Модификации питательной среды с использованием биотехнологических методов микроклонального размножения картофеля для культивирования в Омской области

Артюхова Светлана Ивановна; Киргизова Ирина Васильевна

УДК 504.75:339.138:338.439

С. И. АРТЮХОВА И. В. КИРГИЗОВА

Омский государственный технический университет

№

МОДИФИКАЦИИ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В ОМСКОЙ ОБЛАСТИ

В данной статье рассматривается современный биотехнологический метод, связанный с актуальной проблемой массового безвирусного размножения картофеля для Омской области, с целью получения отечественного безвирусного посадочного материала, свободного от вирусной инфекции в течение нескольких лет, и для дальнейшего использования в промышленном картофелеводстве Омской области. Выбранная тематика является наиболее актуальной для Омского региона, в связи с большим процентом заражения посевного материала картофеля вирусной инфекцией, приводящей к большим экономическим потерям.

Ключевые слова: микроклональное размножение, термотерапия, фитопатоге-ны, in vitro, фитогормоны.

Картофель является одной из важнейших сельскохозяйственных культур, которая широко используется как пищевой и кормовой продукт. Клубни картофеля содержат в среднем 22 % крахмала и 2 % белков, 1 % сахаров, витамины С, В1, В2, В6. В условиях современной рыночной экономики активно развивается отрасль пищевого производства по переработке картофеля в высококачественные продукты питания и крахмал.

Известно, что до 30 — 40 % потери урожая сельскохозяйственных культур вызывают вирусные инфекции. Растения картофеля, культивируемые на территории Омской области, подвержены поражению многими вирусами (X, У, Б, М, Ь и др.), а также вироидом веретеновидности картофеля (ВВКК). Инфекция снижает урожайность культуры, содержание крахмала в клубнях, влияет на другие качественные показатели. Пораженные растения сами становятся источником инфекции [1]. Важной особенностью картофеля является и то, что вследствие вегетативного размножения большинство поражающих его болезней передается через семенные клубни, которые и являются первичным источником инфекции для последующего заражения посадок. Картофель может поражаться болезнями на всех этапах жизненного цикла: до появления всходов, во время вегетации и в период хранения. Многие возбудители болезней способны также накапливаться и длительно сохраняться в почве.

Для Омской области эта актуальная проблема, в связи с широким распространением фитопато-генных вирусов и большими экономическими потерями за счет ухудшения качества посевного

материала и существенными потерями урожая картофеля. Так, по исследовательским данным ЗАО ТПК «Элита-картофель», картофель, используемый в промышленном картофелеводстве, практически на 100 % поражен тремя особо опасными для этой культуры вирусами — X, У и Б, а также вироидом веретеновидности клубней (ВВКК) [2].

Как показывают данные, импорт картофеля из стран ближнего и дальнего зарубежья не оправдывает себя с экономической и стратегической точки зрения, так как не производится контроль качества семенного и товарного картофеля. Повышение урожайности и устойчивости к болезням отечественных сортов картофеля является актуальной проблемой АПК [3]. Практика последних лет показала, что условия производства, система и механизмы государственного регулирования сельского хозяйства оказались недостаточными для формирования эффективного и конкурентоспособного, динамично развивающегося аграрного сектора экономики страны. Экономическая эффективность производства продукции в аграрной сфере остается низкой. Сложившиеся на рынке цены на продукцию сельского хозяйства не обеспечивают достаточную рентабельность производства и, соответственно, возможности расширенного воспроизводства основных средств и почвенного плодородия. Поэтому основными целями государственного регулирования сельского хозяйства на современном этапе выступают: развитие конкурентоспособного и устойчивого сельскохозяйственного производства.

Производство продовольственного картофеля при достаточно высокой урожайности является

Состав питательных сред, используемых для микрочеренкования in vitro (мг/л)

Таблица 1

Компоненты Среды для черенкования

МС МС-1 МС-2 МС-3 МС-4

Макросоли

NHNO, 1650 1650 1650 1650 1650

KNO, 1900 1900 1900 1900 1900

CaCl2 x 2H,O 440 440 440 440 440

MgSO4 x 7H2O 370 370 370 370 370

KH2P04 170 170 170 170 170

№2ЭДТА 37,3 37,3 37,3 37,3 37,3

Микросоли

н,во, 6,2 6,2 6,2 6,2 6,2

МИ8Э4 х 4Н,0 22,3 22,3 22,3 22,3 22,3

2и804 х 4Н,0 8,6 8,6 8,6 8,6 8,6

К1 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75

Си804 х 5Н,0 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025

№,мо04 х 2Н,0 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

СоС1, х 6Н20 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025

Тиамин 1,0 1,0 1,0 1,6 0,4

Пиридоксин 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Гибберелловая кислота - - - - -

Аскорбиновая кислота - - - 3,0 1,0

Кинетин - 1,0 1,0 0,25 1,0

ИУК - 1,0 1,0 1,0 -

БАП - - - - -

Феруловая кислота - - - - 1,0

Гидролизат казеина - 40 40 - -

Сахароза 20000 20000 20000 40000 20000

Агар 7000 - 7000 7000 7000

высокорентабельным по сравнению с другими видами сельскохозяйственных культур. Обязательным условием получения высоких урожаев картофеля является использование качественного семенного материала. В этой целью применяют современные биотехнологические методы получения оздоровленного картофеля.

Современное семеноводство картофеля широко использует биотехнологический метод апикальной меристемы для освобождения от вирусной инфекции. Схема производства безвирусных клубней включает получение микрорастений (клонов) картофеля, затем высадку их в теплице или под укрытия для избежания контакта с насекомыми, в результате чего получают супер-супер элиту (обычно в виде мини-клубней). При высадке микроклубней в полевые условия получают суперэлитный материал в виде клубней обычных размеров [4].

Элитный посадочный материал картофеля сохраняет устойчивость к вирусным заболеваниям и урожайность в течение 5 — 8 лет. Преимуществами биотехнологического метода являются: проведение круглогодичных работ, экологически чистое производство, экономическая эффективность (получение 4 — 5 черенков с одного пробирочного растения), безотходное производство, применение стандартного оборудования.

Целью данной работы является оптимизация состава питательной среды для роста и развития пробирочных растений in vitro с использованием биотехнологического метода микроклонального размножения картофеля.

Материалы и методы исследования. В качестве объектов исследования использовали сорта картофеля, культивируемые на территории Омской области: Беллароза, Зекура, Импала, Фелокс, Сантэ, Розара, Галла, Ароза, Мондиаль, Ред скарлетт, Удача, Колеттэ.

Работы по вычленению апикальных меристем, микрочеренкованию растений проводили в лами-нар — боксе (lamsystems) в асептических условиях, под бинокулярной лупой с 20-кратным увеличением в сочетании с методом термотерапии. Клубни предварительно выдерживали при температуре 37 — 380 С в термостате (термотерапия) для ингибирования бактериальной и грибной инфекции в течение 5 — 7 дней. В эксперименте исходный материал клубней отбирался из внешне здоровых кустов с явным отсутствием симптомов болезней. Растения выращивали при температуре 20 — 250 С и освещенности 8000 люкс при 16-часовом фотопериоде — день, 8 часов — ночь, относительной влажности 75 — 80 %.

Посуду и инструменты стерилизовали в стерилизаторе суховоздушном (Red Line-220) при температуре 2000 С в течение 3 часов.

Микрочеренкование проводили на питательной среде Мурасиге-Скуга (МС). Для размножения оздоровленных растений — регенерантов использовали методику микрочеренкования впервые предложенную Г. М. Винклером и Р. Г. Бутенко [5] .

Для модификации питательной среды использовались различные концентрации фитогормонов (ки-нетин — 0,25-1 мг/л, ИУК — 1 мг/л, НУК — 3 мг/л, феруловая кислота — 1 мг/л) и сахарозы от 1 до 4 %,

Этап 1 — первое черенкование микрорастений в условиях ламинар-бокса

Этап 2 — морфогенез клонов растений картофеля

Этап 3 — микрорастения картофеля, полученные in vitro с помощью клонального микроразмножения

Рис. 1. Этапы микроклонального размножения картофеля в условиях научно-производственной лаборатории «Прикладная биотехнология» ОмГТУ

>

в качестве контроля использовалась среда МС без регуляторов роста. Для сравнительной оценки роста пробирочных растений на жидкой и агаризо-ванной питательной среде применяли модифицированные нами питательные среды с внесением 2 % сахарозы и 1 мг/л кинетина (табл. 1).

Питательные среды готовили с содержанием макро- и микросолей по прописи Мурасиге — Скуга, витамины и регуляторы роста добавляли в среду перед использованием, использовали агар фирмы «Difco». Водородный показатель измеряли с применением рН-метра Меттлер Толедо, коррекцию проводили в пределах 5,7 — 5,8 с помощью 0,1 Н NaOH и 0,1 HCL. Стерилизацию питательных сред проводили авто-клавированием при 1 атм. в течение 20 минут.

Ускоренное размножение оздоровленных пробирочных растений проводили микроразмножением каждые 3 — 4 недели, среднее количество черенков составляло 4 — 5 штук с одного растения (рис. 1). В последующем выращивали в условиях закрытого, а затем открытого грунта.

При достижении пробирочных растений высоты 10—15 см растения проверялись на наличие вирусной инфекции методом иммунохроматогра-фических экспресс-тестов Bioreba и полимеразной цепной реакции. Микрорастения тестировались на наличие вирусной инфекции иммунохроматогра-фическими тест-полосками Bioreba (PVM AgriStip, PLRV AgriStip-magnetic, PYY AgriStip, PLRX AgriStip-magnetic, PVS AgriStip (рис. 2).

Наличие вироида веретеновидности картофеля тестировалось молекулярно-генетическим анализом

полимеразной цепной реакции с применением флуоресцентного ПЦР-детектора «Джин» (рис. 3). В качестве стимуляторов роста картофеля использовали фитогормоны: 6-бензиламинопурин, кинетин и биостимулятор феруловую кислоту.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате проделанной работы были оптимизированы питательные среды для роста и развития пробирочных растений в условиях in vitro для применения вегетативного способа размножения картофеля с помощью клонального микроразмножения.

Было установлено, что среды, содержащие 4 % сахарозы с различными сочетаниями концентраций фитогормонов, являются более благоприятными для черенкования пробирочных растений в зависимости от генотипа. Из результатов исследований было выявлено, что на всех вариантах питательных сред с различными концентрациями фитогормонов рост растений превышал контроль (МС). Наилучшим вариантом для процесса ризогенеза являлось сочетание ИУК 1,0 мг/л и кинетина в концентрации 0,25 мг/л.

Жидкая питательная среда для черенкования (МС-1) подходит также для клубнеобразования в культуре in vitro и является более экономически выгодной.

При качественном проведении молекулярно-генетического анализа полимеразной цепной реакции с использованием диагностических наборов с ДНК-зондами меченными флуоресцентно на наличие вирусной инфекции и вироида верете-новидности картофеля, экспериментально подтверждены данные об отсутствии фитопатогенов

Рис. 2. Иммунохроматографические экспресс-тесты с отрицательным результатом на наличие вирусной инфекции картофеля

УйИрус

1 ||И>С']ф4,Ч ПГц* ХЛ1 Роупп) Кш (Ж Пел т

СШСП - Ш

К МНП)'1 1.114 Ш.1Э

3/13 К ИЩЬС ♦ 1.4 63

■|А|и>1Г(у|1Ири) фон Ш 1.М

фи« 0,9) 0.М

Г-н ш

и«

<\5

*1 Щ НИр.фрнше таченш

Ш

Рис. 3. Результаты полимеразной цепной реакции на детекторе флуоресценции «Джин» по определению наличия вирусной инфекции и вироида веретеновидности картофеля с использованием диагностических наборов с ДНК-зондами, флуоресцентно меченными

| при использовании метода культуры апикальных § меристем с целью оздоровления посадочного мате-га риала. При тестировании иммунохроматографиче-скими тест-полосками фирмы ВюгеЪа пробирочных растений, полученных с применением биотехноло-

гического способа клонального микроразмножения для массового получения растений картофеля, было подтверждено отсутствие фитопатогенов у пробирочных растений. В результате научных исследований установлена наиболее оптимальная концентрация

компонентов питательной среды для массового ми-кроклонального размножения безвирусного картофеля в условиях in vitro для дальнейшего внедрения в промышленное картофелеводство Омского региона.

Библиографический список

1. Гончарук, В. М. Эффективность совместного применения фиторосто-регуляторов и микроэлементов на картофеле /

B. М. Гончарук // Регуляторы роста и развития растений в биотехнология : тез. докл. VI Междунар. конф. — М., 2001. —

C. 227-228.

2. Домрачева, П. Суперэлита без вирусов [Электронный ресурс] / П. Домрачева. — М. : Инновации, 2013. — Режим доступа : http:// http://www.potatosystem.ru/news/2013/04/04/35904 (дата обращения: 26.05.2014).

3. Домрачева, П. Инновационная технология выращивания безвирусного семенного картофеля в ЗАО «Тепличный» [Электронный ресурс] / П. Домрачева. — М. : Инновации, 2013. — Режим доступа : http://www.sdelanounas.ru/ blogs/31602 (дата обращения: 26.05.2014).

4. Анисимов, Б. В. Фитопатогенные вирусы и их контроль в семеноводстве картофеля / Б. В. Анисимов // Аграрная Россия. - 2003. - № 3. - С. 18-21.

5. Cassels, А. С. The elimimation of potato viruses X , Y, S and M in meristem and explant cultures of potato in the presence of virazole / А. С. Cassels, R. D. Long // Potato res. - 1982. -№ 25. - Р. l65-173.

АРТЮХОВА Светлана Ивановна, доктор технических наук, профессор (Россия), профессор кафедры «Химическая технология и биотехнология», член-корреспондент Российской академии естествознания. Адрес для переписки: asi08@yandex.ru КИРГИЗОВА Ирина Васильевна, магистрант группы БТМ-513, кафедра «Химическая технология и биотехнология».

Адрес для переписки: Irina.kz-89@mail.ru

№

УДК 633.111.1 «321» : «31.524.8 1^1.1) н. А. ПОПОЛЗУХИНА

Н. А. ЯКУНИНА П. В. ПОПОЛЗУХИН

Омский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина

Сибирский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии, г. Омск

ОЦЕНКА ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ АБИОТИЧЕСКИМ И БИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ ЗОНЫ ЮЖНОЙ ЛЕСОСТЕПИ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Дана оценка сортообразцам яровой мягкой пшеницы селекции ГНУ СибНИ-ИСХ и ТОО НПЦЗХ им. А. И. Бараева по устойчивости к ряду биотических и абиотических факторов зоны южной лесостепи Западной Сибири. Выявлены сорта и селекционные линии, наиболее адаптивные, перспективные для дальнейшего использования.

Ключевые слова: абиотические и биотические факторы, адаптивность, яровая мягкая пшеница, сорт, селекционная линия, урожайность зерна.

Реализация потенциала того или иного сорта напрямую связана как с генотипом культуры, так и с действием почвенно-климатических и технологических условий возделывания, которые в совокупности своей представляют действие различных экологических факторов: абиотических, биотических и антропических. Поэтому использование нового сорта предполагает не только создание и отбор перспективного генотипа, но и поиск той экологической ниши, где этот генотип обеспечит получение стабильной урожайности высококачественной про-

дукции [1]. В связи с этим изучение нормы реакции новых сортов на выращивание в конкретных почвенно-климатических условиях представляется весьма актуальным.

Проведенные нами ранее исследования позволили изучить норму реакции сортов и линий яровой мягкой пшеницы и выделить наиболее адаптивные к условиям южной лесостепи Западной Сибири [2, 3]. Практическим результатом этих исследований явилось создание новых сортов Мелодия (включен в Государственный реестр селекционных достижений

Modification of culture medium using biotechnological methods of micropropagation potatoes in Omsk region