CC BY
63
■ ИМИ!
Оригинальные исследования
N
Моделирование функционального остеогенеза с использованием биодеградируемого матрикса и аутогенных стромальных клеток подкожной жировой ткани
B.C. Мелихова1, И.Н. Сабурина1, АА. Орлов 2, И А. Мартиросян 2, B.C. Репин1, Н.И. Новикова 3, АН. Мурашов 3
1 НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва
2 Клиническая больница № 85, Стоматологическая клиника (Академия», Москва
3 Филиал НИИ Биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.Б. Овчинникова РАН, Пущино
Modeling of functional osteogenesis using biodegradable matrix and autogenic stromal cells of subcutaneous adipose tissue
VS. Melikhova1,I.N. Saburina1. AA. Orlov3,LA. Martirosyan 3, VS. Repin1, N.I. Novikova 3,A.N. Murashev3 11nstitute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow 3 Clinical Hospital N° 85, Dentistry Clinics Dental «Academy»
3 Institute of Bioorganic Chemistry [Branch} RAS, Moscow
Целью данного исследования являлось обоснование возможности использования тканеинженерной конструкции на основе ДЗ-фосфата кальция (ChronOs ™} и стромальных клеток подкожной жировой ткани в целях индукции de novo остеогенеза после частичной краевой резекции ветви нижней челюсти у крыс линии Sprague Dawley. Нами была разработана методика заселения данного материала клетками-предшественницами, способными не только дифференцироваться в остеогенном направлении, но и обеспечить имплантат доступом питательных веществ посредством формирования сосудов. Было показано увеличение количества сосудов в имплантате с клетками, а также ускоренное (по сравнению с контролем] формирование функциональной костной ткани.
Ключевые слова: стволовые клетки, тканевая инженерия кости.
The study was aimed to prove the possibility to use a tissue engineered construction based on p3- calcium phosphate (ChronOs ™) and stromal cells of subcutaneous adipose tissue to induce de novo osteogenesis after limited marginal resection of a mandible branch in Sprague Dawley rats. The technique of immobilization the given material with progenitor-cells capable not only to differentiate in the osteogenic way but also to provide the implant with nutrients via vessel formation was developed. The vessel number was revealed to increase within the cell-containing implant as well as accelerated formation of functioning osseous tissue as compared with the controls.
Key words: stem cells, bone tissue engineering.
Введение
Травмы, хирургические вмешательства при доброкачественных и злокачественных опухолях на нижней челюсти вынуждают клиницистов и исследователей искать новые подходы к восстановлению травмированной или утраченной костной ткани. Несмотря на то, что костная ткань обладает высокой способностью к восстановлению, в ряде случаев репаративный процесс даже при использовании различных остеопластических и ос-теоиндуктивных материалов не заканчивается восстановлением ее структуры и функции. Это часто связано с отрицательным влиянием воспаления в результате инфицирования бактериальными и вирусными возбудителями, нарушения кровоснабжения, проявления аутоиммунных реакций и иных факторов [1—3].
В ортопедической и стоматологической практике широко применяют остеопластические и остеоиндуктивные материалы различного происхождения. Значительное количество статей в ортопедических и стоматологических журналах посвящено исследованию и применению широкого спектра остеопластических материалов, различающихся по структуре и химической природе [4—6].
Одним из перспективных направлений является тканевая инженерия, чьей целью следует считать полное восстановление структуры утерянного участка кости (или
целостности кости при переломе) и возобновление функционирования костной ткани.
После проведенного анализа данных литературы и ограниченных предварительных исследований в качестве матрицы-носителя и индуктора остеогенной диффе-ренцировки нами был выбран коммерчески доступный материал СИгопОз'“. Использованная в работе матрица представляет собой пористые блоки фосфата кальция (р-Са3(Р04)2) размером от 2x3x5 мм до 6x4x8 мм. Согласно литературным данным фосфат кальция в таком виде полностью замещается собственной костью в сроки от 6 до 18 мес. после внедрения [7].
Диаметр пор в блоках составлял 100^500 мкм, а общая пористость — 70%. Система пор включает пространственно сообщающиеся макро- и микропоры, что обеспечивает возможность диффузии питательных веществ из окружающих тканей и кровотока, а также прорастание новых сосудов. Подобранный материал обладает большой площадью поверхности (за счет высокой пористости) и способен резорбироваться с участием остеокластов, таким образом постепенно подвергаясь физиологическому ремоделированию.
В соответствии с данными литературы СИголОв служит активным индуктором остеогенеза, способным мобилизовать потенциал регенерации костной ткани без
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
А
i ■ ■ тп
Оригинальные исследования
дополнительного внесения клеток. Однако быстрая диф-ференцировка и формирование костной ткани не всегда приводит к образованию функционально активного органа. Поэтому мы разработали методику заселения данного материала клетками-предшественницами, способными не только дифференцироваться в остеогенном направлении, но и обеспечить биоимплантат доступом питательных веществ посредством формирования сосудов.
При выборе клеточной популяции нас интересовала возможность не только обеспечить клеточный источник остеобластов, но также создать условия для прорастания сосудов в имплантат. В работе были использованы аутогенные клетки стромально-сосудистой фракции (ССФ) из подкожной жировой ткани. Известно, что данная гетерогенная фракция включает пул плюрипотентных клеток-предшественниц, а также клеток, способных секретиро-вать ангиогенные и антиапоптотические факторы [8, 10].
Цель исследования — гистологическое и молекулярное обоснование возможности использования тканеинженерной конструкции на основе рЗ-фосфата кальция (ChronOs'“) и стромальных клеток подкожной жировой ткани в целях de novo остеогенеза после частичной краевой резекции ветви нижней челюсти в эксперименте.
Материал и методы
Выделение и культивирование клеток
подкожной жировой ткани крыс
Для выделения клеток стромально-сосудистой фракции у животных в процессе операции получали фрагменты подкожного жира и выделяли по стандартному протоколу, в собственной модификации [8]. Полученную ткань в стерильных условиях измельчали, проводили инкубацию в растворе коллагеназы 1-го типа (0,07%) (ПанЗко, Россия) идиспазы (0,025%) (ПанЗко, Россия). Затем, в раствор с ферментами и тканью добавляли полную среду культивирования (DMEM/F12 с глутамином, 1% пенициллин-стрептомицин, 10% FCS (Fetal Clone Serum) и центрифугировали. Полученный осадок ресуспендировали в полной среде и пропускали через нейлоновый фильтр. Суспензию клеток помещали на чашки Петри (Corning, США) и культивировали в течение 10 сут. Среду меняли каждые 3 сут., рассев осуществляли на 4-е и 8-е сут. после выделения.
Для получения тканеинженерных трансплантатов использовали коммерчески доступный матрикс (ChronOs, Synthes, Швейцария) в форме блоков неправильной
формы, размером 2x3x5 мм — 6x4x8 мм. Блоки помещали по два в каждую лунку четырех-луночного стерильного планшета (Nunc, США) и насыщали клетками по 50 тыс. клеток на блок в 100 мкл среды. Планшет помещали в инкубатор на 30^40 мин. для адгезии клеток к матриксу. Через 40 мин. добавляли среду культивирования. Среду в лунках меняли два раза в нед. Культивирование на матрицах осуществляли в течение 10 сут.
В дальнейшем экспериментальным животным, находящимся под кетаминовым наркозом, рассекали кожу в области левой щеки, отсепаровывали мышцу, обнажали поверхность угла нижней челюсти (рис. 1А). Далее скальпелем проводили абразию данной поверхности вплоть до глубины 1—2 мм. В дальнейшем образец с аутогенными клетками фиксировали к костному ложу (рис. 1Б). Рану обрабатывали антибиотиком и послойно ушивали. Второй образец имплантировали под кожу в межлопаточную область (рис. 1В).
По аналогичному алгоритму поступали в случае имплантации матрицы без клеток (контроль).
Животных выводили из эксперимента через 7, 21, 40 и 120 сут. помещением в С02 камеру.
Выделение РНК
Выделение РНК проводили тризольным методом с использованием набора Trizol RNA Prep 100 (ООО «Лаборатория Изоген», Москва). Для выделения РНК использовали криоконсервированные на втором пассаже x
полняли в соответствии с протоколом, предложенном фирмой-производителем. Концентрацию РНК измеряли спектрофотометрическим методом (длина волны 260 нм) с использованием прибора Thermo Spectronic (США) и программы Genesis. Конечная концентрация полученного раствора РНК составила 1,08 мкг/мл.
Обратная транскрипция
(синтез к ДНК на выделенной РНК]
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием обратной транскриптазы RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase («Fermentas») согласно протоколу фирмы-производителя.
Покус-специфическая ПЦР
Локус-специфическую ПЦР проводили с использованием пар праймеров для остеонектина (OSN F, OSN R), остеокальцина (OSC F, OSC R) и коллагена X (COL X F, COLX R) (табл. 1).
Рис. 1. Этапы операции: А - разрез кожи в области угла нижней челюсти;
Б - имплантат с клетками фиксирован к костному ложу; В - рана в межлопаточной области
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
■ ИМИ!
Оригинальные исследования
■ТП
Таблица 1, Характеристики праймеров, использованных в работе
Праймеры Последовательность праймеров (5’-3’) Размер(N) Размер ожидаемого ПЦР продукта
OSN F CGT TGG СТТ GGA AGT ТТС ТСТ Т 22 188 пн
OSN R TAT AGG GCT ТТС AGG СТС TTG С 22
OSC F CAG ACC TAG CAG ACA CCA TGAG 22 44O пн
OSC R CGT CCA TAC TTT CGA GGC AG 2O
COL X F ACA AAG AGC GGA CAG AGA CC 2O 442 пн
COL X R AGA AGG ACG AGT GGA CAT AC 2O
Подбор условий для амплификации проводили на образцах ДНК, выделенных из клеток ССФ. ПЦР проводили на 170 нг ДНК с использованием смеси сИМТР (25 мМ каждого) и термостабильной Тац ДНК-полиме-раза (нативная, с ВБА) «РегтепЬаз» на четырехканальном ДНК-амплификаторе ТП4-ПЦР-01 -«Терцик» при температурных режимах, приведенных в табл. 2. Ло-кус-специфическую ПЦР проводили при следующих количествах реагентов: 2мМ МдС12, 1 тМ смеси сИМТР (по 0,25 мМ каждого), 1 хбуфере для Тац ДНК-поли-меразы, 0,5—1 мкМ каждого праймера (см. табл. 2). Далее амплификацию проводили на синтезированной кДНК в таких же условиях.
Таблица 2. Температурные режимы амплификации
Праймеры Кол-во праймеров Температурные режимы амплификации
OSN F 1 мШ 94°С - 3 мин.; I цикл
OSN R 1 мШ 94°С - I мин., S60С - I мин, 72°С - I мин.; 30 циклов 72°С - S мин.; I цикл
OSC F 1 мШ 94°С - 2 мин.; I цикл
OSC R 1 мШ 94°С - 30 сек., S60С - I мин, 68°С - 2 мин.; 40 циклов 68°С - 7 мин.; I цикл
COL X F O,S мШ 94°С - 3 мин.; I цикл
COL X R O,S м^ 94°С - I мин., S40С - I мин. 30 сек., 72°С - I мин. 30 сек.; 30 циклов 72°С - S мин.; I цикл
Продукты амплификации фракционировали в 1,5% агарозном геле («Sigma», США) с последующей визуализацией в проходящем ультрафиолете. В качестве маркера молекулярного веса использовали 50bp Ladder и Ladder Low range («Fermentas», США). Полученный результат анализировали при помощи трансиллюминатора Biometra ТІ5 и программы обработки изображений BioDoc Analyze.
Выделение ДНК из клеток ССФ
Клетки размораживали при 37°С, отмывали от криопротектора (ДМСО) и переносили в стерильную пробирку. Далее добавляли буфер для лизиса ядер клеток состава: 75 mM NaCI, 25 тМ EDTA, 25 тМ трис-НСІ pH 8.0. Полученную смесь перемешивали и добавляли SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) до конечной концентрации 1 %. В каждую пробирку добавляли протеиназу К («Рготеда»,
США) до конечной концентрации 100 мкг/мл и помещали пробирки в 37°С на 12 час. По истечении инкубации добавляли ацетат Na до конечной концентрации 0,2 М. Затем добавляли фенол (pH 8.0) в соотношении 1:1, перемешивали, оставляли на 5 мин. для расслоения, затем перемешивали. Полученную смесь центрифугировали 20^30 мин. при 2500 д. Отбирали водную фазу, добавляли смесь фенол:хлороформ (1:1), перемешивали в течение 15 мин., и оставляли на 5 мин. для расслоения, затем перемешивали еще раз. Центрифугировали 30 мин. при 2500 д. Осаждение ДНК проводили изопропанолом 1:1. ДНК растворяли в воде MQ. Хранили при +4°С. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрическим методом (длина волны 260 нм) с использованием прибора Thermo Spectronic (США) и программы Genesis. Конечная концентрация тотальной ДНК составила 0,07 мкг/мл.
Гистологическое исследование
После выведения животных из эксперимента, выделяли часть нижней челюсти с пластиной остеопластичес-кого материала и имплантат из межлопаточной области. Фиксировали в 10% нейтральном формалине. Далее участок костной ткани подвергали декальцинации в Три-лоне Б по общепринятой методике [9]. После этого из каждого образца вырезали фрагмент ткани с участком имплантата толщиной 5 мм, помещали его в одноразовую кассету и подвергали обработке в автомате для гистологической обработки тканей (STP 120, MICROM INTERNATIONAL GmbH, Германия). Изготавливали срезы толщиной 5 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону.
Иммуногистохимическое окрашивание
Неокрашенные парафиновые срезы депарафиниро-вали в ксилоле. После гидратации проводили отмывку в PBS и ФСБ. Затем инкубировали срезы в растворе первичных антител соответствующей концентрации при 4°С в течение 12 час. (или при 20°С в течении 2-х час.). После отмывки несвязанных антител, срезы инкубировали в растворе соответствующих вторичных антител, несущих флуоресцентную метку в разведении 1:100—1:200 в течение 60 мин. при комнатной темпе-
x
в ФСБ. Далее докрашивали ядра клеток на срезах раствором Хехста или DAPI в течение 5 мин., излишки красителя отмывали ФСБ и заключали срезы в водорастворимую среду для флуоресцентной микроскопии.
Сканирующая электронная микроскопия
Для изучения микроструктуры поверхности носителя, а также ее взаимодействия с клетками выполняли сканирующую электронную микроскопию. Для подготовки
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
МММ
препаратов к сканирующей электронной микроскопии, матрицы с клетками помещали стерильным пинцетом в чашку Петри с 1,5% глютаровым альдегидом на 20 мин. Образцы сушили методом перехода критической точки и закрепляли на предметных столиках для напыления коллоидным золотом. Подготовленные напыленные образцы помещали в сканирующий микроскоп иЕ0Ю40 и изучали при различных увеличениях.
Результаты и обсуждение
Характеристика клеток ССФ
Исследуемые культуры клеток крыс на 7—10 сут. культивирования спонтанно формировали сосудистоподобные структуры. По данным литературы, эти клетки способны секретировать ангиогенные факторы, которые в том числе могут являться и аутокринными, т. к. в данной гетерогенной фракции присутствуют эндотелиальные клетки [10]. Время удвоения количества клеток в культуре составило 48 час. Кроме того, исследуемая фракция клеток была способна формировать колонии при рассеве клеток в низкой плотности (100 кл. на 1 см3), что характеризует их как клоногенную культуру.
По морфологическим признакам в культуре можно было выделить несколько типов клеток: фибробласты, эндотелиоциты, незрелые клетки-предшественницы, гладкомышечные клетки, «перициты». Было отмечено, что при длительном культивировании морфологические характеристики и особенности роста полученных клеток не изменяются, однако сосудисто-подобные
структуры самопроизвольно элиминируются к 4-му пассажу. Основным морфологическим фенотипом в культуре являлись мелкие полигональные фиброблас-топодобные клетки с мелким ядром, которые по мере пролиферации и дифференцировки изменяли свою форму от полигональной к веретеновидной.
Характеристика тканеинженерного трансплантата
Клетки ССФ после заселения на носитель адгезиро-вались к его поверхности и были способны пролиферировать в его лунках. Кроме того, после разделения культуры клеток ССФ и матрицы носителя клетки (через 7 сут. после заселения) спонтанно формировали очаги минерализации без использования остеогенных индукторов в среде культивирования. Этот факт свидетельствует в пользу того, что матрица обладает ярко выраженными остеоиндуктивными свойствами и стимулирует клетки ССФ к дифференцировке в остеогенном направлении в двухмерном пространстве (рис. 2).
Успешное заселение, адгезия и выживание клеток на носителе подтверждено и результатами сканирующей электронной микроскопии. Так, на 5^10 сут. получены изображения распластанных клеток на всех поверхностях носителя, а также внутри лунок (рис. 3).
Следует отметить, что на основе только лишь морфологических методов исследования охарактеризовать дифференцировочные потенции клеток не представляется возможным. Следовательно, для идентификации этих свойств необходимо проведение дополнительных исследований.
Рис. 2.
Край матрицы носителя
с адгезированными на его поверхности клетками ССФ и узелки минерализации:
А - край материала-носителя с культурой клеток;
Б - культура клеток с очагами минерализации. Фазовый контраст
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
■ И I II II
■тп
Оригинальные исследования
Результаты молекулярного исследования экспрессии генов остеогенеза в клетках ССФ Через 10 сут. культивирования клеток на носителе их снимали с матрицы и исследовали экспрессию генов, влияющих на остеогенез — остеонектина, остеокальцина и коллагена X типа. Контролем служила кДНК клеток, не заселенных на матрикс.
В исследуемых клетках обнаружена экспрессия остеонектина, остеокальцина и коллагена X типа (рис. 4). Этот факт свидетельствует о том, что клетки после заселения на матрикс коммитируются в остеогенном направлении, однако в силу того, что данные гены маркируют незрелые остеогенные клетки, говорить о полной терминальной дифференцировке клеток ССФ в остеобласты на данном этапе исследований нельзя. В контрольных клетках ССФ (не заселявших матрицу) нами была обнаружена экспрессия лишь остеонектина (см. рис. 4А). Это подтверждает данные литературы, свидетельствующие о том, что фракция ССФ содержит плю-рипотентные клетки, способные дифференцироваться в остеогенном направлении. Однако этот процесс в случае клеток, находящихся в двумерном пространстве идет не до конца и контрольные клетки не экспрессируют коллаген X типа и остеокальцин, маркирующий более поздние этапы остеогенеза [11, 12].
Таким образом, можно утверждать, что клетки, помещенные на трехмерный носитель, через 10 сут. культивирования на нем становятся коммитированными в остеогенном направлении и проходят несколько стадий остеогенеза.
Репаративный остеогенез в зоне дефекта
На 7 сут. эксперимента во всех группах наблюдали активный репаративный остегенез. Различия между опытными и контрольными группами в скорости репа-ративных процессов, то есть в динамике увеличения доли костной части регенерата и уменьшения доли рыхлой волокнистой соединительной ткани на данном этапе не зафиксированы. Признаков выраженного ангиогенеза также не отмечено ни в одной группе. В опытных и контрольных группах на 7 сут. после травматического повреждения в области дефекта имеются признаки воспалительной реакции (рис. 5).
На 21 сут. эксперимента во всех группах наблюдения отмечалось значительное увеличение темпов ре-паративных процессов.
Группа с использованием матрицы (контроль 1 ]
Через 7 сут. со стороны мышечной ткани, прилегающей к фрагменту имплантированного материала, отмечен выраженный инфильтрат, представленный многочисленными многоядерными клетками, многочисленными мононуклеарами, преимущественно лимфоцитами и макрофагами, умеренным количеством фибробластов, а также регенерирующими мышечными волокнами. Также отмечен выраженный фиброз на периферии этой области.
На 21 сут. между костной поверхностью нижней челюсти и остеопластическим материалом сформировалась тонкая прослойка волокнистой соединительной ткани.
А Б В
Рис. 4. Экспрессии генов остеогенеза в клетках ССФ через 10 сут. после заселения на матрикс [1, 2) и в контроле [К): А - экспрессия коллагена X типа; Б - экспрессия остеонектина;
В - экспрессия остеокальцина
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
ш I I I I I I -ф- I ■ ■ иггп
Все ячейки остеопластического материала были заполнены в умеренном количестве мигрирующими фиброб-ластами, нитями коллагеновых волокон, в отдельных ячейках присутствуют более плотные образования из коллагена в виде коллагеновых тяжей. Во многих ячейках, в большей степени в тех, которые находятся ближе по отношению к мышечной ткани, отмечено умеренное количество многоядерных клеток. В пределах каждой ячейки эти клетки локализованы на стенках ячеек. В отдельных ячейках отмечена сформированная костная ткань (рис. 6, 7). В некоторых местах на костной поверхности нижней челюсти, не контактирующей с пластиной матрицы, отмечено формирование костных гребешков и бугорков, поверхность которых покрыта слоем клеток, имеющих сходство с активными остеобластами.
Через 40 сут. между остеопластическим материалом и костной поверхностью нижней челюсти сформировалась прослойка из волокнистой ткани, пронизанная кровеносными сосудами.
В области плотного контакта пластины с костной поверхностью нижней челюсти отмечены многочисленные среднего размера костные бугорки и гребешки, а также оссификация (кальцинирование) материала между ячейками. В единичных ячейках отмечена хорошо сформированная новообразованная костная ткань (рис. 8).
Со стороны мышечного пласта отмечен слой малодифференцированных форм клеток, прилегающий непосредственно к имплантату. В единичных ячейках, расположенных ближе к костной поверхности нижней челюсти отмечена сформированная новообразованная костная ткань, в этих же ячейках присутствует большое количество остеобластоподобных клеток.
В ячейках со стороны мышечного пласта много многоядерных клеток.
Через 120 сут. между остеопластическим материалом и костной поверхностью нижней челюсти сформировалась прослойка из волокнистой соединительной ткани, пронизанная кровеносными сосудами.
Рис. 6. Начало формирования «волн» регенерации со стороны костного дефекта, 21 -е сут., контроль 1: А - формирование мультитканевого регенерата около дефекта и участка погибшей костной ткани;
Б - начальные стадии остеогенза внутри ячейки. Окраска: по Ван-Гизону. Маркер - 100 мкм
Рис. 7. Остеогенез через 21 сут.: А - участок хондрогенеза - плацдарм развертывания энхондрального остеогенеза; Б - ретикулофиброзный костный регенерат, связанный с костной тканью челюсти. Окраска: по Ван-Гизону. Маркер - 100 мкм
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
І І І І І
■ І І І
Щ ■ - ■ ■ , '^ЩИШВйбк
ШШЩрШ
' . ■ . . ■ - -•- лГ;- „ ■- ,
Г- я
Рис. 8. Остеогенез в области дефекта челюсти через 40 сут.: автономное формирование компактной костной ткани в единичной ячейке носителя [стрелка].
Окраска: по Ван-Гизону. Маркер - 100 мкм
На отдельных участках костной поверхности нижней челюсти отмечены единичные новообразованные костные бугорки относительно большого размера. Отмечено также появление признаков компактизации кости, на некоторых срезах была выявлена зрелая компактная костная ткань (рис. 9).
В ячейках матрицы со стороны костной поверхности нижней челюсти отмечен интенсивный процесс остеогенеза. Со стороны мышечного пласта в ячейках матрицы отмечено выраженное формирование плотной волокнистой соединительной ткани. Практически все ячейки, в которых не отмечено новообразованной костной ткани, заполнены большим количеством пучков коллагеновых волокон. Во всех ячейках отмечено присутствие сосудов различного диаметра. В единичных ячейках в умеренном количестве имеется жировая ткань. Количество гигантских многоядерных клеток в ячейках незначительное. Вместе с тем, отмечается активный процесс резорбции материала-носителя.
В целом, репаративные процессы в кости на этом сроке наблюдения можно охарактеризовать как перестройку ретикулофиброзной в компактную. Скорость репаратив-ных процессов во всех группах снизилась, на первый план выступали процессы минерализации и ремоделирования костной ткани в соответствии с функциональной нагрузкой на костный орган.
Группа с использованием матрицы
с культурой клеток ССФ
Между костной поверхностью нижней челюсти и остеопластическим материалом сформировалась прослойка волокнистой соединительной ткани. В ней отмечены сосуды различного диаметра, а также умеренное количество лимфоцитов.
В ячейках остеопластического материала, прилежащего к мышечной ткани, отмечена высокая плотность заполнения коллагеновыми волокнами. В ячейках, расположенных в центральной части пластины, плотность заполнения коллагеновыми волокнами ниже. В целом, в ячейках отмечено большое количество сосудов различного диаметра, умеренное количество многоядерных клеток, умеренное количество мигрирующих фиб-робластов и мононуклеаров (рис. 10). В отдельных ячейках, расположенных в непосредственной близости по отношению к мышечной ткани, отмечено большое количество лимфоцитов.
Рис. 9. Пластинчатая костная ткань в ячейчках остеопластического материала через 120 сут. после пересадки; контрольная группа.
Окраска: по Ван-Гизону. Маркер - 100 мкм
Рис. 10. Остеогенез в области дефекта челюсти у животных экспериментальной группы, 7 сут.:
А - начало формирования костной ткани со стороны нижней челюсти; Б - общий вид биотрансплантата с формирующимися внутри лунок сосудами и костной тканью. Окраска: А - гематоксилин и эозин;
Б- по Ван-Гизону. Маркер - 100 мкм
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
■■■ ■ I I I I I I I 4- I ■ ■ тп
Признаки остеогенеза отмечены как со стороны костного ложа, так и в ячейках пересаженного материала. В обоих случаях новообразованная костная ткань находилась в окружении незрелых клеток с морфологическими признаками остеобластов, а также узких, веретенообразных клеток. В большинстве случаев отмечено формирование незрелой костной ткани, многие ячейки матрицы имеют по одному крупному или нескольким мелким сосудам.
Таким образом, можно утверждать, что на данном сроке наблюдения процесс остеогенеза находится на начальной стадии в обеих группах. Также в обеих группах можно наблюдать признаки воспаления; в группе с использованием клеток ССФ начинается постепенное формирование сосудистого русла.
Через 40 сут. между остеопластическим материалом и костной поверхностью нижней челюсти также сформировалась прослойка из волокнистой ткани, пронизанная кровеносными сосудами. В центральных ячейках матрицы отмечено большое количество кровеносных сосудов различного диаметра, а также много коллагеновых волокон, местами формирующих массивные тяжи.
В ячейках со стороны мышечной ткани также отмечено формирование плотной волокнистой соединительной ткани, большое количество незрелых клеток и клеток с морфологическими признаками остео/фибробластов.
Новообразованная костная ткань на костной поверхности нижней челюсти отмечена в нескольких участках челюсти. На границе «трансплантат-кость» зафиксирована интенсивная пролиферация остеогенных предшественников (рис. 11).
Таким образом, во всех группах экспериментов в дефектах кости образуется костный регенерат, который характеризуется различной степенью его дифференци-ровки. Процессы регенерации в костном дефекте с введением тканеинженерного трансплантата с клетками ССФ были достаточно активны и характеризовались большей степенью компактизации и созревания костной ткани, приобретшей в отдельных участках обособленное пластинчатое (модульное) строение.
Через 120 сут. от начала эксперимента отмечалось замедление репаративных процессов. Костная часть регенерата состояла из ретикулофиброзной и компактной костной ткани. Ретикулофиброзная костная ткань была образована массивными костными трабекулами с узкими щелевидными межтрабекулярными пространствами, заполненными соединительной тканью или костным мозгом (рис. 12). Стенки костных трабекул были выстланы вытянутыми клетками — неактивными остеобластами. Эти клетки скапливались вокруг кровеносных сосудов, и прилежащая к этим участкам костная ткань имела пластинчатое строение и более интенсивно окрашивалась.
Рис. 11. Остеогенез в области дефекта у животных экспериментальной шгруппы, 40 сут.:
А - ретикулофиброзная костная ткань на границе с биотрансплантатом;
Б - хондрогенез в лунке - на границе с материалом матрицы.
Окраска: А - гематоксилин и эозин;
Б - по по Ван-Гизону. Маркер - 100 мкм
Рис. 12. Фрагмент материала-носителя, заселенного клетками ССФ через 120 сут. после пересадки в дефект нижней челюсти. Ячейки заполнены пластинчатой костной тканью, резорбирующийся матрикс заселяется клетками костного мозга. Окраска: по Ван-Гизону. Маркер - 100 мкм
Между остеопластическим материалом и костной поверхностью нижней челюсти сформировалась прослойка из волокнистой соединительной ткани, пронизанная кровеносными сосудами. На серии срезов отмечены многочисленные группы ячеек материала, заполненных сформированной новообразованной костной тканью. В новообразованной костной ткани ячеек отмечен сформированный красный и желтый костный мозг. Ячейки, в которых новообразованная костная ткань отсутствует, заполнены в большом количестве мощными пучками коллагеновых волокон. Во всех ячейках представлено хорошо сформированное сосудистое русло.
Таким образом, на всех сроках исследования было отмечено формирование новообразованной костной ткани в четырех направлениях:
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
■ И I II II
■тп
Оригинальные исследования
1) со стороны периостальной поверхности поврежденной челюсти в виде костных «бугорков» и «гребешков»;
2) в ячейках матрицы, прилежащих к костной поверхности в виде формирования новообразованной кости;
3) в ячейках матрицы, прилежащих к костной поверхности по типу энхондрального остеогенеза;
4) со стороны мышечного пласта в виде формирования новообразованной костной ткани из незрелых форм клеток, мигрирующих из соседней соединительной ткани мышечного пласта.
В целом степень выраженности остеогенеза на 40 сут. была выше у тех животных, которым был имплантирован матрикс с клетками. На поздних сроках (120 сут.) в целом по степени выраженности остеогенез примерно выглядит одинаково как в группе с клетками ССФ, так и без них. Однако стоит обратить внимание на ярко выраженное проявление функциональной активности новообразованной кости в случае с использованием трансплантата с клетками ССФ в т. ч. в виде закладки костного мозга.
Результаты иммуногистохимического
окрашивания
При окрашивании срезов, полученных от животных 1 группы, на 21 сут. экспрессии остеокальцина отмечено не было. При иммунохимическом окрашивании срезов матрицы на 40 и 120 сут. после пересадки экспрессия остеокальцина была в основном обнаружена в клетках, локализованных по периферии матрицы (рис. 13), что вероятно свидетельствует о том, что это клетки реци-пиентного ложа, являющиеся в данном случае клеточным источником остеобластов.
У животных 2 группы была зафиксирована экспрессия остеокальцина на всех контрольных сроках эксперимента. В большинстве случаев, остеокальцин-позитивные клетки локализовались внутри ячеек носителя, что может свидетельствовать о том, что это дифференцированные потомки культивированных ССФ (рис. 14).
Изучение экспрессии фактора фон Виллибранда показало, что у животных экспериментальной серии дефинитивные сосуды появляются уже на сроке 21 сут. (рис. 15), причем их эндотелий характеризовался активной выработкой данного фактора, в то время как в контроле данное обстоятельство установлено не было.
Подсчет количества кровеносных сосудов в препаратах, полученных от животных, показал, что доля мелких, средних и крупных сосудов значимо выше в группе с использованием клеток ССФ (рис. 16). В имплантатах, пересаженых в межлопаточную область, не происходило формирование костной ткани, однако они также имели хорошо сформированную сосудистую сеть. Это свидетельсвует о том, что вне зависимости от локализации импланта, он не препятствует свободному нео-ангиогенезу. Кроме того, это также подтверждает необходимость контакта с нативной костной тканью для формирования костной ткани de novo.
Кроме того, обнаружено, что на поздних сроках происходит значительное уменьшение количества сосудов в обеих группах, однако в группе с клетками ССФ этот феномен менее выражен. Можно предположить, что большее количество сосудов в группе с клетками будет способствовать последующему восстановлению функций зрелой костной ткани. Именно сосуды становились центрами формирования остеонов.
Рис. 13. Экспрессия остеокальцина у животных 1 группы: А - 40 сут.; Б - 120 сут. Маркер - 600 мкм
Рис. 14. Экспрессия остеокальцина у животных 2 группы: А - 21 сут.; Б - 40 сут.; 120 сут. Маркер - ЮОмкм
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
I I I I I
■ I I I
Рис. 15. Экспрессия фактора фон Виллебрандта [А] через 21 сут.; совмещенное изображение [Б] - окраска на остеокальцин [зеленый]. Докраска ядер - Хехст. Маркер - 600 мкм
Матрица
Матрица+ССФ
23 сутки
40 сутки
120 сутки
Рис. 16. Соотношение количества кровеносных сосудов у животных 1 и 2 групп на различных сроках эксперимента в стандартной площади среза имплантата
Заключение
В ходе экспериментально-гистологической части исследования на модели костной Зй композиции после остеоабразии на нижней челюсти было изучено влияние пересаженного имплантата на регенеративный остеогистогенез. Пересаженные на носителе клетки в большей степени реализуют свои остеопрогениторные и ангиогенные свойства, что связано как с непосредственным воздействием состава и поверхности матрицы, так и с трехмерной организацией культуры, которая необходима стромальным клеткам для реализации своих остеогенных возможностей. При этом матрица выступает не только как химический индуктор и организатор трехмерного расположения клеток, но и препятствует чрезмерному распространению пересаженной культуры по внутреннему объему дефекта или раны.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Caplan A.I. Osteogenesis imperfecta, rehabilitation medicine, fundamental research and mesenchymal stem cells. Connect. Tissue Res. 1995; 31 [4]: 9-14.
2. Bostman O.M. Osteolytic changes accompanying degradation of absorbable fracture fixation implants. J. Bone Joint Surg. 1991; 73B: 679-82.
3. Caplan A.I. Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in orthopedics. Tissue Eng. 2DD5; 11C7-8): 1198—211.
4. Attawia M.A., Uhrich K.E., Botchwey E. et al. Cytotoxocity testing of polytanhydride] for orthopaedic applications. J. Biomed. Mater. Res. 1995; 29: 1233-40.
5. Behravesh E., Yasko A.W., Engel P.S. et al. Synthetic biodegradable polymers for orthopaedic applications. Clin. Orthop. 1999; 367S: 118—85.
6. Athanasiou K.A., Agrawal C.M., Barber F.A. et al. Orthopaedic applications for PLA-PGA biodegradable polymers. Arthroscopy 1998;
14t7]: 726-37.
7. Gazdag A.R., Lane J.M., Glaser D. et al. Alternatives to autogenous bone graft: efficacy and indications. J. Am. Acad. Orthop. Surg. 1995; ЗШ: 1-8.
8. Zuk P.A., Zhu М., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 2DD2; 13C12]: 4279—95.
9. Микроскопическая техника: руководство для врачей-лаборантов. Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. М.; Медицина 1996: 542.
10. Rehman J., Traktuev D., Li J. et al.Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circul. 2DD4; 109t10]: 1292-8.
11. Sage E.H. Purification of SPARC/osteonectin. Curr. Protoc. Cell Biol. 2DD3; Chapter 10:.Unit 10.11.
12. Adams S.L., Cohen A.J., Lassov6 L. Integration of signaling pathways regulating chondrocyte differentiation during endochondral bone formation. J. Cell Physiol. 2007; 213C33: 635-41.
Поступила 16.07.2008
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
