CC BY
20
3
4 Р&йСГ ДЕТСКОЙ
ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ О 2018
Модельные регуляторные сети для белков, активируемых и ингибируемых в процессе индуцированной гранулоцитарной дифференцировки
С.Е. Новикова, О.В. Тихонова, Л.К. Курбатов, И.В. Вахрушев, В.Г. Згода
ФГБНУ«Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича»; Россия, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10, стр. 8
Контактные данные: Светлана Евгеньевна Новикова novikova.s.e3101@gmail.com
Дифференцирующая терапия с использованием полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) с успехом применяется для лечения острого промиелоцитарного лейкоза (ОПЛ). В то же время развитие резистентности и синдрома дифференцировки в качестве побочного эффекта является основанием для более глубокого исследования молекулярной основы дифференцирующей терапии и поиска альтернативных подходов к лечению. Используя обработанные ATRA-клетки линии ^-60 в качестве модельного объекта, мы определили 76 активируемых и 101 ингибируемый белок с помощью масс-спектрометрического профилирования без использования стабильных изотопных меток. Применив биоинформатический подход, мы получили модельные схемы регуляции ингибируемых и активируемых белков, ключевыми молекулами которых оказались деацетилаза гистонов 1 (HDAC1) и транскрипционный корепрессор RNF96 соответственно. Обе предсказанные ключевые молекулы были зарегистрированы в клетках линии ^-60 на уровне белка наряду с молекулами Cdk2, DNA-PKcs, ЦЬс9 и HMGIYв модельной схеме, регулирующей активируемый кластер белков, и протеинкиназой р38 альфа, вовлеченной в схему регуляции ингибируемых белков. Целевое фармакологическое воздействие на эти молекулы может иметь антипролиферативный эффект и представлять альтернативный терапевтический подход для борьбы с ОПЛ.
Ключевые слова: ATRA, клетки линии ^-60, гранулоцитарная дифференцировка, масс-спектрометрия, поиск ключевыхрегу-ляторов, транскрипционные факторы
DOI: 10.17650/2311-1267-2018-5-3-43-55
Model regulatory networks for proteins that are activated and inhibited in the process of induced granulocyte differentiation
S.E. Novikova, O.V. Tikhonova, L.K. Kurbatov, I.V. Vakhrushev, V.G. Zgoda
V.N. Orekhovich Research Institute of Biomedical Chemistry; 10, Bldg. 8 Pogodinskaya St., Moscow, 119121, Russia
Differentiation therapy with all trans retinoic acid (ATRA) is successfully used for the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL). At the same time, the development of the resistance and the differentiation syndrome as a side effect is a reason to explore and examine in greater depth the molecular basis of the differentiation therapy and to search the alternative paradigm of the treatment. By the use of ATRA-treated HL-60 cell line as a model object, we have estimated 76 activated and 101 inhibited proteins by the label-free mass-spectrometric profiling. By applying the bioinformatic approach we have obtained model schemes of regulation of the inhibited and activated proteins whose key molecules turn out to be the histone deacetylase 1 (HDAC1) and the transcriptional corepressor (RNF96) respectively. Both of predicted key molecules have been detected in HL-60 cell line at the proteome level in conjunction with Cdk2, DNA-PKcs, Ubc9 and HMGIY molecules in the model scheme regulating the activated protein cluster and the protein kinase p38 alpha involved in the regulating scheme of the inhibited proteins. The pharmacological targeting of these molecules may have an anti-proliferative effect and provide the alternative approach to APL treatment.
Key words: ATRA, HL-60 cells, granulocyte differentiation, mass spectrometry, key regulators search, transcription factors
Введение паратам ATRA и возникновение опасного для жизни
Полностью транс-ретиноевая кислота (ATRA) осложнения — синдрома дифференцировки. В связи
индуцирует дифференцировку промиелоцитарных с этим разработка альтернативных ATRA-препаратов
клеток в функциональные гранулоциты, что лежит является актуальной задачей. В то же время поиск по-
в основе терапии острого промиелоцитарного лейкоза тенциальных мишеней, воздействуя на которые мож-
(ОПЛ). Одной из основных проблем дифференцирую- но было бы достигать противоопухолевого эффекта,
щей терапии является развитие резистентности к пре- является трудоемким и дорогостоящим процессом.
нодго
Омиксные технологии, позволяющие анализировать молекулярный состав биологических объектов с высокой производительностью, являются привлекательными для пилотной стадии поиска биомаркеров и выявления потенциальных терапевтических мишеней [1, 2]. Масс-спектрометрический метод за счет высокого разрешения, чувствительности и точности измерений обеспечивает ревизию белкового состава биологических образцов, в том числе и очень сложных по составу, таких как лизаты клеток или плазма крови [3, 4]. Кроме того, количественное профилирование с использованием масс-спектрометрии позволяет выявить белки, изменение содержания которых отражает биологический ответ на действие фармакологических препаратов, в том числе ATRA [5].
Поскольку большая часть фармакологических веществ активирует или ингибирует молекулы-мишени в клетке, целью данного исследования было выделить кластеры белков, экспрессия которых снижается или повышается в процессе ATRA-индуцированной диф-ференцировки клеток линии HL-60, и с помощью биоинформатических методов найти для активируемых и ингибируемых дифференциально экспрессиру-ющихся белков регуляторы, которые можно рассматривать в качестве потенциальных терапевтических мишеней.
Клеточная линия HL-60 многие десятилетия используется в качестве модели для исследования молекулярной природы ATRA-индуцированной гра-нулоцитарной дифференцировки, начиная со времени открытия самого феномена, когда данную линию клеток еще относили к ОПЛ (M3 по классификации FAB) [6]. Стоит отметить, что и после пересмотра классификации клеток линии HL-60 с присвоением типа М2 по классификации FAB (острый миелобластный лейкоз с признаками созревания) [7] данную клеточную модель продолжают использовать для исследования ATRA-индуцированной гранулоцитарной диффе-ренцировки, и в том числе феномена резистентности к ATRA [8, 9].
В данном исследовании мы применили масс-спек-трометрическое профилирование с последующим относительным количественным анализом без использования стабильных изотопных меток и поиск ключевых регуляторов в программном обеспечении geneXplain platform для образцов клеток линии HL-60, полученных через 0, 3, 24, 48 и 96 ч после обработки ATRA. Поскольку детекция предсказанных молекул в биологическом объекте на уровне белка отражает адекватность моделирования и служит простейшим способом валидации полученных модельных схем, результаты моделирования были сопоставлены с дополнительными данными масс-спектрометрического анализа цитозольной и ядерной фракции клеток линии HL-60.
Материалы и методы
Культуры клеток
Культура клеток линии HL-60 была получена из криобанка Научно-исследовательского института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича. После размораживания клетки культивировали в ростовой среде ^РМ1-1640 с добавлением 10 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота, содержащей 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина (все реактивы — Gibco), в СО2-ин-кубаторе в стандартных условиях (37 °С, 5 % СО2, 80 % влажности). При достижении концентрации 1 млн кл/мл культуры рассеивали в соотношении 1:3. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева.
Для индукции дифференцировки клетки HL-60 в ростовой среде помещали в культуральные флаконы с площадью дна 75 см2 (концентрация клеток — 10 млн кл/мл, 10 мл среды). Затем во флаконы вносили по 5 мл ростовой среды, содержащей АТЯА в концентрации 150 цМ/л (конечная концентрация — 50 цМ/л). После этого клетки помещали в СО2-инкубатор и инкубировали в стандартных условиях в течение 3, 24, 48 либо 96 ч. По окончании клетки трижды отмывали путем центрифугирования с последующим ресуспен-дированием в 10 мл 0,1 М фосфатно-солевого буфера, после чего замораживали пробирки с осадком в жидком азоте. В качестве контроля, соответствовавшего нулевому сроку инкубации, были использованы клетки, культивированные обычным образом (без добавления АТИА). Эффективность прохождения диффе-ренцировки оценивали по экспрессии поверхностных маркеров CD11b и CD38 методом проточной цито-флуориметрии.
Получение цельного лизата, ядерной и цитозольной фракции клеток HL-60 и пробоподготовка к масс-спек-трометрическому анализу
Для протеомного профилирования клетки HL-60, собранные во временных точках 0, 3, 24, 48 и 96 ч после добавления АТЯА в 3 биологических повторах, лизировали в буфере, содержащем 3 % дезок-сихолат натрия, 100 мМ Ъ^-НС1, рН = 8,5, таким образом получали цельный лизат. Преимуществом проведенного нами исследования явилось монито-рирование молекулярных изменений в различные временные точки (0, 3, 24, 48 и 96 ч), позволяющее рассматривать процесс АТЯА-индуцированной дифференцировки в динамике. В качестве контроля использовались клетки линии HL-60 без обработки АТЯА (0 ^ на основании протоколов индукции гранулоцитарной дифференцировки для последующего протеомного анализа, описанных ранее в литературе [10-12].
Для получения белков ядерной и цитозольной фракции применяли химическую экстракцию [13].
. Журнал
нодго
3
2018
В полученных образцах цельного клеточного лиза-та, а также цитозольной и ядерных фракций определяли концентрацию общего белка колориметрическим методом с бицинхониновой кислотой с помощью коммерческого набора Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Pierce) в соответствии с рекомендациями производителя.
Гидролитическое расщепление белков осуществляли согласно протоколу FASP (Filter Aided Sample Preparation) [14]. К каждой пробе добавляли раствор трипсина в соотношении: общая масса фермента/ общая масса белка 1/100 и инкубировали в течение ночи при температуре 37 °С. По окончании добавляли трипсин в соотношении: общая масса фермента/общая масса белка 1/100 и инкубировали 2 ч при температуре 37 °C. Полученные образцы подвергали масс-спектрометрическому анализу.
Хромато-масс-спектрометрический анализ
Хромато-масс-спектрометрический анализ осуществляли для каждой пробы в 5 технических повторах. Пептидную смесь загружали на обогащающую колонку Zorbax 300SB-C18 (диаметр частиц 5 мкм, 5 х 0,3 мм) (Agilent Technologies) и промывали подвижной фазой С для загрузки и промывки обогащающей колонки, представлявшей собой 5 % раствор ацетонитрила в 0,1 % муравьиной кислоте и 0,05 % трифторуксусной кислоте при скорости потока 3 мкл/мин в течение 5 мин. Пептиды разделяли на аналитической колонке Zorbax 300SB-C18 (диаметр частиц 3,5 мкм, 150 х 75 мкм) (Agilent Technologies) в градиенте подвижной фазы В, представлявшей собой 80 % раствор ацетонитрила в 0,1 % муравьиной кислоты при скорости потока 0,3 мкл/мин. Использовали следующие параметры градиента ацетонитрила: аналитическую колонку промывали подвижной 5 % фазой В в течение 5 мин, после чего линейно увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 60 % в течение 80 мин, в течение 5 мин увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 100 %, в течение 10 мин промывали аналитическую колонку 100 % подвижной фазой В, в течение 5 мин уменьшали концентрацию подвижной фазы B до 5 %, в течение 15 мин аналитическую колонку уравновешивали 5 % подвижной фазой В.
Масс-спектрометрический анализ проводили на гибридном масс-спектрометре Orbitrap Vélos (Thermo Scientific), используя масс-анализатор типа орби-трэп. Максимальное время накопления 106 ионов для получения MC-скана с разрешением 30 000 (для m/z = 400) в диапазоне величин m/z = 300—2000 в режиме положительной ионизации составляло 50 мс. Пять наиболее интенсивных ионов, зарегистрированных в МС-скане, выбирали для последующей фрагментации, если их абсолютная интенсивность
превышала 5000 относительных единиц. Использовали HCD-тип фрагментации с нормализованной энергией соударения 35 %. Применяли динамическое исключение из тандемного анализа: длительность исключения составляла 90 с после того, как ион хотя бы 1 раз был фрагментирован с получением MC/MC-спектра в течение 30 с. Размер списка исключения составлял 500 ионов. Максимальное время накопления 5 х 104 ионов для получения МС/МС-скана с разрешением 7500 (при m/z = 400) в диапазоне величин m/z = 300—2000, в режиме положительной ионизации составляло 100 мс.
Идентификация белков и относительный количественный анализ
Для идентификации белков использовали поисковый алгоритм Andromeda, встроенный в программное обеспечение MaxQuant 1.5.5.0 (Max Planck Institute of Biochemistry). В качестве фиксированной модификации аминокислотных остатков использовали карбамидометилирование цистеина, в качестве вариабельной модификации — окисление метионина. Толерантность для родительских и дочерних ионов составляла 20 ppm. Для белков и пептидов пороговое значение частоты встречаемости ложноположитель-ных идентификаций (FDR) составило 0,01.
Количественный анализ осуществлялся на основании площади под пиком родительского иона с использованием вычисленной величины LFQ (Labelfree Quantification Intensity) с помощью встроенного в MaxQuant алгоритма. Статистический анализ выполнялся в программном обеспечении Perseus 1.6.0.7 (Max Planck Institute of Biochemistry). Сравнивались данные масс-спектрометрического анализа для всех экспериментальных точек (0, 3, 24, 48 и 96 ч). Результаты относительной количественной оценки без использования стабильных изотопных меток на основании площади под пиком прекурсорного иона (LFQ intensity) визуализировали в программном обеспечении Perseus. Для определения белков, содержание которых значимо меняется на протяжении ATRA-ин-дуцированной дифференцировки (временные точки — 0, 3, 24, 48 и 96 ч), проводили многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA p-value < 10-7). Для дифференциально экспрессируемых (FDR < 10-7) в течение всего периода дифференцировки белков была построена тепловая карта, отражающая количественные изменения белков.
Построение модельных схем в программном обеспечении geneXplain platform
Входными данными для анализа в программном обеспечении geneXplain platform 4.0 служили тестовые (белки активируемого и ингибируемого кластеров) и контрольные (белки, содержание которых не изме-
нодго
нялось в процессе ATRA-индуцированной дифферен-цировки) выборки.
Поиск предпредставленных сайтов связывания транскрипционных факторов (ТФ) в промоторных регионах генов, соответствующих белкам тестовой выборки, был осуществлен с использованием модуля "Site search on gene set" и базы данных TRANSFAC®.
Область поиска в промоторном регионе лежала в диапазоне от +1000 до +100 п. н. от сайта начала транскрипции, при этом для анализа использовались только наиболее подтвержденные промоторы. Суть анализа заключалась в сравнении частоты встречаемости матриц базы TRANSFAC®, соответствующих участкам связывания ТФ в промоторах генов, кодирующих белки тестовой выборки, по сравнению с генами, кодирующими белки контрольных выборок. При выборе матриц для дальнейшего анализа был установлен порог статистической значимости предпредстав-ленности участков связывания ТФ в тестовой выборке p-value < 0,01. Матрицы были конвертированы в набор ТФ, которые могли быть ответственны за изменения содержания белков, наблюдаемые экспериментально.
Для набора ТФ, полученных на предыдущем этапе, проводили поиск общего регулятора при помощи модуля "Regulator search" платформы geneXplain (http://platform.genexplain.com) со следующими ниже установками: используемая база данных TRANSPATH®, длина пути R = 10, отсечение результатов по FDR = 0,05. Для каждого возможного регулятора помимо FDR рассчитываются оценки Score, Z-score и Ranks sum. Результаты поиска ключевых молекул сравнивались со списком белков, идентифицированных в ядерной и цитозольной фракции клеток линии HL-60. Ключевую молекулу, экспрес-сирующуюся в клетках линии HL-60 на уровне белка и демонстрирующую наибольшую статистическую значимость (мнимальная величина для показателя ранговой суммы (rank sum)), использовали для построения модельной схемы.
Результаты
По результатам протеомного профилирования клеток линии HL-60 во временных точках 0, 3, 24, 48 и 96 ч после добавления ATRA были идентифицированы 1713 белков как минимум по 2 протеотипиче-ским пептидам.
Как видно из тепловой диаграммы, представленной на рис. 1, среди дифференциально экс-прессирующихся белков можно выделить 2 кластера — кластер 1 и кластер 2 — белки, содержание которых увеличивается и уменьшается к 96 ч после добавления ATRA соответственно. В дальнейшем мы будем называть их активируемый (76 белков, кластер 1) и ингибируемый (101 белок, кластер 2) кластеры. Кластеризация в программном обеспечении Perseus
Рис. 1. Тепловая диаграмма, отражающая разницу в экспрессии белков клеток линии HL-60 в процессе ATRA-индуцированной дифферен-цировки по результатам протеомного профилирования через 0, 3, 24, 48 и 96 ч после добавления индуктора (показаны 177 белков со статистически значимыми различиями в экспрессии (ANOVA p-value < 107), образующих кластеры 1 и 2)
Fig. 1. The heatmap representing the expression level difference for proteins of HL-60 cell line in process ofATRA-induced differentiation in accordance with proteomic profiling results at 0, 3, 24, 48 and 96 hours after adding the inductor (there are shown 177 proteins with a statistically significant differences in expression (ANOVA p-value < 107), which shape a clusters 1 and 2)
осуществляется на основании математического алгоритма, принимающего во внимание сходство профиля экспрессии белков и направление изменения их содержания (увеличение или уменьшение). Данный алгоритм определяет в том числе порядок следования кластеров временных точек 24 и 48 ч, отражающий высокую степень сходства профилей экспрессии белков в данных точках.
Функциональная аннотация этих дифференциально экспрессирующихся белков по категориям базы данных GeneOntology позволила определить белки, участвующие в функционировании иммунной системы (ИС), регуляции клеточной гибели (КГ), пролиферации (Пф), адгезии (Адг) и клеточном цикле (КЦ) (таблица).
Данные, представленные в таблице, демонстрируют, что 42 дифференциально экспрессирующихся белка активируемого кластера вовлечены в реализацию функций ИС и КГ, в то время как 29 белков ингибируемого кластера задействованы в реализации Пф, КЦ и Адг.
Анализ белков активируемого и ингибируемо-го кластеров в программном обеспечении geneXplain platform позволил определить потенциальные ТФ и ключевые молекулы, регулирующие дифференциально экспрессирующиеся белки. Для определения молекул, экспрессирующихся в клетках линии HL-60 на белковом уровне, модельные схемы были сопоставлены с результатами масс-спектрометрического анализа цитозольной и ядерной фракций клеток линии HL-60. Схемы регуляции представлены на рис. 2 и 3.
ДЕТСКОЙ ТОМ5
^ ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ 3 ||2018
Дифференциально экспрессирующиеся под действием ATRA белки клеток линии HL-60, задействованные в функционировании ИС, регуляции КГ, Пф и КЦ (начало)
Идентификационный номер в базе данных UniProt Имя гена Название белка в базе данных UniProt Биологический процесс FC
Дифференциально экспрессирующиеся белки активируемого кластера |
Р35579 МУН9 Миозин 9 ИС 6,1
Р14618 РКМ Пируваткиназа РКМ ИС 4,5
Р14598 NCF1 Цитозольный фактор нейтрофилов 1 ИС 2,6
Р30740 SERPINB1 Ингибитор эластазы нейтрофилов ИС 3,4
Р05107 CD18 Интегрин бета 2 ИС 3,7
Q9BS26 ЕКР44 Белок эндоплазматического ретикулума 44 ИС 2,7
Q06323 PSME1 Субъединица 1 комплекса активатора протеасом ИС 2,4
Q9Y3Z3 SAMHD1 Дезоксинуклеозидтрифосфат трифосфогидролаза SAMHD1 ИС 3,0
Р18669 РСАМ1 Фосфоглицератмутаза 1 ИС 3,5
Р61158 Астз Родственный актину белок 3 ИС 4,2
Р07339 CTSD Катепсин D ИС 4,8
Р52907 САРЖ1 Субъединица альфа 1 F-актин кэпирующего белка ИС 5,2
Р63261 АСТ01 Актин цитоплазматический 2 ИС 4,2
Q14019 СОТЫ Коастозин-подобный белок ИС 5,2
Р04839 СУВВ Тяжелая цепь цитохрома Ь-245 ИС 2,8
Р27824 СШХ Кальнексин ИС 4,3
Q01518 САР1 Аденилатциклаза-ассоциированный белок 1 ИС 3,8
Q99536 УАТ1 Гомолог белка мембраны синаптических везикул VAT-1 ИС 4,6
Р39656 DDOST Субъединица 48кДа комплекса N-олигосахарид-трансферазы ИС 3,2
Р13796 1СР1 Пластин 2 ИС 5,8
Р08575 CD45 Белковая тирозинфосфатаза рецепторного типа С ИС 3,0
Р30101 PDA3 Белковая дисульфидизомераза А3 ИС + КГ 5,3
Р26583 НМ0В2 Белок В2 группы высокой подвижности ИС + КГ 3,9
Р14625 ШР90В1 Эндоплазмин ИС + КГ 4,8
Р09211 GSTP1 Глутатион-S-трансфераза Р ИС + КГ 3,6
Р04406 GAPDH 1лицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа ИС + КГ 2,6
Р04040 САТ Каталаза ИС + КГ 3,8
Р10809 HSPD1 Белок теплового шока 60 кДа митохондриальный ИС + КГ 6,2
Р31146 CORO1A Коронин 1А ИС + КГ 1,6
Р04083 ШХА1 Аннексин А1 ИС + КГ 5,1
Q13501 SQSTM1 Секвестосома 1 КГ 3,8
Р63104 УЖИА2 14-3-3 белок зета/дельта КГ 3,3
Р68032 АСТС1 Актин КГ 3,0
Р23528 CFL1 Кофилин-1 КГ 2,6
014745 SLC9A3R1 Кофактор регуляции обмена №(+)/Н(+^НЕ-КР1 КГ 2,5
ДЕТСКОЙ ТОМ5
ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ 3 2018
Дифференциально экспрессирующиеся под действием ATRA белки клеток линии HL-60, задействованные в функционировании ИС, регуляции КГ, Пф и КЦ (продолжение)
Идентификационный номер в базе данных UniProt Имя гена Название белка в базе данных UniProt Биологический процесс FC
Q9Y4L1 HYOU1 Активируемый при гипоксии белок 1 КГ 4,9
P30040 ERP29 Белок эндоплазматического ретикулума 29 КГ 4,2
P06733 ENO1 Енолаза альфа КГ 2,3
P35232 PHB Прохибитин КГ 3,7
P11021 HSPA5 Белок-шаперон эндоплазматического ретикулума BiP КГ 5,8
P61604 HSPE1 Белок теплового шока 10 кДа митохондриальный КГ 4,2
P07237 P4HB Белковая дисульфидизомераза PDI КГ 3,9
Дифференциально экспрессирующиеся белки ингибируемого кластера 1
Q9UQ80 PA2G4 Ассоциированный с Пф белок 2G4 Пф 0,2
P33993 MCM7 Фактор, разрешающий репликацию ДНК MCM7 Пф 0,1
Q9NZI8 IGF2BP1 Связывающий мРНК инсулиноподобного фактора роста-2 белок 1 Пф 0,2
P12268 IMPDH2 Инозин-5-монофосфатдегидрогеназа 2 Пф 0,2
P13639 EEF2 Фактор элонгации 2 Пф 0,2
Q6PKG0 LARP1 La-родственный белок 1 Пф 0,3
P13010 XRCC5 Белок репарации ДНК XRCC5 Пф 0,3
P12004 PCNA Ядерный антиген пролиферирующих клеток Пф 0,4
Q9BQG0 MYBBP1A Myb-связывающий белок 1A КЦ 0,2
P06748 NPM1 Нуклеофосмин КЦ 0,2
Q09028 RBBP4 Гистон-связывающий белок RBBP4 КЦ 0,2
P11142 HSPA8 Белок теплового шока 70кДа 8 КЦ 0,6
Q00839 HNRNPU Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин U КЦ 0,2
000410 IPO5 Импортин-5 КЦ 0,3
P39748 FEN1 Флеп-эндонуклеаза 1 КЦ 0,3
Q04637 EIF4G1 Эукариотический фактор инициации трансляции 4, субъединица гамма 1 КЦ 0,3
P08238 HSP90AB1 Белок теплового шока HSP-90 бета КЦ 0,2
015355 PPM1G Белковая фосфатаза 1G КЦ 0,4
P78527 PRKDC Каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы КЦ 0,3
P23246 SFPQ Богатый пролином и глутамином фактор сплайсинга КЦ 0,2
Q16543 CDC37 Hsp90 ко-шаперон Cdc37 КЦ 0,2
P07437 TUBB Тубулин, бета цепь КЦ 0,2
Q13148 TARDBP TAR ДНК-связывающий белок 43 КЦ 0,2
P68371 TUBB4B Тубулин, бета-4В цепь КЦ 0,3
P09429 HMGB1 Белок B1 группы высокой подвижности Адг 0,2
P21333 FLNA Филамин-A Адг 0,2
ДЕТСКОЙ ТОМ5
ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ 3 2018
Дифференциально экспрессирующиеся под действием ATRA белки клеток линии HL-60, задействованные в функционировании ИС, регуляции КГ, Пф и КЦ (окончание)
Идентификационный номер в базе данных UniProt Имя гена Название белка в базе данных UniProt Биологический процесс FC
P02786 TFRC Рецептор к трансферину 1 Адг 0,2
Q13177 PAK2 Серин-треониновая протеинкиназа PAK 2 Адг 0,2
P29350 PTPN6 Белковая тирозинфосфатаза нерецепторного типа 6 Адг 0,4
Примечание. UniProt — открытая база данных последовательностей белков; FC (fold change) — изменение экспрессии во временной точке 96 ч по сравнению с контролем (0 ч).
Proteins of HL-60 cell line differentially expressed under ATRA treatment involved in the functioning of the immune system (IS), regulation of cell death (CD), proliferation (PF) and cell cycle (CC) (beginning)
Identity numbers in the UniProt Gene title The name of the protein in the database (UniProt) Biological process FC
Differently expressed proteins of the activated cluster |
P35579 MYH9 Myosin 9 IS 6.1
P14618 PKM Pyruvate kinase PKM IS 4.5
P14598 NCF1 Neutrophil cytosol factor 1 IS 2.6
P30740 SERPINB1 Leukocyte elastase inhibitor IS 3.4
P05107 CD18 Integrin beta-2 IS 3.7
Q9BS26 ERP44 Endoplasmic reticulum resident protein 44 IS 2.7
Q06323 PSME1 Proteasome activator complex subunit 1 IS 2.4
Q9Y3Z3 SAMHD1 Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 IS 3.0
P18669 PGAM1 Phosphoglycerate mutase IS 3.5
P61158 ACTR3 Actin-related protein 3 IS 4.2
P07339 CTSD Cathepsin D IS 4.8
P52907 CAPZA1 F-actin-capping protein subunit alpha-1 IS 5.2
P63261 ACTG1 Actin, cytoplasmic 2 IS 4.2
Q14019 COTL1 Coactosin-like protein IS 5.2
P04839 CYBB Cytochrome b-245 heavy chain IS 2.8
P27824 CANX Calnexin IS 4.3
Q01518 CAP1 Adenylyl cyclase-associated protein 1 IS 3.8
Q99536 VAT1 Synaptic vesicle membrane protein VAT-1 homolog IS 4.6
P39656 DDOST Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase 48 kDa subunit IS 3.2
P13796 LCP1 Plastin-2 IS 5.8
P08575 CD45 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C IS 3.0
P30101 PDA Protein disulfide-isomerase A3 IS + CD 5.3
P26583 HMGB2 High mobility group protein B2 IS + CD 3.9
P14625 HSP90B1 Endoplasmin IS + CD 4.8
P09211 GSTP1 Glutathione S-transferase P IS + CD 3.6
ДЕТСКОЙ ТОМ5_
ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ 3 2018 | ||
Proteins of HL-60 cell line differentially expressed under ATRA treatment involved in the functioning of the immune system (IS), regulation of cell death (CD), proliferation (PF) and cell cycle (CC) (continuation)
Identity numbers in the UniProt Gene title The name of the protein in the database (UniProt) Biological process FC
P04406 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase IS + CD 2.6
P04040 CAT Catalase IS + CD 3.8
P10809 HSPD1 60 kDa heat shock protein, mitochondrial IS + CD 6.2
P31146 CORO1A Coronin-IA IS + CD 1.6
P04083 ANXA1 Annexin A1 IS + CD 5.1
Q13501 SQSTM1 Sequestosome-1 CD 3.8
P63104 YWHAZ 14-3-3 protein zeta/delta CD 3.3
P68032 ACTC1 Actin CD 3.0
P23528 CFL1 Cofilin-1 CD 2.6
O14745 SLC9A3R1 Na(+)/H(+) exchange regulatory cofactor NHE-RF1 CD 2.5
Q9Y4L1 HYOU1 Hypoxia up-regulated protein 1 CD 4.9
P30040 ERP29 Endoplasmic reticulum resident protein 29 CD 4.2
P06733 ENO1 Alpha-enolase CD 2.3
P35232 PHB Prohibitin CD 3.7
P11021 HSPA5 Endoplasmic reticulum chaperone BiP CD 5.8
P61604 HSPE1 10 kDa heat shock protein, mitochondrial CD 4.2
P61604 HSPE1 10 kDa heat shock protein, mitochondrial CD 4.2
P07237 P4HB Protein disulfide-isomerase PDI CD 3.9
Differently expressed proteins of the inhibited cluster 1
Q9UQ80 PA2G4 Proliferation-associated protein 2G4 PF 0.2
P33993 MCM7 DNA replication licensing factor MCM7 PF 0.1
Q9NZI8 IGF2BP1 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 PF 0.2
P12268 IMPDH2 Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 2 PF 0.2
P13639 EEF2 Elongation factor 2 PF 0.2
Q6PKG0 LARP1 La-related protein 1 PF 0.3
P13010 XRCC5 X-ray repair cross-complementing protein 5 PF 0.3
P12004 PCNA Proliferating cell nuclear antigen PF 0.4
Q9BQG0 MYBBP1A Myb-binding protein 1A CC 0.2
P06748 NPM1 Nucleophosmin CC 0.2
Q09028 RBBP4 Histone-binding protein RBBP4 CC 0.2
P11142 HSPA8 Heat shock cognate 71 kDa protein CC 0.6
Q00839 HNRNPU Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U CC 0.2
000410 IPO5 Importin-5 CC 0.3
P39748 FEN1 Flap endonuclease 1 CC 0.3
Q04637 EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1 CC 0.3
P08238 HSP90AB1 Heat shock protein HSP 90-beta CC 0.2
O15355 PPM1G Protein phosphatase 1G CC 0.4
I РЖСурнал™ ДЕТСКОЙ ТОМ5
' ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ 3 2018
Proteins of HL-60 cell line differentially expressed under ATRA treatment involved in the functioning of the immune system (IS), regulation of cell death (CD), proliferation (PF) and cell cycle (CC) (end)
Identity numbers in the UniProt Gene title The name of the protein in the database (UniProt) Biological process FC
P78527 PRKDC DNA-dependent protein kinase catalytic subunit CC 0.3
P23246 SFPQ Splicing factor, proline- and glutamine-rich CC 0.2
Q16543 CDC37 Hsp90 co-chaperone Cdc37 CC 0.2
P07437 TUBB Tubulin beta chain CC 0.2
Q13148 TARDBP TAR DNA-binding protein 43 CC 0.2
P68371 TUBB4B Tubulin beta-4B chain CC 0.3
P09429 HMGB1 High mobility group protein B1 Adh 0.2
P21333 FLNA Filamin-A Adh 0.2
P02786 TFRC Transferrin receptor protein 1 Adh 0.2
Q13177 PAK2 Serine/threonine-protein kinase PAK 2 Adh 0.2
P29350 PTPN6 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Adh 0.4
Notе. UniProt — is a open database of protein sequence; FC (fold change) — is changes in gene expression in time point 96 h compared with the control (0 h); Adh — adhesion.
роевен* i ir
•f'-îl jbd] гп
ч» L .. J ЙИ
мтт 4JÍI
MU
i - um'
jip
ЦП)
4UI№l 7
тг 1 F*;
■rfrHMI« limml
ED
{'"I)
SÛÏ-Î
■ flNFIn
imupbii ■ Srt - 5HP-Ï
ik*r«
ipl (ijgn
HtwClJ Hir iiipki MSIVi^itw
mdrvtZ • p/CAf 4 P
TipH AW-MuAxml Vr¿ГL"Jh.] f?r i It«
ÍKCIÍIJI QSKJHtl CPSf
Рис. 2. Схема регуляции белков активируемого кластера. Фиолетовым цветом показаны ТФ, зеленым — промежуточные молекулы, розовым — ключевая молекула (HDAC1). Красным цветом выделены молекулы модельной схемы, регистрируемые на белковом уровне масс-спектрометрическим методом в цитозольной или ядерной фракции клеток линии HL-60. Компоненты модельных схем соединены линиями с узлами, обозначающими межмолекулярное взаимодействие, обнаруженное в программном обеспечении geneXplain platform по базе данных TRANSPATH®, тип взаимодействия обозначен по кодировке geneXplain platform: незаштрихованные квадраты — фосфорилирование или ацетилирование; незаштрихованный круг — расщепление молекулы или деацетилирование, или дефосфорилирование; заштрихованный круг — сумоилирование или убиквитинилирование; линия со стрелкой после узла направлена в сторону конечного продукта реакции Fig. 2. The scheme ofprotein regulation of the activated cluster. Purple color shows the transcription factors, green — intermediate molecules, pink — key molecule (HDAC1). The molecules of the model scheme registered on the protein level by the mass spectrometric method in the cytosolic or nuclear fraction of HL-60 cells are marked in red. The components of the model scheme are connected by lines to nodes denoting the intermolecular interaction detected in the geneXplain platform software using the TRANSPATH® database, type of interaction is indicated by the geneXplain platform legend: unshaded squares — phosphorylation or acetylation; unshaded circle — cleavage of the molecule or deacetylation or dephosphorylation; shaded circle sumoylation or ubiquitinylation; the line with the arrow after the node is directed toward the final product of the reaction
Рис. 3. Схема регуляции белков ингибирумого кластера. Фиолетовым цветом показаны ТФ, зеленым — промежуточные молекулы, розовым — ключевая молекула (RNF96). Красным цветом выделены молекулы модельной схемы, регистрируемые на белковом уровне масс-спек-трометрическим методом в цитозольной или ядерной фракции клеток линии HL-60. Компоненты модельных схем соединены линиями с узлами, обозначающими межмолекулярное взаимодействие, обнаруженное в программном обеспечении geneXplain platform по базе данных TRANSPATH®, тип взаимодействия обозначен по кодировке geneXplain platform: незаштрихованные квадраты — фосфорилирование или ацетилирование; незаштрихованный круг — расщепление молекулы или деацетилирование, или дефосфорилирование; заштрихованный круг — сумоилирование или убиквитинилирование; линия со стрелкой после узла направлена в сторону конечного продукта реакции Fig. 3. The scheme ofprotein regulation of the inhibited cluster. Purple color shows the transcription factors, green - intermediate molecules, pink — key molecule (RNF96). The molecules ofthe model scheme registered on the protein level by the mass spectrometric method in the cytosolic or nuclearfraction of HL-60 cells are marked in red. The components of the model scheme are connected by lines to nodes denoting the intermolecular interaction detected in the geneXplain platform software using the TRANSPATH® database, type of interaction is indicated by the geneXplain platform legend: unshaded squares — phosphorylation or acetylation; unshaded circle — cleavage of the molecule or deacetylation or dephosphorylation; shaded circle — sumoylation or ubiquitinylation; the line with the arrow after the node is directed toward the final product of the reaction
нодго
Ключевыми молекулами схем, регулирующих активируемый и ингибируемый кластеры, оказались деацетилаза гистонов 1 (HDAC1) и ядерный коре-прессор RNF96 (TRIM28) соответственно.
Среди предсказанных ТФ схемы активируемого кластера оказались: AP-2 альфа (AP-2alpha), NF-YA, POU6F1, RelA-p65, RNF96, HMGIY, TATA-бокс-свя-зывающий белок (TBP), транскрипционный репрессор Bcl-6 и ядерный рецептор к эстрогену альфа (ER alpha).
ТФ в схеме регуляции ингибируемого кластера: Sox2, HIF-1, С/EBP альфа, ATF2, E2F-1 и Ikaros.
ТФ CPBP (онкосупрессор KLF6) и Sp1 оказались представленными в обеих схемах.
Среди молекул модельных схем CDK2, DNA-PKcs, HDAC1, HMGIY, Ubc9, RNF96, p38 альфа идентифицировали в ядерной и/или цитозольной фракции клеток линии HL-60 на белковом уровне.
Ряд молекул, такие как HDAC1, RNF96, Sp1 и CPBP (онкосупрессор KLF6), пересекаются между схемами. В том числе ключевая молекула ингиби-руемого кластера RNF96 оказывается ТФ на схеме активируемого кластера. В свою очередь, ключевая молекула активируемого кластера — HDAC1 участвует в передаче сигнала от RNF96 к ТФ Sp1 на схеме регуляции ингибируемого кластера.
Обсуждение
Применение масс-спектрометрического профилирования к клеткам линии HL-60 через 0, 3, 24, 48 и 96 ч после обработки ATRA позволило определить дифференциально экспрессирующиеся по мере прохождения дифференцировки белки. Они функционально ассоциированы с выполнением иммунных функций, а также развитием апоптоза, что отражает приобретение клетками линии HL-60 фенотипа зрелых гранулоцитов. Выявленные в настоящей работе белки можно рассматривать как панель маркеров дифференцировки наряду с поверхностными молекулами CD38 и CD11b, оцениваемыми с помощью проточной цитофлуориметрии.
Используя компьютерное моделирование, основанное на поиске ключевых регуляторов, можно сделать попытку реконструировать молекулярную сигнальную сеть, ответственную за изменение экспрессии белков, и представить ее в виде модельной схемы. Ключевые молекулы модельных схем — HDAC1 и RNF96 (TRIM28) — являются главными регуляторами, приводящими к изменению экспрессии белков, наблюдаемому в нашем эксперименте, следовательно, можно предположить, что именно они будут наиболее чувствительны к фармакологическому воздействию или будут представлять собой потенциальные терапевтические мишени «1-й линии».
В качестве ключевой молекулы на схеме регуляции активируемого кластера выступает HDAC1, играющая
важную роль в эпигенетическои регуляции транскрипции и КЦ. Деацетилирование гистонов по аминокислотным остаткам лизина ведет к конденсации хроматина и репрессии транскрипции. Для клеток различных опухолей, в том числе лейкозов, была показана повышенная экспрессия HDAC1 [15]. Целевое фармакологическое воздействие на деацетилазы гистонов может представлять собой альтернативный подход к терапии ОПЛ. К настоящему моменту ингибиторы HDACs, такие как вальпроевая кислота, использовали в комбинации с ATRA или ингибитором ДНК-метилтрансферазы азацитидином для лечения пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), для которых не применим стандартный терапевтический подход [16, 17]. Примечательно, что HDAC1 является ключевым регулятором именно активируемого кластера, на основании чего можно предположить, что транскрипция генов, соответствующих белкам с увеличенной экспрессией, регулируется за счет эпигенетических механизмов.
Модельную схему, регулирующую ингибируемый кластер, возглавляет транскрипционный корепрессор ЯКБ96 (ТЫМ28), влияющий на такие важные для регуляции баланса Пф/дифференцировки молекулы, как CDKN1A/p21 и р53 [18, 19]. Транскрипционный репрессор RNF96 (ТЫМ28) мало исследован в контексте ОПЛ или ОМЛ и представляет собой потенциальную мишень для терапевтического воздействия.
HDAC1 и транскрипционный корепрессор RNF96 (TRIM28) присутствуют на обеих модельных схемах, выполняя в одном случае роль ключевой молекулы, а в другом — роль ТФ (RNF96 для схемы активируемого кластера) или молекулы, передающей сигнал (HDAC1 для схемы ингибируемого кластера), что, вероятно, отражает тесную взаимосвязь между активацией и ингибированием в клетке.
ТФ, с наибольшей вероятностью ответственные за изменение экспрессии активируемых и ингибиру-емых белков и регулируемые ключевыми молекулами, можно рассматривать как потенциальные терапевтические мишени «2-й линии».
В целом все предсказанные ТФ можно разделить на благоприятствующие Пф и клеточному росту, или наоборот — содействующие дифференцировке и апоптозу.
Некоторые ТФ модельных схем, такие как Вс1-6, ER альфа и Б0Х2 вовлечены в Пф, рост опухолей, ин-гибирование онкосупрессоров, таких как р53, и ранее рассматривались в качестве потенциальных терапевтических мишеней.
Например, Вс1-6 играет важную роль в развитии лейкозов. В клетках хронического миелоидного лейкоза, прежде всего в популяции стволовых клеток или лейкоз-инициирующих клеток, Вс1-6 супрессирует ген р53, предотвращая развитие апоптоза, в то время
. Журнал
нодго
3
2018
как фармакологическое ингибирующее воздействие на Вс1-6 ведет к эрадикации популяции лейкозных стволовых клеток [20]. ER альфа, как и многие стероидные гормоны и их лиганды, вовлечен в регуляцию Пф и дифференцировки клеток. Рецепторы к эстрогену уже рассматривались как потенциальные мишени для терапии лейкозов: на основании биоинфор-матического предсказания и последующего нокдауна гена рецептор к эстрогену бета был выявлен как потенциальная клеточная мишень для изофлавоноида диосметина, вызывающего апоптоз в клетках ОМЛ [21]. В то же время в другом исследовании было показано, что селективный модулятор эстрогеновых рецепторов тамоксифен активирует ER альфа, что индуцирует апоптоз в гемопоэтических стволовых клетках и плюрипотентных прогениторных клетках, оказывая противолейкозный эффект [22]. Среди молекул схемы, регулирующей ингибируемый кластер дифференциально экспрессирующихся белков, представлен ТФ Б0Х2, являющийся одним из основных регуляторов раковых стволовых клеток. Ранее было показано, что экспрессия Б0Х2 была повышена в клетках ОМЛ [23]. Целевое воздействие на Б0Х2 уже рассматривалось в качестве подхода для лечения глиобластом [24]. Возможно, ингибирование Б0Х2 будет иметь антипроли-феративный эффект и в случае ОПЛ.
Другая группа ТФ, включающая Бр1, С/ЕВР альфа и СРВР (онкосупрессор способствует прохо-
ждению дифференцировки или задействована в инги-бировании онкогенов, таких как с-МУС, и подавлении опухолевого роста.
ТФ Бр1 задействован в развитии миелоидных клеток, активируя транскрипцию киназы гемопоэти-ческих клеток человека и поверхностного грануло-цитарного маркера CD11b [25, 26]. ТФ С/ЕВР альфа контролирует остановку Пф и необходим для гра-нулоцитарной дифференцировки миелоидных клеток-предшественников. Мутации в гене С/ЕВР альфа приводят к блоку дифференцировки [27]. Роль как онкосупрессора больше изучена на примере солидных опухолей, например колоректального рака [28], но также было показано снижение экспрессии в клетках, полученных от больных ОМЛ [29].
ТФ AP-2 альфа негативно регулирует прото-онкоген с-МУС и С/ЕВР альфа, что было показано на примере солидных опухолей [30, 31]. Супрессия с-МУС, многократно амплифицированного в клетках линии HL-60, ведет к торможению Пф и опухолевого роста, в то время как ингибирование С/ЕВР альфа, как было упомянуто выше, препятствует прохождению дифференцировки в контексте ОПЛ, что может указывать на сложную роль AP-2 альфа в биологии лейкозов и определяет терапевтический потенциал данного ТФ с точки зрения как ингибирования, так и активации.
Наконец, среди молекул модельных схем, идентифицированных в ядерной и/или цитозольной фракции клеток линии HL-60 на белковом уровне, оказались ключевые молекулы — HDAC1 и RNF96, что усиливает их значимость в качестве потенциальных терапевтических мишеней. Также масс-спектроме-трическим методом удалось зарегистрировать ряд промежуточных молекул, участвующих в передаче сигнала от ключевых молекул к ТФ модельных схем, и задействованных в регуляции КЦ (CDK2), репарации ДНК (DNA-PKcs), убиквитинилирования (иЬс9) и апопотоза (р38 альфа).
Заключение
Применение комбинации методов высокопроизводительного протеомного анализа и биоинформати-ческого моделирования в исследовании ATRA-инду-цированной дифференцировки клеток линии HL-60 позволило выявить ключевые молекулы — HDAC1 и RNF96 (TRIM28), с наибольшей вероятностью регулирующие дифференциально экспрессирую-щиеся белки активируемого и ингибируемого кластеров соответственно, которые можно рассматривать как потенциальные терапевтические мишени «1-й линии». Потенциальными терапевтическими мишенями «2-й линии» являются ТФ, присутствующие в модельных схемах регуляции белков активируемого и ингибируемого кластеров, такие как Вс1-6, ER альфа, Б0Х2, Бр1, С/ЕВР альфа и СРВР (онкосупрессор KLF6). К настоящему моменту были осуществлены попытки целевого фармакологического воздействия на ряд молекул модельных схем, в то же время такие функционально важные молекулы, как RNF96 (TRIM28), СРВР (онкосупрессор KLF6) ранее не рассматривались в контексте ОПЛ и представляют большой интерес с точки зрения терапевтического воздействия.
В данном исследовании мы провели моделирование молекулярного каскада в направлении «снизу вверх», начиная от белков с измененным содержанием через ТФ их регулирующие, до ключевых молекул, с наибольшей вероятностью регулирующих дифференциально экспрессирующиеся белки. Предложенный подход к моделированию подразумевает предсказание более ранних молекулярных событий по отношению к временной точке, в которой белки дифференциально экспрессировались (96 ч), поэтому для предсказанных ключевых молекул и ТФ мы предполагаем наиболее выраженный регуляторный эффект и терапевтический потенциал. В то же время сама концепция построения модельных сигнальных сетей не подразумевала выбор одной молекулы как мишени для фармакологического воздействия. Начальный этап поиска, представленный в работе, направлен на определение панели потенциальных терапевтических мишеней на основании их регуляторных свойств,
нодго
которые мы оценивали с помощью биоинформатиче-ского предсказания, и факта изменений в экспрессии в выбранной модельной клеточной линии на уровне белка, определяемых масс-спектрометрическим методом.
Разработанная платформа, сочетающая высокопроизводительное масс-спектрометрическое профи -лирование и биоинформатическое предсказание ключевых регуляторов, была опробована на стабильной клеточной линии HL-60, представляющей удобный объект для пилотного исследования. При этом следует учитывать, что экстраполяция результатов, получаемых для стабильной клеточной линии, на биологические процессы in vivo ограничена, прежде всего, в связи с изменениями характеристик клеток, происходящими при многих пассажах культивирования. Для валида-ции полученных в данном исследовании моделей требуются дополнительные эксперименты с внедрением экспрессионных конструкций или нокдауном генов, соответствующих потенциальным терапевтическим мишеням. Сильной стороной представленной платформы является ее применимость к моделям, более точно отражающим свойства биологического объекта in vivo, например к первичным культурам клеток. Применимость разработанной платформы не зависит от используемого ингибитора или индуктора, что об-
условливает хороший потенциал для исследований в области персонализированной медицины.
Конфликт интересов/Conflict of interest
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflict of interest.
Финансирование/Financing
Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013—2020 гг. с использованием оборудования Центра коллективного пользования «Про-теом человека» (ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Орехови-ча»), поддержанного Минобрнауки России (уникальный идентификатор проекта RFMEFI62117X0017).
The research was carried out within the framework of the Program of Fundamental Scientific Research of the State Academies of Sciences for 2013—2020 using the equipment of the Center for Collective Use "Human Proteome" (V.N. Orekhovich Scientific Research Institute of Biomedical Chemistry), supported by the Ministry of Education and Science of Russia (unique identifier of the project RFMEFI62117X0017).
u u
Р
3
2018 | ||
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Di Girolamo F., Lante I., Muraca M., Putignani L. The Role of Mass Spectrometry in the "Omics" Era. Curr Org Chem 2013;17(23):2891-905.
doi: 10.2174/1385272817888131118162725.
2. Wu H.Y., Goan Y.G., Chang Y.H. et al. Qualification and "Verification of Serological Bio-marker Candidates for Lung Adenocarcinoma by Targeted Mass Spectrometry. J Proteome Res 2015;14(8):3039-50. doi: 10.1021/pr501195t.
3. Naryzhny S.N., Zgoda V.G., Maynskova MA. et al. Combination of virtual and experimental 2DE together with ESI LC-MS/MS gives a clearer view about proteomes of human cells and plasma. Electrophoresis 2016;37(2):302—9. doi: 10.1002/elps.201500382.
4. Kopylov A.T., Ilgisonis E.V., Moysa AA. et al. Targeted Quantitative Screening of Chromosome 18 Encoded Proteome in Plasma Samples of Astronaut Candidates. J Proteome Res 2016;15(11):4039-46.
doi: 10.1021/acs.jproteome.6b00384.
5. Novikova S.E., Tikhonova O.V., Kurbatov L.K. et al. Application of selected reaction monitoring and parallel reaction monitoring for investigation of HL-60 cell line differentiation. Eur J Mass Spectrom (Chichester) 2017;23(4):202-8. doi: 10.1177/1469066717719848.
6. Breitman T.R., Selonick S.E., Collins S.J. Induction of differentiation of the human promyelocyte leukemia cell line (HL-60) by retinoic acid. Proc Natl Acad Sci U S A 1980;77(5):2936-40. PMID: 6930676.
7. Dalton WT., Ahearn M.J., McCredie K.B. et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood 1988;71(1):242-7. PMID: 3422031.
8. Liu S.M., Chen W, Wang J. Distinguishing between cancer cell differentiation and resistance induced by all-trans retinoic acid using transcriptional profiles and functional pathway analysis. Sci Rep 2014;4:5577.
doi: 10.1038/srep05577.
9. TasseffR., Jensen HA, Congleton J. et al. An Effective Model ofthe Retinoic Acid Induced HL-60 Differentiation Program. Sci Rep 2017;7(1):14327. doi: 10.1038/s41598-017-14523-5.
10. Zheng P.Z., Wang K.K., Zhang Q.Y. et al. Systems analysis of transcriptome and proteome in retinoic acid/arsenic trioxide-induced cell differentiation/apoptosis of promyelocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102(21):7653-8.
doi: 10.1073/pnas.0502825102.
11. Bertagnolo V., Grassilli S., Bavelloni A. et al. Vav1 modulates protein expression during AT-RA-induced maturation ofAPL-derived promy-
elocytes: a proteomic-based analysis. J Proteome Res 2008;7(9):3729-36. doi: 10.1021/pr7008719.
12. Valiuliene G., Stirblyte I., Cicenaite D. et al. Belinostat, a potent HDACi, exerts antileukae-mic effect in human acute promyelocytic leukaemia cells via chromatin remodeling. J Cell Mol Med 2015;19(7):1742-55.
doi: 10.1111/jcmm.12550.
13. Simicevic J., Schmid A.W., Gilardoni P.A. et al. Absolute quantification of transcription factors during cellular differentiation using multiplexed targeted proteomics. Nat Methods 2013;10(6):570-6. doi: 10.1038/nmeth.2441.
14. Wisniewski J.R., Zougman A., Nagaraj N., Mann M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods 2009;6(5):359-62. doi: 10.1038/nmeth.1322.
15. Tickenbrock L., Klein H.U., Trento C. et al.; Study Alliance Leukemia Group. Increased HDAC1 deposition at hematopoietic promoters in AML and its association with patient survival. Leuk Res 2011;35(5):620-5.
doi: 10.1016/j.leukres.2010.11.006.
16. Fredly H., Gjertsen B.T., Bruserud O. Histone deacetylase inhibition in the treatment of acute myeloid leukemia: the effects of valproic acid on leukemic cells, and the clinical and experimental evidence for combining valproic acid with other antileukemic agents. Clin Epigenetics 2013;5(1):12.
doi: 10.1186/1868-7083-5-12.
17. Min C., Moore N., Shearstone J.R. et al. Selective Inhibitors of Histone Deacetylases 1 and 2 Synergize with Azacitidine in Acute Myeloid Leukemia. PLoS One 2017;12(1):e0169128.
doi: 10.1371/journal.pone.0169128.
18. Wang C., Ivanov A., Chen L. et al. MDM2 interaction with nuclear corepressor KAP1 contributes to p53 inactivation. EMBO J 2005;24(18):3279-90.
doi: 10.1038/sj.emboj.7600791.
19. Lee Y.K., Thomas S.N., Yang A.J., Ann D.K. Doxorubicin down-regulates Kruppel-associat-ed box domain-associated protein 1 sumoylation that relieves its transcription repression on p21WAF1/CIP1 in breast cancer MCF-7 cells. J Biol Chem 2007;282(3):1595-606. doi: 10.1074/jbc.M606306200.
20. Hurtz C., Hatzi K., Cerchietti L. et al. BCL6-mediated repression of p53 is critical for leukemia stem cell survival in chronic myeloid leukemia. J Exp Med 2011;208(11):2163-74. doi: 10.1084/jem.20110304.
21. Rota S.G., Roma A., Dude I. et al. Estrogen Receptor p Is a Novel Target in Acute Myeloid
Leukemia. Mol CancerTher 2017;16(11):2618-26. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-17-0292.
22. Sánchez-Aguilera A., Arranz L., Martín-Pérez D. et al. Estrogen signaling selectively induces apoptosis of hematopoietic progenitors and myeloid neoplasms without harming steady-state hematopoiesis. Cell Stem Cell 2014;15(6):791-804.
doi: 10.1016/j.stem.2014.11.002.
23. Picot T., Aanei C.M., Fayard A. et al. Expression of embryonic stem cell markers in acute myeloid leukemia. Tumour Biol 2017;39(7):1010428317716629.
doi: 10.1177/1010428317716629.
24. Garros-Regulez L., Garcia I., Carrasco-Garcia E. et al. Targeting SOX2 as a Therapeutic Strategy in Glioblastoma. Front Oncol 2016;6:222. doi: 10.3389/fonc.2016.00222.
25. Hauses M., Tonjes R.R., Grez M. The transcription factor Sp1 regulates the myeloid-spe-cific expression of the human hematopoietic cell kinase (HCK) gene through binding to two adjacent GC boxes within the HCK promoter-proximal region. J Biol Chem 1998;273(48):31844-52. PMID: 9822652.
26. Chen H.M., Pahl H.L., Scheibe R.J. et al. The Sp1 transcription factor binds the CD11b promoter specifically in myeloid cells in vivo and is essential for myeloid-specific promoter activity. J Biol Chem 1993;268(11):8230-9. PMID: 8096519.
27. Pabst T., Mueller B.U., Zhang P. et al. Dominant-negative mutations of CEBPA, encoding CCAAT/enhancer binding protein-alpha (C/EBPalpha), in acute myeloid leukemia. Nat Genet 2001;27(3):263-70. doi: 10.1038/85820.
28. Reeves H.L., Narla G., Ogunbiyi O. et al. Kruppel-like factor 6 (KLF6) is a tumor-suppressor gene frequently inactivated in colorectal cancer. Gastroenterology 2004;126(4):1090-103. PMID: 15057748.
29. Humbert M., Halter V., Shan D. et al. Deregulated expression of Kruppel-like factors in acute myeloid leukemia. Leuk Res 2011;35(7):909-13.
doi: 10.1016/j.leukres.2011.03.010.
30. Yu L., Hitchler M.J., Sun W. et al. AP-2alpha Inhibits c-MYC Induced Oxida-tive Stress and Apoptosis in HaCaT Human Keratinocytes. J Oncol 2009;2009:780874. doi: 10.1155/2009/780874.
31. Bennett K.L., Romigh T., Arab K. et al. Activator protein 2 alpha (AP2alpha) suppresses 42 kDa C/CAAT enhancer binding protein alpha (p42(C/EBPalpha)) in head and neck squamous cell carcinoma. Int J Cancer 2009;124(6):1285-92. doi: 10.1002/ijc.24087.
Статья поступила в редакцию: 25.05.2018. Принята в печать: 06.07.2018. Article was received by the editorial staff: 25.05.2018. Accepted for publication: 06.07.2018.
