CC BY
111
МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА У КРЫС ВВЕДЕНИЕМ ТРИПСИНА И ЗМЕИНОГО ЯДА
Владимир Георгиевич ВИСКУНОВ1,2, Александр Борисович ПУПЫШЕВ1, Светлана Ивановна ПРОцЕНКО1, Александр Петрович НАДЕЕВ1, Марина Александровна СИНИЦЫНА2, Александр Михайлович ФЕЩЕНКО3, Заза Юзаевич ЧУБЕНИДЗЕ3
1 ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава 630091, Новосибирск, Красный проспект, 52
2 ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2
3 Городская клиническая больница № 25 630075, Новосибирск, ул. А. Невского, 1а
Внутрипанкреатические инъекции крысам трипсина (50 мг/кг массы тела) или змеиного яда гадюки обыкновенной (V;рега Ьегш L.) (1 мг/кг) вызывают сходные картины острого геморрагического панкреатита, близкую динамику поражения других органов брюшной полости и в обеих сериях смертность 70—80 % животных (24 ч). Вероятным механизмом развития острого панкреатита может быть наличие у трипсина и змеиного яда геморрагической активности, возможность активации экзогенным трипсином панкреатической фос-фолипазы А2 и в обоих случаях предполагаемая мембранолитическая атака ацинарных клеток фосфолипазой А2.
Ключевые слова: острый геморрагический панкреатит, трипсин, змеиный яд, крысы Вистар.
Острый панкреатит является многофакторной патологией, формирующейся с участием ранней активации секреторных ферментов (включая трипсин, амилазу, фосфолипазу А2), ишемизации органа, лабилизации лизосом, стимуляции образования свободных радикалов, локальным повышением уровня про-воспалительных цитокинов и т.д. [1, 2]. Экспериментальное моделирование панкреатита на животных достигается разнообразными методами: окклюзией панкреодуоденального протока, внутривенным введением высоких доз церулеина (аналога холецистокинина), фосфолипазы (ФЛ), локальным введением таурохолата натрия, трипсина и другими воздействиями [3].
«Трипсиновая» модель панкреатита достаточно хорошо отработана и воспроизводима. Сам фермент является сериновой протеиназой со свойствами эстеропротеазы. При локальном введении в поджелудочную железу (ПЖ) он вызывает геморрагический панкреонекроз [4]. Кроме того, он способен активировать реакции, являющиеся пусковыми в протеолитических каскадных системах крови [5]. В целом введение трипсина обусловливает развитие необратимого гемодинамического шока, геморрагиче-
ский панкреонекроз, формирование синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром) и полиорган-ной недостаточности с возможным летальным исходом [6].
Подобные процессы, в частности, протео-литическая атака трипсиноподобными про-теиназами, геморрагическое повреждение, ДВС-синдром вызываются и змеиным ядом. В змеином яде содержатся цитотоксины, ФЛ, геморрагины и др. патогенетически важные компоненты [7]. В нем обнаружены группы белков, обладающих свертывающей (факторы свертывания крови II, V, X), антисвертывающей (активаторы протеина С, ингибиторы образования протромбинового комплекса, фибрино-геназы) и геморрагической (тромбиноподобные ферменты, факторы агрегации тромбоцитов и повреждения сосудистой стенки) активностями [8]. Высока также активность ФЛ А2, способной вызывать повреждение мембран, в том числе и в клетках ПЖ [2].
Сходные биологические эффекты трипсина и змеиного яда способствовали созданию моделей поражения висцеральных органов трипсином и змеиным ядом и проведению сравнительной оценки таких поражений с осо-
Вискунов В.Г. — д.м.н., профессор, главн.н.с. лаборатории патофизиологии, общей патологии и патоморфологии
НИИРППМ, профессор кафедры госпитальной хирургии Новосибирского ГМУ, e-mail: apupyshev@mail.ru
Пупышев А.Б. — канд.б.н., старш.н.с., e-mail: apupyshev@mail.ru
Проценко С.И. — канд.м.н., ассистент кафедры поликлинической хирургии
Надеев А.П. — д.м.н., профессор, профессор кафедры патологической анатомии
Синицына М.А. — н.с. лаборатории патофизиологии, общей патологии и патоморфологии
Фещенко А.М. — канд.м.н., зам. главного врача
Чубенидзе З.Ю. — хирург-ординатор
бым вниманием к состоянию ПЖ и гемоди-намическим нарушениям.
Возможность экспериментального лечения острого панкреатита с помощью антисыворотки к змеиному яду описана достаточно давно, однако не получила дальнейшего развития. Наши исследования показывают, что антисыворотка к змеиному яду обладает терапевтической эффективностью, выходящей за рамки ее прямого назначения при укусах змей [9]. Принимая во внимание спектр действия антисыворотки, можно ожидать, что она способна ингибировать белковые геморрагические факторы змеиного яда, включая его трипсиноподобную активность, металлопротеиназы [10] и, таким образом, препятствовать системному действию змеиного яда. Кроме того, показано, что ингибирование ФЛ А2 резко снижает смертность от острого панкреатита [11], а высокий уровень фермента в змеином яде увеличивает летальный эффект. Вероятно, в антисыворотке имеется достаточно высокое содержание антител к протеиназам, геморраги-нам, ФЛ А2 и другим патогенетически активным факторам, что делает перспективным ее использование в терапии панкреатита и других патологий.
Цель исследования — разработка экспериментальной модели острого панкреатита и других поражений органной брюшной полости патологий для дальнейшего сравнительного анализа эффективности лекарственных средств.
Материал и методы исследования
В работе использованы крысы линии Вистар массой 200—250 г. Животным под эфирным наркозом вскрывали брюшную полость и в ПЖ по ходу общего панкреоби-лиарного протока со стороны его вхождения в двенадцатиперстную кишку вводили раствор трипсина (ООО «Самсон-Мед», Россия) в концентрации 10 мг/мл в дозе 50 мг/кг массы тела. Аналогичным образом вводили раствор яда гадюки обыкновенной (Ирвт Ьвгы8 L.) (ООО «Сибирский серпентарий», Россия) в концентрации 0,1 мг/мл в дозе 1 мг/кг массы тела. В каждую группу входило по 21 животному.
За морфологическими изменениями органов брюшной полости следили в течение 3,5 ч, в ряде случаев забирали выпот для анализа на амилазную активность. Затем брюшную полость зашивали с применением асептики, животных возвращали в клетки. На следующий день оценивали смертность; у выживших
крыс забирали материал на морфологическое исследование. Образцы органов фиксировали в 10%-м нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5—7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование проводили в универсальном микроскопе Leica DM 4000В (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры Leica DFC 320 (Германия) и компьютерной программы Leica QWin V3.0.
Результаты исследования
При использовании предложенных нами способов моделирования острого панкреатита у 100% животных при макроскопическом и микроскопическом исследовании выявлялись признаки данного заболевания. Летальность при введении трипсина составила 71,4% (15 летальных исходов), при введении змеиного яда — 80,9% (17 случаев гибели). Внешние эффекты действия трипсина и змеиного яда на ПЖ, прилегающие органы брюшной полости были очень сходными (табл.).
В обоих случаях в месте инъекции развивался серозный отек ПЖ, далее через 2—3 мин появлялась геморрагическая имбибиция ПЖ с постепенным распространением на весь орган. Одновременно с появлением геморрагий в ПЖ на фоне диффузного отека стенки двенадцатиперстной кишки возникали и участки очаговой геморрагической имбибиции ее стенки. Позднее развивалась гиперемия, возникали участки точечных кровоизлияний в области брыжейки и стенки толстой кишки. Через 12—15 мин в брюшной полости развивался серозный отек, прогрессивно нарастал геморрагический выпот с амилазной активностью до 1400—2000 ед. Видимые изменения печени проявлялись через 20—30 мин после инъекции токсинов и заключались в изменении ее цвета от вишневого до темно-фиолетового, иногда с наличием точечных желтоватых вкраплений по поверхности печени. В конце 2-го — начале 3-го часа отмечали многочисленные локальные изменения тонкой кишки на всем протяжении, а ПЖ приобретала черную окраску.
При последующем наблюдении с 2,5 до 3,5 ч нарастали некробиотические изменения в кишечнике, печени; в большинстве случаев наступала гибель животного. Гистологическое исследование выявило сходные изменения ПЖ при ее повреждении трипсином (рис. а)
Таблица
Поражения внутренних органов под действием трипсина и змеиного яда
Вещество Время наблю- дения Поджелудочная железа Двенадца- типерстная кишка Толстая кишка Печень Тонкая кишка
Трипсин 1-2 Формирование Изменения Изменения Изменения Изменения
(50 мг/кг) мин бесцветного «ползучего» инфильтрата (до 0,8 см в диаметре) отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют
2-3 Равномерный Изменения Изменения Изменения Изменения
мин серозный отек в области инъекции, гиперемия, точечные кровоизлияния отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют
4-6 На фоне легкой Гиперемия и Изменения Изменения Изменения
мин гиперемии геморрагическое пропитывание в виде прожилок звездчатого характера отек привратника на участке длиной 1-2 см, увеличивающиеся в дистальном направлении отсутствуют отсутствуют отсутствуют
10-15 Равномерный Появление Гиперемия, Изменение Изменения
мин серозный отек, формирование рыхлой гематомы ярко-красного цвета бархатистого вида размером до 2 см белесоватого оттенка на фоне увеличивающегося участка гиперемии точечные кровоизлияния брыжейки и стенки поперечноободочной кишки окраски паренхимы от ярко-красной до вишневой с переходом к темнофиолетовой отсутствуют
30-40 Прогрессивный Увеличиваю- Постепеное Прогресси- Возникновение
мин рост гематомы почти на большую часть поверхности органа, появление черного окрашивания щийся участок гиперемии размером до 2-2,5 см, приобретающий черный оттенок потемнение гиперемирован-ных участков поперечноободочной и слепой кишок рующее потемнение паренхимы печени множественных участков гиперемии, с быстрым потемнением
60-90 Темно-серое Увеличение Увеличение Отдельные Увеличение коли-
мин окрашивание органа участка гиперемии и некроза в дистальном направлении количества участков некроза участки приобретают черный цвет чества участков гиперемии с прогрессирующим потемнением
Змеиный 1-2 Формирование Изменения Изменения Изменения Изменения
яд (1 мг/кг) мин бесцветного инфильтрата размером 1-1,2 см отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют
2-3 Равномерный Изменения Изменения Изменения Изменения
мин прогрессирующий отек в этих же пределах отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют
4-6 Точечные кро- Тот же эффект, Изменения Изменения Изменения
мин воизлияния с постепенным формированием гематомы размером 1-1,2 см что для трипсина отсутствуют отсутствуют отсутствуют
10-15 Тот же эффект, Тот же эффект, Тот же эффект, Тот же эффект, Изменения
мин что для трипсина что для трипсина что для трипсина что для трипсина отсутствуют
30-40 Увеличение размера Тот же эффект, Тот же эффект, Тот же эффект, Тот же эффект,
мин гематомы до 2 см, появление черного окрашивания что для трипсина что для трипсина что для трипсина что для трипсина
60-90 Тот же эффект, Тот же эффект, Тот же эффект, Тот же эффект, Тот же эффект,
мин что для трипсина что для трипсина что для трипсина что для трипсина что для трипсина
а
Рис. Морфологические изменения поджелудочной железы крыс через 24 ч после введения трипсина и змеиного яда. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 100. а — геморрагический панкреонекроз при введении трипсина;
б — обширные очаги некроза поджелудочной железы при введении змеиного яда.
и змеиным ядом (рис. б): полнокровие, очаги кровоизлияния, отек, обширные некрозы ткани. Во внутренних органах наблюдали морфологические изменения с превалированием вну-трисосудистого стаза, тромбоза, отека ткани с дистрофическими изменениями и некрозами клеток, множественными кровоизлияниями.
В целом картины повреждения ПЖ и других висцеральных органов при действии исследованных агентов практически совпадали, поэтому понимание возможных механизмов, обеспечивающих такое сходство, представляет не только теоретический, но и практический интерес. Трипсин как сериновая протеиназа вызывает в крови каскад протеолитических реакций, приводящих к антикоагуляционным и геморрагическим эффектам. В механизмах его повреждающего действия на клетки ПЖ отмечается локальная активация зимогенных ферментов, находящихся в неактивном состоянии, таких как эластаза, химотрипсин, ФЛ [12], и далее
именно активируемые трипсином ферменты оказывают деструктивное действие на ацинар-ные клетки. Эндогенная ФЛ А2, по-видимому, является центральным ферментом в индукции некроза ацинарных клеток [13].
Среди компонентов змеиного яда (цитотоксины, ФЛ, геморрагины и др.) большое значение имеют гемостатически активные компоненты, включающие 11 видов активности [7]. В змеином яде найдено свыше 150 протеиназ, среди которых можно выделить сериновые тромбиноподобные протеиназы и металлопротеиназы, характеризующиеся антикоагуляционной и фиб-ринолитической активностью, а также способностью вызывать деструкцию сосудистого эндотелия и внеклеточного матрикса, обусловливающей геморрагический эффект [14]. Представляет интерес тот факт, что индукция острого панкреатита хорошо моделируется под действием яда скорпиона, но лишь змеиный яд вызывает геморрагический панкреонекроз, поэтому геморрагический компонент вряд ли может рассматриваться как необходимый в процессе повреждения ПЖ змеиным ядом. Вместе с тем отмечено, что геморрагический компонент сопутствует необратимому течению повреждения ПЖ. В плане формирования панкреатита важнейшей составляющей змеиного яда, по-видимому, является ФЛ А2 в комплексе с цитотоксинами [15]. Фермент повреждает клеточные мембраны, позволяет лизосомным катепсинам атаковать зимогены и активировать патогенетически важные ферменты. Также известно, что чем больше активность ФЛ в змеином яде, тем выше летальность его действия.
Таким образом, нами обнаружено сходство трипсина и змеиного яда в действии на гемо-статические свойства крови (геморрагический эффект), в характере и динамике повреждения клеток ПЖ и ряда висцеральных органов. При этом инициирующие механизмы повреждения ПЖ представляются несколько различными. В случае трипсина это, вероятно, протеолитиче-ская атака фермента на клетки ПЖ, связанная с проникновением трипсина в интерстиций и внутрь клеток с последующей активацией зимогенных проэнзимов (включая ФЛ) и индукцией каскада гидролитических реакций [1]. А для змеиного яда это также протеолитическая атака трипсиноподобными ферментами геморрагического действия и, особенно, мембрано-литическое действие ФЛ А2 и цитотоксинов с последующей активацией зимогенов [15].
Литература
1. Frossard J.L., Pastor C.M. Experimental acute pancreatitis: new insights into the pathophysiology // Front. Biosci. 2002. V.7. 275-287.
2. Hietaranta A.J., Peuravuori H.J., Nevalainen T.J. Phospholipase A2 in sodium taurocholate-induced experimental hemorrhagic pancreatitis in the rat // J. Surg. Res. 1995. V.59. № 2. 271-278.
3. Sakaguchi Y., Inaba M., Kusafuka K. et al. Establishment of animal models for three types of pancreatitis and analyses of regeneration mechanisms // Pancreas. 2006. V. 33. № 4. 371-381.
4. Odaira C., Berger Z., Iovanna J.L., Sarles H. Localized necrohemorrhagic pancreatitis in the rat after pancreatic interstitial trypsin injection. Regressive pseudochronic lesions // Digestion. 1986. V. 34. № 2. 68-77.
5. Локшина Л.А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов // Биоорг. химия. 1994. Т. 20. № 2. 134-142.
Lokshina L.A. Proteolytic enzymes in regulation of biological processes // Bioorg. khimiya. 1994. V. 20. № 2. 134-142.
6. Chan Y.C., Leung P.S. Acute pancreatitis: Animal models and recent advances in basic research // Pancreas. 2007. V. 34. № 1. 1-14.
7. Markland F.S. Snake venoms and the hemostatic system // Toxicon. 1998. V. 36. № 12. 1749-1800.
8. Marsh N.A. Snake venoms affecting the haemostatic mechanism — a consideration of their mechanisms, practical applications and biological significance // Blood
Coagul. Fibrinolysis. 1994. V. 5. № 3. 399-410.
9. Вискунов В.Г., Фещенко А.М., Проценко С.И., Бородач А.В. // Анналы хирург. гепатологии. 2007. Т. 12. № 3. 171.
Viskunov V.G., Feschenko A.M., Protsenko S.I., Borodach A.V. // Annaly khirurg. gepatologii. 2007. V. 12. № 3. 171.
10. Anai K., Sugiki M., Yoshida E., Maruyama M. Neutralization of a snake venom hemorrhagic metalloproteinase prevents coagulopathy after subcutaneous injection of Bothrops jara-raca venom in rats // Toxicon. 2002. V. 40. № 1. 63-68.
11. Yoshikawa T., Naruse S., Kitagawa M. et al. Effect of a new inhibitor of type II phos-pholipase A2 on experimental acute pancreatitis in rats // Pancreas. 1999. V. 19. № 2. 193-198.
12. Niederau C., Luthen R. Current aspects in the pathogenesis of acute pancreatitis // Schweiz. Rundsch. Med. Prax. 1997. Bd 86. № 10. Z. 385-391.
13. Mossner J., Wessig C., Ogami Y., Keim V. Role of various phospholipases A2 and in-hibitors in the pathogenesis and prevention of pancreatic acinar cell necrosis: studies with isolated rat pancreatic acini // Int. J. Pancreatol. 2000. V. 27. № 1. 29-38.
14. Matsui T., Fujimura Y., Titani K. Snake venom proteases affecting hemostasis and thrombosis // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1477. № 1 - 2. 146-156.
15. Gasanov S.E., Alsarraj M.A., Gasanov N.E., Rael E.D. Cobra venom cytotoxin free of phospholipase A2 and it’s effect on model membranes and T leukemia cells // J. Membr. Biol. 1997. V. 155. № 2. 133-142.
MODEL OF ACUTE PANCREATITIS IN RATS AFTER TREATMENT WITH TRYPSIN AND SNAKE VENOM
Vladimir Georgievich VISKUNOV1,2, Aleksander Borisovich PUPYSHEV1, Svetlana Ivanovna PROTSENKO1,
° 1 -) 'i Aleksander Petrovich NADEYEV1, Marina Aleksandrovna SINITSYNA2, Aleksander Mikhailovich FESHCHENKO3,
Zaza Yuzaevich CHUBENIDZE3
1 Novosibirsk State Medical University of Roszdrav,
52, Krasnyi prospekt, Novosibirsk, 630091
2 SI RI for regional pathology and pathomorphology of SB RAMS
2, Ac. Timakov str., Novosibirsk, 630117
3 Municipal clinical hospital
1a, A. Nevski str., Novosibirsk, 630075
Intrapancreatic injection of trypsin (50 mg/kg of body weight) or snake venom of the viper common (Vipera berus L.) (1 mg/kg) to rats caused the cognate pictures of acute hemorrhagic pancreatitis, similar dynamics of damage of other abdominal cavity organs and in both series death of 70 — 80% animal (24 h). Probably, the similarity is due to presence of hemorrhagic activity both in trypsin and snake venom, possible activation of pancreatic phospholipase A2 by exogenous trypsin, and in both cases putative membranolytic attack of acinar cells by phospholipase A2.
Key words: acute hemorrhagic pancreatitis, trypsin, snake venom, Wistar rats.
Viskunov V.G. — doctor of Medical Sciences, professor, senior researcher of laboratory of pathophysiology, general pathology and pathomorphology of SI RI for regional pathology and pathomorphology, professor of chair of hospital surgery of Novosibirsk State Medical University, e-mail: apupyshev@mail.ru Pupyshev A.B. — candidate of Biological Sciences, senior researcher, e-mail: apupyshev@mail.ru Protsenko S.I. — candidate of Medical Sciences, assistant of chair of polyclinic surgery Nadeev A.P. — doctor of Medical Sciences, professor, professor of chair of pathologic anatomy Sinitsyna M.A. — researcher of laboratory of pathophysiology, general pathology and pathomorphology Feschenko A.M. — candidate of Medical Sciences, deputy senior physician Chubenidze Z.Y. — surgeon
