреду, обеспечивают стимуляцию процессов липопероксидации [4-7], приводя к структурным перестройкам мембраны эритроцитов и, следовательно, изменению их электрокинетических характеристик.
Рис. 1. Электрофоретическая подвижность эритроцитов (мкм^см^В-1^с-1) при действии активных форм кислорода (* - статистическая значимость различий по
сравнению с контролем p<0,05)
Напротив, показанное нами ранее в экспериментах in vitro [5] и in vivo [4] антиоксидантное действие синглетного кислорода способствует стабилизации эритроцитарных мембран и повышению их устойчивости, что, в свою очередь, способствует увеличению подвижности клеток крови в электрическом поле.
Оценка влияния различных концентраций оксида азота на электрокинетические свойства эритроцитов позволила установить, что данное воздействие вызывает дозозависимое снижение уровня ЭФПЭ (рис. 2). При этом если при обработке крови относительно небольшим количеством NO (концентрация в газовой смеси - 20 ppm) эти сдвиги обнаруживаются лишь на уровне тенденции (p<0,1 по сравнению с контрольным образцом), то при барботаже биологической жидкости более высокой концентрацией оксида азота (100 ppm) выявлено снижение изучаемого параметра на 23% по отношению к контролю (p<0,05). По нашему мнению, подобный характер ответа биосистемы на введение NO связан с тем, что небольшие количества последнего, утилизируясь в процессе реализации его биорегуляторной активности [1, 11] и частично трансформируясь в депонирующие соединения (S-нитрозотиоды, динитрозильные комплексы железа с высоко- и низкомолекулярными лигандами [11]), не включаются в свободнорадикальные процессы, протекающие в плазме и клетках крови.
Рис. 2. Электрофоретическая подвижность эритроцитов (мкм^см^В-1^с-1) при действии оксида азота в различной концентрации (* - статистическая значимость
различий по сравнению с контролем p<0,05)
С другой стороны, обработка биожидкости более высокой концентрацией NO обеспечивает условия для формирования его неутилизированного избытка,
который способен трансформироваться в высокореактивные химические соединения, в частности пероксинитрит [10]. Обладая крайне высоким окислительным потенциалом, он может атаковать мембраны клеток крови, в том числе эритроцитов, потенцируя интенсивность свободнорадикальных процессов в них. Это, в свою очередь, приводит к изменению структуры эритроцитарных мембран и, как следствие, к сдвигам ЭФПЭ.
Заключение
На основании проведенных исследований показано, что экзогенные биорадикалы (активные формы кислорода и оксид азота) специфично и дозозависимо влияют на электрокинетические свойства эритроцитов человека в условиях in vitro. При этом озоно-кислородная смесь и высокие концентрации оксида азота (100 ppm) обеспечивают снижение данного показателя, более низкие количества NO (20 ppm) не оказывают на него значимого влияния, а обработка образцов крови синглетным кислородом приводит к усилению электрокинетической активности клеток крови.
Список литературы
1. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. М.: Вузовская книга, 2004. 360 с.
2. Костюк В.А., Потапович А.И. Биорадикалы и биоантиоксиданты. Минск: БГУ, 2004. 174 с.
3. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Изменение электрофоретической подвижности изолированных эритроцитов при действии стресс-факторов // Гематология и трансфузиология. 2011. №5. С. 18-21.
4. Мартусевич А.А., Соловьева А.Г., Мартусевич А.К. Влияние ингаляций синглетного кислорода на состояние про- и антиоксидантных систем крови и энергетический метаболизм // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013. Т. 156, №7. С. 51-53.
5. Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Перетягин С.П., Митрофанов В.Н. Оценка влияния некоторых физических факторов на энергетический метаболизм крови in vitro // Биомедицина. 2013. №1. С. 103-108.
6. Симутис И.С. Дерюгина А.В., Бояринов Г.А. с соавт. Изменение электрофоретической подвижности и формы эритроцитов при действии озона на эритроцитарную массу // Медиаль. 2013. №4. С. 20-21.
7. Перетягин С.П., Стручков А.А., Мартусевич А.К. с соавт Применение озона как средства детоксикации в раннем периоде ожоговой болезни // Скорая медицинская помощь. 2011. Т. 12, №3. С. 39-43.
8. Nihei Y., Asai H., Ukai T., Marimoto H., Nakajima Y., Hanajiri T., Maekawa T. Detection of surface immunoreactions on individual cells by electrophoretic mobility measurement in a micro-channel // Sensors and actuators. 2008. № 131. P. 285-289.
9. Sheremetev Y.A., Suslov F.I., Deriugina A.V., Sheremetev A.V. Effect of neuramidase and proteolytyc enzymes on electrophoretic mobility of erythrocytes and their aggregation induced by La // Biophysics. 2000. Vol. 45. №1. С. 79-82.
10. van der Vliet A.., Eiserich J.P., Halliwell B., Cross C.E. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 7617-7625.
11. Vanin A.F. Dinitrosyl-iron complexes with thiolate ligands: physico-chemistry, biochemistry and physiology // Nitric Oxide Biol. Chem. 2009. Vol. 21. P. 136-149.
12. Xie L., Sun D., Yao W., Wen Z. Microrheological characteristics of reticulocyte in vivo // Science in China. 2002. V.45. №1. P.50-55.
