CC BY
84
УДК 577.322.5
Моделирование полноразмерной структуры шаперона Hsp70 человека и изучение его междоменных взаимодействий
К. А. Черноризов1, В. К. Швядас1,2 *
'Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, 1, стр. 73 ■Государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, 1, стр. 73 *E-mail: vytas@belozersky.msu.ru Поступила в редакцию 02.11.2010 г.
РЕФЕРАТ Hsp70 - белок из класса шаперонов, принимающий участие в сворачивании de novo синтезированных белковых молекул, в защите гидрофобных участков денатурировавших белков, а также в регуляции апоптоза, иммунного ответа и ряда других клеточных процессов. Несмотря на большое количество работ, посвященных функционированию и структуре Hsp70, достоверная полноразмерная структура этого белка неизвестна. На основании структуры отдельных доменов Hsp70 различных организмов и их элементов при помощи методов молекулярного моделирования сконструированы несколько возможных вариантов полноразмерного Hsp70 человека. Стабильность этих структур изучена с помощью метода молекулярной динамики. В результате проведенного анализа отобрана наиболее адекватная модель, построенная на основании элементов Hsp70 быка (Bos taurus) и нематоды (Caenorhabditis elegans). С помощью метода управляемой молекулярной динамики выявлены ключевые солевые мостики, связывающие домены друг с другом: Arg171 : Glu516 и Arg416 : Glu218. Предложена схема механизма, запускающего гидролиз АТР и приводящего к расхождению АТР-азного и субстратсвязывающего доменов Hsp70.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА шаперон, Hsp70, модель, третичная структура, АТР-азный домен, субстратсвязывающий домен, молекулярная динамика.
ВВЕДЕНИЕ
Hsp70 (Heat shock 70 kDa protein 1A/1B) - двудоменный АТР-зависимый белок из класса шаперонов, защищающий гидрофобные поверхности денатурируемых в стрессовых условиях белков от агрегации и обеспечивающий их дальнейшее правильное сворачивание или же отправку на деградацию. Белки этого класса принимают участие в транспорте пептидных структур через митохондриальные и клеточные мембраны, эндоцитозе. В зависимости от внеклеточной или внутриклеточной локализации такие белки участвуют соответственно в аутоиммунном маркировании опухолевых клеток или в их защите от стрессов и апоптоза [1, 2]. Глобула Hsp70 состоит из двух функционально различных элементов: N-концевой АТР-азный домен гидролизует АТР до ADP с образованием неорганического фосфата; С-концевой домен присоединения субстрата связывает гидрофобные пептиды. АТР-азный домен образован двумя круп-
ными субдоменами I и II, каждый из которых условно разделен на участки А и В (см. рис. 1). Между субдоменами I и II располагается щель, на дне которой связывается АТР. АТР-азный домен содержит также участок присоединения фактора обмена нуклеотида, который, раздвигая субдомены I и II, способствует «перезарядке» АDP на АТР [3, 4].
Домен присоединения субстрата (SBD, Substrate Binding Domain) состоит из Р-листового субдомена (PSBD), связывающего субстратный пептид, и а-спиральной «крышки» (a SBD), образованной пятью а-спиралями A, B, С, D и Е (см. рис. 1). За счет конформационных изменений, опосредованных гидролизом АТР и действием кошаперона Hsp40, субстратсвязывающий домен способен переходить из закрытого в открытое состояние, при этом «крышка» регулирует доступность субстратсвя-зывающего домена для гидрофобных участков пептидов-мишеней [5].
Рис. 1. АТР-азный домен Hsp70 человека в комплексе с ADP (слева; pdb ID 1HJO [6]) и субстрат-связывающий домен шаперона DnaK E. coli, прокариотического гомолога Hsp70 (справа; желтым отмечен aSBD, зеленым - ßSBD, красным - субстратный пептид; pdb ID 1DKZ) [7].
Опосредуемые кошапероном Hsp40 гидролиз АТР и присоединение субстрата приводят к отделению субстратсвязывающего домена Шр70 от АТР-азного домена, в результате чего они остаются связанными гидрофобным линкером. Известно, что Шр70 способен образовывать в растворе олигомеры. Скорее всего, это происходит за счет того, что субстратсвязыва-ющий домен Шр70 способен связывать гидрофобный линкер другой молекулы Шр70 в момент, когда ее домены разобщены [8, 9].
Гидролиз АТР индуцируется J-доменом кошапе-рона Шр40. Изучение связывания Шр70 и Шр40 показало, что остаток аспарагиновой кислоты (Asp35) J-домена Шр40 дрожжей взаимодействует с остатком А^171 Шр70, что влечет за собой гидролиз АТР и последующее отделение доменов Шр70 друг от друга. Предполагается, что сигнал к гидролизу АТР идет по цепочке J-домен Шр40 ^ А^171 (линкер Шр70) ^ Туг371(АТР-азный домен Hsp70) ^ 11е181(АТР-азный домен Шр70) [10-12], после чего происходит связывание субстратного пептида и расхождение доменов. Точный механизм этого процесса еще не известен.
Предполагается, что структура пептидсвязыва-ющего домена Hsp70 млекопитающих аналогична структуре подобного домена у их прокариотического гомолога DnaK (рис. 1) [7]. Хотя установлена структура отдельных элементов субстратсвязывающего домена Шр70 [11, 13], однако полноразмерная трехмерная структура Шр70 млекопитающих на данный момент неизвестна. В настоящей работе предпринята попытка построения трехмерной структуры полноразмерного Шр70 при помощи методов молекулярного моделирования. Структура представляет интерес не только при изучении взаимодействия АТР-азного и субстратсвязывающего доменов ша-перона, но и как перспективная мишень при поиске противоопухолевых препаратов. В силу своих иммуногенных свойств шапероны служат объектом
успешных фармакологических исследований [5, 14]. Получение достоверной структуры шаперона Hsp70 человека и продвижение в понимании механизма его функционирования поможет ускорить и удешевить исследования в области шаперон-ассоциированных стратегий терапии онкологических заболеваний.
экспериментальная часть
Моделирование по гомологии проводили с помощью сервиса Swiss Model [15, 16]. Подготовку системы для расчетов молекулярной динамики осуществляли в программе tleap (пакет программ AmberTools 1.2). Молекулярную динамику проводили в пакете программ Amber10 [17]. Молекулу белка помещали в ячейку кубической формы таким образом, чтобы расстояние от белка до ее стенок было не менее 12 А. В качестве растворителя использовали воду Т1Р3Р. Шаг интегрирования на всех этапах принимали равным 2 фс. Минимизация энергии ограничивалась 5000 шагов, алгоритм steepest descent сменялся на conjugated gradient после 2500 шагов. Радиус обрезки электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий (cutoff distance) составлял 10 А.
Исследуемые структуры приводили в равновесие в четыре этапа: минимизация энергии с силовыми ограничениями на все атомы белка, минимизация энергии без силовых ограничений, разогрев и молекулярная динамика. Разогрев от 0 до 300 K производили при постоянном объеме в течение 50 пс. Молекулярную динамику проводили при постоянном давлении. Для контроля температуры использовали термостат Ланжевена. Эти же параметры использовали для запуска управляемой молекулярной динамики. При симуляциях разрыва солевых мостиков силовую константу принимали равной 20 ккал/моль-А2.
Для визуального анализа трехмерных структур использовали программу VMD 1.8.6 [18].
Рис. 2. Модель к)^р70_2р32 после уравновешивания. АТР-азный домен обозначен синим цветом, aSBD - желтым, PSBD -зеленым.
результаты и обсуждение
Моделирование полноразмерной структуры Hsp70
При моделировании использовали следующие элементы банка данных структур белков (PDB): суб-стратсвязывающий домен DnaK Escherichia coli (1DKZ; рис. 1); а-субдомен субстратсвязывающего домена нематоды Caenorhabditis elegans (2P32 [19]); АТР-азный домен, ßSBD и а-спираль ‘А’ aSBD Hsc70 быка Bos taurus (1YUW). Последняя структура описывает контакт АТР-азного домена с суб-стратсвязывающим доменом в момент, когда домены жестко сцеплены друг с другом.
Модель hHsp70_1dkz
Моделирование проводили в три стадии:
1. По аминокислотной последовательности Hsp70 человека (human Hsp70, hHsp70) (PID: P08107) и третичной структуре его близкого гомолога из B. taurus - Hsc70 (1YUW), построена модель, описывающая АТР-азный домен, ßSBD и спираль ‘А’ aSBD. Идентичность сконструированной структуры и шаблона составляла 88.6%. Для получения полноразмерной структуры требовалось достроить оставшуюся часть aSBD.
2. В качестве шаблона для построения aSBD ис-
пользовали структуру DnaK (прокариотического гомолога Hsp70) 1DKZ, где а-субдомен в комплексе с Р-субдоменом образовывали полноразмерный суб-стратсвязывающий домен. Идентичность сконструированной структуры и шаблона составляла 44.7%.
3. Полученные структуры накладывали друг на друга по PSBD. После наложения в результирующей структуре оставили PSBD из модели, построенной по гомологии с 1YUW.
Таким образом была создана конструкция, АТР-азный домен и Р-субдомен SBD которой построены по гомологии с близким эукариотическим родственником Hsp70, а aSBD - по гомологии с прокариотическим шапероном DnaK из E. coli. Модель уравновешивали с помощью симуляции молекулярной динамики в течение 6.5 нс.
Анализ молекулярно-динамической траектории показал, что пространственные структуры АТР-азного домена и PSBD стабильны, в то время как сегмент aSBD, образованный a-спиралями ‘B’-‘E’, склонен к разворачиванию.
Модель hHsp70_2p32
В качестве альтернативного гомологичного шаблона для моделирования нестабильного участка aSBD использовали соответствующую структуру из орга-
низма нематоды (C. elegans; PDB ID: 2P32). С помощью сервиса SwissModel проведено моделирование элементов aSBD hHsp70, которые совпадали по выравниванию с аминокислотной последовательностью структуры 2P32 (аминокислотные остатки 533-614). Идентичность полученной структуры и шаблона составляла 63%. Созданные конструкции накладывали на модель hHsp70_1dkz по a-спирали ‘B’, после чего часть a-спирали ‘B’, а также спирали ‘C’, ‘D’ и ‘E’ заменяли на соответствующие элементы, построенные по гомологи с 2P32. Полученную модель уравновешивали в течение 8.5 нс.
Структура hHsp70_2p32 после уравновешивания изображена на рис. 2. Спирали ‘B’, ‘C’ и ‘D’ образуют пучок, похожий по третичной структуре на 1DKZ, однако, в отличие от него, в hHsp70_2p32 a-спираль ‘E’ редуцировалась. По данным анализа молекулярнодинамической траектории построенная структура проявила высокую стабильность и была принята в качестве рабочей для дальнейших исследований.
Изучение междоменных взаимодействий hHsp70
В процессе функционирования исследуемого шапе-рона образующие его домены расходятся с разрывом всех нековалентных взаимодействий между ними, в результате чего остаются связанными лишь меж-доменным линкером.
С помощью метода управляемой молекулярной динамики (Steered Molecular Dynamics) изучен процесс расхождения доменов. Выявлены ключевые для этого процесса солевые мостики и показано, что обратное сближение доменов не зависит от изменения конформации АТР-азного домена. В качестве модели использовали hHsp70_2p32 (в дальнейшем просто hHsp70).
Разрыв солевого мостика Arg171 : Glu516
По данным работы [12], расхождение доменов начинается с опосредованного кошапероном Hsp40 разрыва солевого мостика Arg171 : Glu516, соединяющего a-спираль ‘А’ субстратсвязывающего домена с субдоменом 1А АТР-азного домена. Моделирование этого процесса проведено с помощью метода управляемой молекулярной динамики путем имитации раздвижения С^атомов указанных аминокислотных остатков на 10 Á. Исходное расстояние между атомами составляло 12 Á (расстояние между взаимодействующими участками - 4 Á).
Общая работа, затраченная на раздвижение указанных атомов, составила 34.3 ккал/моль. Примечательно, что после фактического разрыва солевого мостика Arg171 : Glu516 среднее расстояние между петлями АТР-азного домена, фиксирующими Р- и у-фосфаты АТР, сократилось на 2 Á (с 8 до 6 Á; рис. 3). Теоретически подобное движение в нативном
Рис. 3. Перестройка солевых мостиков при расхождении доменов hHsp70: справа разорванный солевой мостик Агд171 : Glu516, слева второй мостик Агд416 : Glu218 до симуляции его разрыва. Красным отмечен в-лист, включающий Glu218 и петлю, фиксирующую АТР. Вторая петля, принимающая участие в фиксации, отмечена серым цветом.
ферменте может вызывать гидролиз АТР. В таком случае солевой мостик А^171 : Glu516 сдерживает АТР-азный домен hHsp70 от спонтанного гидролиза АТР, а кошаперон, разрывая эту связь, тем самым инициирует этот процесс.
Полученная структура уравновешивалась в течение 1 нс. Тенденций к восстановлению разорванной связи А^171 : Glu516, как и к дальнейшему расхождению доменов, при этом не выявлено.
Разрыв солевого мостика А^416 : 01и218
Разрыв мостика А^171 : Glu516 привел лишь к частичному отделению доменов друг от друга, однако окончательного расхождения не произошло. В связи с этим предстояло выявить наиболее стабильные в ходе предыдущих молекулярно-динамических исследований нековалентные связи, разрыв которых мог бы привести к полному расхождению доменов hHsp70.
Первоначально был выбран солевой мостик А^155 : Glu523, соединяющий а-спираль ‘А’ с субдоменом 1А, однако его разрыв не привел к расхождению доменов и не выявил никаких тенденций к по-
Разрыв солевого мостика Arg416:Glu218
Рис. 4. Работа, затраченная на второй этап симуляции расхождения АТР-азного и субстратсвязывающего доменов.
ложительному развитию процесса. Отрицательный результат позволил сделать вывод о том, что, скорее всего, связью, ключевой для расхождения доменов, остается солевой мостик Arg416 : Glu218, соединяющий один из поворотов Р-субдомена SBD с субдоменом IIA АТР-азного домена.
Исходное расстояние между С -атомами аминокислотных остатков, образующих связь, составляло 12.2 А, после имитации разрыва - 22.2 А. Общая работа, затраченная на разрыв этой связи, составила 33.4 ккал/моль. На кривой, отображающей этот процесс, наблюдается скачок: увеличение расстояния с 13.4 до 14.7 А, сопровождавшееся непосредственным разрывом интересующей нас связи, потребовало около 7 ккал/моль (рис. 4).
Работа, затраченная на разрыв связи, равна энергии, выделяющейся при гидролизе АТР, поэтому можно предположить, что разрыв макроэргической связи в АТР в АТР-азном домене (предположительно вызванный разрывом мостика Arg171 : Glu516) требуется для разрыва солевого мостика Arg416 : Glu218. Glu218 является частью P-листа (образованного аминокислотными остатками 192-226 и 332-338; рис. 5), второй P-поворот которого непосредственно фиксирует Р- и у-фосфаты молекулы АТР. Первый P-поворот принимает участие в связывании АТР-азного и субстратсвязывающего доменов. Учитывая тот факт, что P-лист является жесткой структурой, его смещение, опосредованное гидролизом АТР, вполне может вызвать разрыв второй связи, необходимой для расхождения доменов.
Как и ожидалось, симуляция разрыва связи Arg416 : Glu218 привела к полному расхождению доменов. Полученная структура уравновешивалась на протяжении 1.5 нс, в течение которых никаких значительных изменений в структуре исследуемого шаперона не замечено.
В процессе моделирования расхождения доменов выяснился интересный факт: освободившиеся от солевых мостиков остатки А^416 и Glu516 в дальнейшем образовали друг с другом новый солевой мостик (см. рис. 5). Образование аналогичного солевого мостика стерически возможно и между А^171 и Glu218.
На основании этих данных можно сделать вывод о важной роли междоменных солевых мостиков в функционировании hHsp70: мостики А^171 : Glu516 и А^416 : Glu218 связывают АТР-азный и субстратсвязывающий домены, однако по мере расхождения доменов партнеры перестраиваются и образуются солевые мостики А^171 : Glu218 и А^416 : Glu516, которые стабилизируют новое структурное состояние шаперона.
Симуляция раздвижения субдоменов I и II
В процессе обмена нуклеотида АТР-азный и субстрат-связывающий домены сходятся обратно, однако силы, заставляющие их это сделать, достоверно не установлены. Стохастический характер схождения доменов представляется маловероятным. Ввиду того, что обмен нуклеотида проходит при разобщенных доменах и сопровождается взаимодействием АТР-азного домена с фактором обмена нуклеотидов, естественно пред-
Рис 5. hHsp70 после симуляции расхождения доменов. Красным отмечен в-лист, движение которого сопровождается разрывом второго солевого мостика Glu218 : Агд416. Пунктиром обозначен образовавшийся после расхождения доменов солевой мостик Glu516 : Агд416.
положить, что раздвижение субдоменов I и II фактором нуклеотидного обмена теоретически способно повлиять на схождение АТР-азного и субстратсвязывающего доменов. Мы провели моделирование этого процесса. При симуляции раздвижения субдоменов I и II точками приложения силы являлись атомы азота, принадлежащие остаткам Thr14 и Gly203, непосредственно взаимодействующим с АТР/ADP.
Исходное расстояние между ними составляло 7.3 Â, конечное - 14.3 Â Несмотря на теоретическую возможность того, что обмен нуклеотида повлияет на схождение доменов, мы получили достаточно предсказуемый результат: изменение расстояния между субдоменами I и II никак не отразилось на взаимодействии доменов друг с другом. Этот результат говорит о том, что схождение доменов, вероятнее всего, опосредуется неким белком, которым вполне может быть другой шаперон hHsp70. Теоретически он способен связать высвободившийся при расхождении доменов гидрофобный линкер в качестве субстрата и таким образом сблизить разошедшиеся домены. Однако эта гипотеза требует дальнейшей проверки.
выводы
На основании проведенного исследования можно предложить следующую схему функционирования hHsp70: при взаимодействии с J-доменом кошапе-рона Hsp40 происходит разрыв солевого мостика Arg171 : Glu516, что приводит к сближению петель, фиксирующих АТР, и способствует гидролизу АТР.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Multhoff G., Pfister K., Gehrmann M., Hantschel M., Gross C., Hafner M., Hiddemann W. // Cell Stress Chaperones. 2001. V. 6. № 4. P. 337-344.
2. Schmitt E., Gehrmann M., Brunet M., Multhoff G., Garrido C. // J. Leukoc. Biol. 2007. V. 81. № 1. P. 15-27.
3. Vogel M., Bukau B., Mayer M.P. // Mol. Cell. 2006. V. 21. № 3.
P. 359-367.
4. Nollen E.A., Kabakov A.E., Brunsting J.F., Kanon B., Höh-feld J., Kampinga H.H. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 7.
P. 4677-4682.
5. Гужова И.В., Новоселов С.С., Маргулис Б.А. // Цитология.
2005. Т. 47. № 3. С. 187-199.
6. Osipiuk J., Walsh M.A., Freeman B.C., Morimoto R.I., Joachimiak A. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 1999.
V. 55. № 5. P. 1105-1107.
7. Zhu X., Zhao X., Burkholder W.F., Gragerov A., Ogata C.M., Gottesman M.E., Hendrickson W.A. // Science. 1996. V. 272.
№ 5268. P. 1606-1614.
8. Chang Y., Sun Y., Wang C., Hsiao C. // J. Biol. Chem. 2008.
V. 283. № 22. P. 15502-15511.
9. Freeman B.C., Myers M.P., Schumacher R., Morimoto R.I. // EMBO J. 1995. V. 14. № 10. P. 2281-2292.
10. Mitra A., Shevde L.A., Samant R.S. // Clin. Exp. Metastasis. 2009. V. 26. № 6. P. 559-567.
11. Chou C., Forouhar F., Yeh Y., Shr H., Wang C., Hsiao C. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 32. P. 30311-30316.
Гидролиз АТР, в свою очередь, сопровождается смещением ß-листа, содержащего одну из петель, фиксировавших АТР, и расположенного в области междоменного контакта остатка Glu218, что влечет за собой разрыв солевого мостика Arg416 : Glu218. Разрыв солевого мостика Arg416 : Glu218 приводит к расхождению АТР-азного и субстратсвязывающего доменов, а остаток Arg416 образует солевой мостик с G1u516, входящим в субстратсвязывающий домен. Остаток Arg171, в свою очередь, образует новый солевой мостик с Glu218, и происходит перегруппировка солевых мостиков, ранее связывавших АТР-азный и субстратсвязывающий домены hHsp70.
Роль фактора обмена нуклеотида в функционировании hHsp70, по-видимому, заключается не только в обмене ADP на новую молекулу ATP, но и в фиксации субдоменов I и II в раздвинутом состоянии, которое сопровождается сближением АТР-азного и субстратсвязывающего доменов с образованием солевого мостика Arg171 : G1u516, что образно может быть охарактеризовано как «взведение курка» для осуществления гидролиза следующей молекулы АТР. «Пальцем», способным вновь нажать на этот курок, является J-домен кошаперона Hsp40.
Построенная и уравновешенная модель Hsp70 человека доступна в депозитарии PMDB [20, 21] (PMDB id: PM0076412).
Работа была поддержана грантом РФФИ 09-04-92744-ННИОМ а.
12. Jiang J., Maes E.G., Taylor A.B., Wang L., Hinck A.P., Lafer E.M., Sousa R. // Mol. Cell. 2007. V. 28. № 3. P. 422-433.
13. Jiang J., Prasad K., Lafer E.M., Sousa R. // Mol. Cell. 2005.
V. 20. № 4. P. 513-524.
14. Mazzaferro V., Coppa J., Carrabba M.G., Rivoltini L., Schiavo M., Regalia E., Mariani L., Camerini T., Marchiano A., An-dreola S., Camerini R., Corsi M., Lewis J.J., Srivastava P.K., Parmiani G. // Clin. Cancer Res. 2003. V. 9. № 9. P. 3235-3245.
15. Arnold K., Bordoli L., Kopp J., Schwede T. // Bioinformatics.
2006. V. 22. P. 195-201.
16. Kiefer F., Arnold K., Künzli M., Bordoli L., Schwede T. // Nucl. Acids Res. 2009. V. 37. P. 387-392.
17. Case D.A., Darden T.A., Cheatham T.E., Simmerling C.L., Wang J., Duke R.E., Luo R., Crowley M., Walker R.C., Zhang W., Merz K.M., Wang B., Hayik S., Roitberg A., Seabra G., Kolossvary I., Wong K.F., Paesani F., Vanicek J., Wu X., Brozell
S.R., Steinbrecher T., Gohlke H., Yang L., Tan C., Mongan J., Hornak V., Cui G., Mathews D.H., Seetin M.G., Sagui C., Babin V., Kollman P.A. // AMBER 10. San Francisco: University of California, 2008.
18. http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/vmd-1.8.6/
19. Worrall L.J., Walkinshaw M.D. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 357. P. 105-110.
20. http://mi.caspur.it/PMDB/main.php
21. Castrignano T., De Meo P.D., Cozzetto D., Talamo I.G., Tramontano A. // Nucl. Acids Res. 2006. V. 34. P. 306-309.
