CC BY
46
модели подкожного и ОРТОТОПИЧЕСКОГО
КСЕНОГРАФТОБ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЧЕЛОВЕКА У МЫШЕЙ NUDE ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЙ, НАЦЕЛЕННЫХ НА РЕЦЕПТОР ЭПИДЕРМАЛЬНОГО
ФАКТОРА РОСТА
М.С. Воронцова1, Т.А. Кармакова1, Е.А. Плотникова1, Н.Б. Морозова1, М.А. Абакумов2, 3,
Р.И. Якубовская1, Б.Я. Алексеев1
МНИОИ им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ«НМИЦ радиологии» Минздрава России; Россия, 125284 Москва, 2-й Боткинский проезд, 3; 2ФГБОУВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России; Россия, 117997Москва, ул. Островитянова, 1; 3НИТУ«МИСиС»; Россия, 119049 Москва, Ленинский пр-т, 4
Введение. Подходы, основанные на принципах таргетной терапии, рассматриваются как перспективное направление создания новых методов лечения, способных увеличить эффективность лечения больных раком мочевого пузыря (РМП). Цель исследования — получение ортотопической модели РМП человека у мышей линии nude и обоснование ее пригодности для экспериментального изучения таргетных препаратов, нацеленных на рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР). Материалы и методы. Объектом исследования служили эктопические подкожные и ортотопические ксенографты РМП человека, полученные с использованием культивируемых клеток линий EJ и 5637. Рост ортотопических ксенографтов in vivo оценивали методом магнитно-резонансной томографии. Для исследования тканей опухолей использованы методы гистологического и иммуногистохимического анализа.
Результаты. Показано, что как эктопические, так и ортотопические ксенографты EJ и 5637характеризуются высокой воспроизводимостью модели, хорошим кровоснабжением ткани, высоким уровнем экспрессии РЭФР и отличаются локализацией рецептора в опухолевых клетках. Пролиферация клеток EJ и 5637 в слизистой оболочке мочевого пузыря мышей при их внутрипузырной имплантации преимущественно приводит к образованию мышечно-неивазивной формы опухоли. Заключение. Ксенографты EJ и 5637у иммунодефицитных мышей могут быть использованы в качестве моделей РМП человека для изучения эффективности биотерапевтических воздействий, использующих в качестве мишени РЭФР.
Ключевые слова: рак мочевого пузыря, ксенографт опухоли, мыши nude, рецептор эпидермального фактора роста
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-2-31-40
SUBCUTANEOUS AND ORTHOTOPIC XENOGRAFT MODELS OF HUMAN BLADDER CARCINOMA IN NUDE MICE FOR EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR-TARGETED TREATMENT
M.S. Vorontsova1, T.A. Karmakova1, E.A. Plotnikova1, N.B. Morozova1, M.A. Abakumov2,3, R.I. Yakubovskaya1, B.Ya. Alexeev1
'P. Hertsen Moscow Oncology Research Institute — Branch of the National Medical Research Center of Radiology, Ministry of Health of Russia; 3 2nd Botkinskiy Proezd, Moscow 125284, Russia; 2N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia; 1 Ostrovitianova st., Moscow 117997, Russia; 3 National University of Science and Technology "MISiS"; 4 Leniskiy Prospekt, Moscow 119094, Russia
Introduction. Approaches based on the principles of a targeted therapy are considered a promising strategy that is capable to improve the effectiveness of treatment for bladder cancer (BC) patients.
The purpose of the study was to establish an orthotopic xenograft model of human BC in mice and to prove its suitability for experimental examination of drugs targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR).
Materials and methods. The objects of the study were ectopic subcutaneous and orthotopic human BC xenografts established using EJ and 5637human BC cell lines. The growth of orthotopic xenografts in vivo was assessed by magnetic resonance imaging. Tumor tissues were investigated using histological and immunohistochemical techniques.
Results. It was shown that EJ and 5637xenografts exhibit a good reproducibility, a sufficient blood supply of the tumor tissues, a high level of EGFR expression, and different pattern of a subcellular receptor localization. Implantation and subsequent proliferation of human EJ or 5637cells in the murine bladder mucosa presumably results in muscle-non-invasive tumor formation. Conclusions. The EJ and 5637xenograft models can be useful for investigation of the efficacy of EGFR-targeted biotherapeutic treatments.
Key words: bladder cancer, orthotopic xenograft tumor model, nude mice, epidermal growth factor receptor
Контакты: Татьяна Анатольевна Кармакова kalmar123@yandex.ru
Введение
Рак мочевого пузыря (РМП) — одна из наиболее часто встречающихся злокачественных опухолей. РМП характеризуется высокими темпами годового прироста заболеваемости и занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической смертности в развитых странах мира, в том числе в России [1, 2]. Высокий риск рецидива опухоли после органосохраняющего лечения [3, 4], а также ограниченные возможности радикального лечения при местнораспространенных формах РМП [5—7] делают данное заболевание актуальной проблемой современной онкоурологии.
Прогресс на пути улучшения отдаленных результатов лечения больных злокачественными новообразованиями связывают с таргетными методами лечения [8]. Привлекательной мишенью для разработки различных вариантов таргетной терапии при РМП являются мембранные белки семейства рецепторов эпидермального фактора роста (РЭФР, ErbB) [9, 10]. Высокая экспрессия РЭФР (ErbBl) в клетках первичного РМП, по данным клинико-морфологиче-ских исследований, наблюдается в 74—86 % случаев, коррелирует с глубокой инвазией, низкой степенью дифференцировки и высокой пролиферативной активностью опухоли [11, 12]. Адъювантное применение при распространенных формах РМП моноклональ-ных антител к РЭФР (цетуксимаб) или ингибиторов тирозинкиназы (гефитиниб, лапатиниб) не показало ожидаемой клинической эффективности [13—15]. Это стимулирует поиск причин резистентности РМП к данным видам терапии и путей ее преодоления, поиск новых препаратов и схем комбинированного лечения, а также разработку способов направленной доставки к клеткам РМП цитостатиков, фотосенсибилизаторов, диагностических и терапевтических радионуклидов с использованием РЭФР в качестве мишени [16—20].
Экспериментальные исследования in vivo чаще всего выполняются на моделях эктопических трансплантатов РМП человека, полученных подкожной инокуляцией культивируемых опухолевых клеток или имплантацией операционного материала иммуноде-фицитным мышам [21]. С учетом механизма противоопухолевого действия релевантность модели для оценки активности ингибиторов РЭФР-ассоцииро-ванных тирозинкиназ, как правило, подтверждают определением содержания рецептора в клетках методом вестерн-блота [22, 23], для тестирования воздействий на основе антител к РЭФР — дополняют характеристику модели иммуногистохимическим исследованием внутриклеточного распределения рецептора [18, 24].
Исследования РЭФР-направленных воздействий на ортотопических моделях ксенографтов РМП человека немногочисленны, хотя известно, что такая
модель позволяет в большей степени воспроизвести особенности микроокружения опухоли, которые могут влиять как на экспрессию молекулярной мишени, так и на ответ опухоли на воздействие. Опубликованные работы c использованием такой модели либо не содержат удовлетворительной характеристики гистологических особенностей ксенографтов [17, 22], либо представленные в них данные недостаточно информативны в отношении характера экспрессии рецептора-мишени в опухолевых клетках [16, 25, 26].
Целью настоящей работы стало получение модели ортотопического ксенографта РМП человека и обоснование ее пригодности для экспериментального и доклинического изучения препаратов, нацеленных на опухолевые клетки с высокой экспрессией РЭФР.
Материалы и методы
культуры опухолевых клеток
В работе использованы клеточные линии карциномы мочевого пузыря человека EJ и 5637 (любезно предоставлены профессором А.С. Соболевым, лаборатория молекулярной генетики внутриклеточного транспорта Института биологии гена РАН, Москва). Клетки культивировали во флаконах с площадью поверхности 25 или 75 см2 (Costar, США) на среде DMEM (для культуры EJ) или RPMI-1640 (для культуры 5637) с добавлением 2 mM L-глютамина и 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. Среды и куль-туральные добавки получены от компании «ПанЭко» (Россия).
Животные
Мыши линии BALB/c nu/nu (nude), самки с массой тела 19—21 г (возраст 7—8 нед), получены из НПП «Питомник лабораторных животных» — филиала ФГБУН «Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН. Животных содержали в специализированном помещении вивария, в условиях повышенной температуры и влажности. Уход за животными, все экспериментальные процедуры и манипуляции выполнялись в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных [27].
Получение ксенографтов опухолей
Для имплантации мышам использовали клеточные линии, прошедшие от 3 до 7 пассажей культивирования. Клетки снимали с поверхности культураль-ных флаконов раствором Версена, отмывали в среде, не содержащей эмбриональную телячью сыворотку, подсчитывали количество жизнеспособных клеток в камере Горяева и на той же среде готовили клеточную суспензию для введения животным.
На этапе подбора количества вводимых клеток экспериментальные группы состояли из 4 мышей,
на этапе характеристики роста ксенографтов — из 5—8 мышей.
Для получения подкожного ксенографта суспензию опухолевых клеток в количестве 1 х 106, 3 х 106 или 5 х 106 инокулировали мышам подкожно на правый бок в объеме 0,1 мл. Объем опухоли рассчитывали по формуле
V = d х d22 х 0,52,
где d1 и d2 — 2 взаимно перпендикулярных размера опухоли.
Перед процедурой внутрипузырной инсталляции мышей анестезировали интраперитонеальным введением золазепама гидрохлорида («Золетил 100», 20 мг/кг) и ксилозина гидрохлорида («Ксилазин», 15 мг/кг) за 5 мин до начала манипуляций и фиксировали на препаровальном столике. Слизистую оболочку мочевого пузыря подвергали химическому повреждению по методике [28] путем введения через стерильный катетер, установленный в мочеиспускательный канал, 0,1 М раствора соляной кислоты с последующей его нейтрализацией 0,1 М раствора гидроксида натрия. После промывания полости мочевого пузыря стерильным физиологическим раствором в мочевой пузырь вводили 70 мкл суспензии, содержащей 1 х 106, 3 х 106 или 5 х 106 опухолевых клеток. В течение 1 ч мышей время от времени переворачивали, а при признаках выхода из наркоза — освобождали от фиксации. Осмотр, оценку общего состояния и взвешивание животных после процедуры проводили ежедневно. Снижение массы тела мышей более чем на 20 % от исходного показателя служило показанием для выведения животных из опыта. Эвтаназию животных проводили парами эфира.
магнитно-резонансная томография
Исследование проводилось на базе Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова (ЦКП «Медицинские и биотехнологические нанотехнологии»). Исследование выполнялось на магнитно-резонансном томографе ClinScan 7Т 70/30 (Bruker Biospin, Германия) с постоянным магнитным полем 7 Тл (градиентная система BGA 12S/20) при газовой анестезии животных. Обработка результатов проводилась с использованием программного обеспечения SyngoMR 15.
Подготовка материала для гистологического
и иммуногистохимического исследования
Образцы тканей, полученные при аутопсии животных, фиксировали в нейтральном забуференном 10 % формалине и после стандартной гистологической проводки заключали в парафин. Готовили серийные срезы тканей толщиной 4 мкм. Для гисто-
логического анализа срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Г&Э).
иммуногистохимическое окрашивание
Для выявления экспрессии РЭФР в опухолевых клетках использовали моноклональное кроличье антитело D38B1 (Cell Signaling Technology, СА), для выявления клеток эндотелия — моноклональное крысиное антитело к CD34 мыши (BD Pharmigen™). Срезы окрашивали с использованием общепринятой техники непрямого иммунопероксидазного анализа. Для демаскировки антигена стекла с депарафинизи-рованными срезами выдерживали в 0,1 М натрий-ци-тратном буфере (рН 6,0) при 95 °С в течение 20 мин. Система вторичных реагентов включала биотинили-рованные поликлональные антитела к иммуноглобулинам соответствующей видоспецифичности (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), конъюгат стрептавидина с пероксидазой конского хрена (Dako) и хромоген-ный субстрат Liquid DAB + Substrate Chromogen System (Dako). На контрольные срезы вместо первичных антител наносили неспецифические иммуноглобулины кролика или крысы (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). После завершения реакции клетки и срезы докрашивали гематоксилином и заключали в канадский бальзам. Микропрепараты анализировали под микроскопом Olympus BX51 (Olympus Optical Co, Япония), оснащенным системой документирования изображений.
Результаты
Подкожные ксенографты рмП человека EJ
и 5637 у мышей nude
На 1-м этапе выполнена оценка способности клеток EJ и 5637 к росту in vivo при подкожной инокуляции бестимусным мышам и исследована экспрессия РЭФР в клетках подкожных ксенографтов.
Скорость пролиферации клеток EJ, 5637 при культивировании in vitro была сходной (по результатам МТТ-теста, данные не представлены), однако при подкожной инокуляции мышам nude клетки 5637 отличались более агрессивным биологическим поведением. Так, 100 % выход опухолей, т. е. образование подкожных ксенографтов у всех мышей в экспериментальной группе, при использовании клеток линии EJ достигался при инокуляции животным опухолевого материала в количестве не менее 3 х 106 клеток, образование подкожных ксенографтов при использовании клеток линии 5637 — в количестве 1 х 106 клеток и более. Скорость увеличения объема опухоли 5637 значительно опережала скорость роста опухоли EJ. Через 21 день после инокуляции клеток EJ в количестве 3 х 106 размер подкожных образований варьировал от 100 до 250 мм3, при инокуляции того же количества клеток 5637 — от 220 до 450 мм3 (рис. 1).
а 1000 и 800-
s
S
§ 600-
X ^
с
о
4002000 О-
о
5 10 15 20 25 30 35 40
День роста опухоли
УО
О
1000 -I
800
600
400
200
10 15 20 25 30 35 40
День роста опухоли
Рис. 1. Кривые роста подкожных ксенографтов рака мочевого пузыря человека EJ (а) и 5637(б) у мышей nude в зависимости от количества инокулируемых клеток: 1 х 106 (квадратные символы), 3 х 106 (круглые символы), 5 х 106 (треугольные символы). В группах — по 5 животных; в группе мышей с привитыми клетками EJ в количестве 1 х 106 (отмечено звездочкой) выход опухолей зафиксирован у 3 из 5 животных. Размеры опухолей (объем, мм3) представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего
б
0
Рис. 2. Гистологические препараты подкожных ксенографтов рака мочевого пузыря человека EJ (а, в) и 5637(б, г) у мышей nude; 21-й день после процедуры трансплантации опухолевых клеток. Микрофотографии парафиновых срезов тканей, фиксированных формалином (увеличение х 200; отметка шкалы — 100мкм) а, в — общая морфологическая картина, Г&Э; б, г — экспрессия рецептора эпидермального фактора роста в опухолевых клетках, иммунопероксидазная реакция с антителом D38B1, докрашивание гематоксилином
По результатам гистологического исследования подкожные ксенографты опухолей EJ и 5637 имели солидное строение, морфологически соответствующее низкодифференцированному новообразованию. В ткани обеих опухолей определялось большое количество митозов. Опухоли EJ отличались плеоморф-
ными клетками, тесно расположенными в тонкой хаотичной стромальной сети (рис. 2а). Клетки опухоли 5637 были более мономорфны и образовывали разделенные прослойками соединительной ткани островки, которые особенно четко прослеживались по периферии роста опухолей (рис. 26). На 21-й день
35
to
IT ~ W
рис. 3. МРТ-изображения нижней части тела мышей nude с ортотопическим ксенографтом рака мочевого пузыря человека EJ (а) и 5637(б) на 20-й день после процедуры трансплантации опухолевых клеток, фронтальная проекция. На врезках — увеличенное изображение мочевого пузыря; расположение опухолей указано стрелками
роста в ткани опухоли 5637 обнаружены только минимальные фокусы дегенерации, в ткани опухоли EJ признаков некроза при гистологическом исследовании в этот срок не наблюдалось.
По результатам оценки интенсивности иммуно-гистохимической реакции с анти-РЭФР антителом клетки ксенографтов EJ и 5637 слабо различались по общему уровню экспрессии РЭФР. При этом в клетках опухоли EJ наряду с окрашиванием цитоплазмы наблюдалось преимущественное окрашивание поверхностной мембраны (рис. 2в), а в различных участках ткани опухолевого образования картина имму-ногистохимического окрашивания в целом была сходной. В клетках опухоли 5637 преобладала цито-плазматическая локализация РЭФР (рис. 2г), мембранное окрашивание можно было наблюдать в клетках некоторых структур, располагающихся по периферии опухолевого узла.
ортотопические ксенографты рака мочевого
пузыря человека EJ и 5637 у мышей nude
Отработку условий ортотопической трансплантации клеток РМП человека выполняли, варьируя количество клеток, вводимых в мочевой пузырь мышей.
Введение 1 х 106 клеток EJ или 5637 удовлетворительно переносилось животными. Однако на 20-е сутки после процедуры инстилляции признаки опухолевого роста в стенке мочевого пузыря были обнаружены только у 2 из 4 мышей в каждой группе и только по результатам гистологического исследования.
При введении мышам 5 х 106 клеток EJ или 5637 в течение 14 сут после воздействия наблюдалась гибель животных. При вскрытии павших мышей установлено, что причиной гибели в обеих группах стало нарушение функции почек, которое развивалось как следствие перекрытия мочеточников опухолью, прорастающей стенку органа или заполняющей полость мочевого пузыря.
Оптимальным признано внутрипузырное введение клеток EJ или 5637 в количестве 3 х 106 на мышь. По совокупным результатам независимо проведенных экспериментов выживаемость мышей, которым прививали клетки EJ, на 24-е сутки после воздействия составила 92 % (11 из 12 животных), выживаемость мышей, которым прививали клетки 5637 — 83 % (10 из 12 животных). На данный срок при вскрытии мышей в мочевом пузыре обнаруживали утолщение складок, экзофитные выросты различного числа и размера либо полное заполнение опухолью полости органа.
Анализ результатов исследования методом магнитно-резонансной томографии,, полученных у мышей на 20-й день после инсталляции опухолевых клеток, показал возможность прижизненного мониторинга роста ксенографтов. МРТ-изображения, представленные на рис. 3, демонстрируют пристеночные образования, выступающие в полость мочевого пузыря мышей, соответствующие растущей опухоли. Отмечено, что ксенографты, как правило, локализовались в области верхушки мочевого пузыря,
Рис. 4. Гистологические препараты мочевого пузыря мышей nude с ортотопическим ксенографтом рака мочевого пузыря человека EJ (а—в) и 5637(г—е); 24-й день после процедуры трансплантации опухолевых клеток. Микрофотографии парафиновых срезов тканей, фиксированных формалином: а, г — общий вид опухолевых образований, растущих в слизистой оболочке мочевого пузыря (указаны стрелками), Г&Э (увеличение х 50; отметка шкалы — 500 мкм); б, д — морфологическая картина роста солидного ксенографта под слоем уротелия, Г&Э (увеличение х 200); в, е — серийные срезы тех же участков ткани, окрашенных иммунопероксидазной реакцией с анти-РЭФР антителом D38B1, докрашивание гематоксилином (увеличение х 200; отметка шкалы — 200мкм)
что обусловлено положением тела наркотизированного животного во время процедуры.
Гистологическое исследование подтвердило наличие опухолевого роста в мочевом пузыре у всех выживших животных. Репрезентативные микрофотографии парафиновых срезов мочевого пузыря живот-ных-опухоленосителей представлены на рис. 4а, г.
У большинства животных рост опухолей EJ и 5637, независимо от их размера, был ограничен слизистой оболочкой, т. е. уровень поражения стенки мочевого пузыря опухолью соответствовал стадии Т1. Однако у 3 из 12 мышей с ксенографтами EJ на поздний срок наблюдения выявлены признаки начала инвазии опухоли в мышечный слой стенки мочевого пузыря.
По результатам иммуногистохимического окрашивания тканей характер экспрессии РЭФР в клетках ортотопических ксенографтов EJ и 5637 в целом был сходен с тем, что наблюдалось при исследовании подкожных опухолевых образований (рис. 4в, е). При этом отмечено, что в клетках ортотопического ксено-графта EJ выраженность цитоплазматического компонента окрашивания была существенно выше, чем в клетках подкожно растущих опухолей. Как следствие этого, общая интенсивность окрашивания ортотопических ксенографтов EJ во всех исследованных случаях была существенно выше, чем интенсивность окрашивания ортотопических ксенографтов 5637.
Для того чтобы проследить динамику формирования и роста имплантированных опухолевых клеток в стенке мочевого пузыря и оценить оптимальное время начала потенциального лечения, на модели ксенографта EJ проведено гистологическое исследование мочевого пузыря на различные сроки после процедуры внутрипузырной инстилляции клеток (4, 7, 10 и 14-е сутки). Метод иммуногистохимического
окрашивания использован для оценки характера экспрессии РЭФР и распределения сосудов в образцах удаленных тканей.
Было установлено, что регенерация уротелия у мышей nude после его химического повреждения происходит сравнительно быстро. На фоне полной реэпителизации покрова мочевого пузыря на 4-7-й день после внутрипузырного введения клеток EJ РЭФР-положительные (РЭФР+) клетки, как правило, располагались под уротелием (рис. 5а). Возможно, что выживанию опухолевых клеток, проникших под базальную мембрану, способствует хорошо развитая сеть CD34+ кровеносных капилляров, которая в стенке интактного мочевого пузыря пролегает непосредственно под базальной мембраной (рис. 6а).
В дальнейшем, до 14-го дня наблюдения, в стенке мочевого пузыря можно было проследить распространение опухолевых клеток под слоем эпителия в собственной пластинке слизистой оболочки (рис. 5б). Увеличение количества пролиферирующих клеток приводило к утолщению складок слизистой оболочки,
ч. f
-> №
i" -ч S
■+-,
t. s® M ** *
пэ sV: -iif -
» t V f i i * ;
1 *J ' »"T
'As*
Рис. 5. Гистологические препараты мочевого пузыря мышей nude с ортотопическим ксенографтом рака мочевого пузыря человека EJ, демонстрирующие различные этапы формирования опухоли. Микрофотографии парафиновых срезов тканей, фиксированных формалином и окрашенных иммунопероксидазной реакцией с анти-РЭФР антителом D38B1 (докрашивание гематоксилином): а — РЭФР+ депозиты опухолевых клеток в подэпителиальном слое собственной пластинки слизистой оболочки мочевого пузыря (7-й день после имплантации опухолевых клеток; увеличение х 400, отметка шкалы — 50 мкм); б, в — пролиферация опухолевых клеток в толще подслизистого слоя (10-й день; увеличение х 200 и х 100 соответственно; отметка шкалы — 100 и 200 мкм соответственно); г — полость мочевого пузыря заполнена опухолью (24-й день; увеличение х 100, отметка шкалы — 200мкм)
формированию экзофитных выростов (рис. 5в), которые со временем сливались в единый массив, заполняющий полость органа (рис. 5г).
Оптимальным сроком начала терапевтического воздействия у животных-опухоленосителей с ксено-графтами EJ или 5637, с учетом динамики роста опухолевых образований, может считаться интервал до 7 дней после процедуры инстилляции опухолевых клеток.
Количество и линейная протяженность депозитов опухолевых клеток варьировали у индивидуальных животных. При множественных фокусах имплантации рост опухолевых зачатков в разных участках слизистой оболочки мочевого пузыря был неодинаковым. Можно предположить, что вариативность числа опухолевых зачатков и скорость роста ксенографтов у животных-опухоленосителей определяются количеством опухолевых клеток, успешно осуществивших имплантацию в данном участке поврежденной слизистой оболочки.
Исследование распределения микрососудов в опухолевой ткани показало, что в ткани ксенограф-та клетки эндотелия мыши образуют насыщенную капиллярную сеть, которая пронизывает всю толщу опухоли (рис. 6б). Таким образом, ортотопическая модель опухоли EJ наглядно демонстрирует способность ксеногенных клеток привлекать ресурсы организма-хозяина для формирования адекватного кровоснабжения растущей опухолевой массы.
На протяжении всего времени роста, до поздних его этапов, когда опухоли достигали значительных размеров, опухолевые клетки ксенографтов EJ и 5637, в отличие от естественно образующихся опухолей мочевого пузыря, не контактировали непосредственно с содержимым мочевого пузыря мышей и были отделены от полости органа слоем регенерировавшего уротелия. Необходимо отметить, что при внутри-пузырном введении противоопухолевых лекарственных средств это обстоятельство может существенно ограничивать доступ активного компонента лекарства к опухолевым клеткам, особенно при воздействии на ранние сроки после инокуляции опухоли.
Особого внимания заслуживают различия внутриклеточной локализации РЭФР в клетках опухолей EJ и 5637, выявленные при иммуногистохимическом окрашивании тканей ксенографтов. По данным кли-нико-морфологических исследований, при некоторых злокачественных новообразованиях — раке поджелудочной железы, раке почки, немелкоклеточном раке легкого — тип субклеточного распределения РЭФР в опухоли может служить независимым фактором клинического прогноза [29—32]. По существующим представлениям преимущественная внутриклеточная локализация РЭФР может определяться активностью процессов интернализации рецептора,
Рис. 6. Расположение кровеносных микрососудов в стенке мочевого пузыря интактного животного (а) и в ткани ортотопического ксенографта рака мочевого пузыря человека EJ (б) у мышей nude. Микрофотографии парафиновых срезов тканей, окрашенных имму-нопероксидазнойреакцией с антителом к CD34 (докрашивание гематоксилином; увеличение х 200; отметка шкалы — 100мкм): а — в нормальном мочевом пузыре CD34+ клетки эндотелия располагаются в подэпителиальном слое; б — в ткани ксенографта клетки эндотелия мыши образуют разветвленную сосудистую сеть
которая инициируется взаимодействием с лиганда-ми, может зависеть от организации внутриклеточного транспорта комплекса рецептор — лиганд, а также от специфики взаимодействия внутриклеточных сигнальных путей [33]. Совокупность этих процессов не только способна определять биологические особенности роста опухоли, но и может влиять на реализацию механизмов лечебного воздействия. Так, например, ожидаемыми являются результаты клинического исследования, показавшего, что у больных с распространенным немелкоклеточным раком легкого лечебный эффект химиотерапии в сочетании с цетуксимабом более выражен в случаях с высоким уровнем экспрессии РЭФР на поверхности опухолевых клеток [34].
Заключение
С использованием клеточных линий EJ и 5637 нами получены ксенографты РМП человека у мышей nude, которые характеризуются хорошей воспроизводимостью роста и высоким уровнем экспрессии РЭФР. Хорошее кровоснабжение ткани подкожных и ортотопических ксенографтов РМП указывает на
потенциально высокую доступность опухолевых клеток для системно вводимых лекарственных средств. Рост ортотопических вариантов ксенографтов в под-слизистом слое мочевого пузыря накладывает определенные ограничения на их релевантность как моделей для изучения цитотоксических лекарственных средств, для которых предполагается внутрипузыр-ный путь введения. Особенности локализации РЭФР в клетках ксенографтов EJ и 5637, выявленные в дан-
ной работе, могут служить критерием при выборе экспериментальной модели, а также дополнительным фактором анализа при интерпретации результатов экспериментального воздействия. Ксенографты EJ и 5637 могут быть полезны для разработки новых способов эффективного лечения РМП человека, в том числе, при экспериментальном изучении биотерапевтических воздействий, использующих РЭФР в качестве мишени.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Злокачественные новообразования в России в 2015 г. (заболеваемость
и смертность). Под ред. А.Д. Капри-на, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена -филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2017. 250 с. [Malignant tumors in Russia in 2015 (morbidity and mortality). Ed. A.D. Kaprin, V.V. Starinskiy, G.V. Petrova. Moscow: Hertsen MORI, branch of NMRRC MH RF. 2017. 250 p. (In Russ.)].
2. Torre L.A., Siegel R.L., Ward E.M., Jemal A. Global cancer incidence and mortality rates and trends -
an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2016;25:16-27. DOI: 10.1158/1055-9965.EPI-15-0578. PMID: 26667886.
3. Алексеев Б.Я., Андреева Ю.Ю., Новикова И.В. Факторы прогноза выживаемости у больных немышеч-но-инвазивным раком мочевого пузыря. Онкоурология 2013;9(1):34-42. DOI: http://dx.doi.org/10.17650/1726-9 776-2013-9-1-34-42. [Alekseev B.Ya., Andreeva Yu.Yu., Novikova I.V. Factors predicting survival in patients with non-muscle invasive bladder cancer. Onkourologiya = Oncourology 2013;9(1):34-42 (In Russ.)].
4. Chou R., Selph S., Buckley D.I. et al. Intravesical therapy for the treatment of nonmuscle invasive bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. J Urol 2017;197(5):1189-99.
DOI: 10.1016/j.juro.2016.12.090. PMID: 28027868.
5. Комяков Б.К., Гулиев Б.Г., Сергеев А.В. и др. Выживаемость больных раком мочевого пузыря после радикальной цистэктомии. Онкоурология 2016;12(1):29-35. DOI: http://dx.doi.org/10.17650/1726 -9776-2016-12-1-29-35. [Komyakov B.K., Guliev B.G., Sergeev A.V. Survival of patients
with bladder cancer after radical cystectomy. Onkourologiya =
Oncourology 2016;12(1):29-35 (In Russ.)].
6. Lobo N., Mount C., Omar K. et al. Landmarks in the treatment of muscle-invasive bladder cancer. Nat Rev Urol 2017;14(9):565-74. DOI: 10.1038/ nrurol. 2017.82. PMID: 28675174.
7. Sanli O., Dobruch J., Knowles M.A. et al. Bladder cancer. Nat Rev Dis Primers 2017;3:17022.
DOI: 10.1038/nrdp.2017.22. PMID: 28406148.
8. Ghosh M., Brancato S.J., Agarwal P.K., Apolo A.B. Targeted therapies
in urothelial carcinoma. Curr Opin Oncol 2014;26(3):305-20. DOI: 10.1097/CCO.0000000000000064. PMID: 24685646.
9. Weintraub M.D., Vourganti S., Li Q. et al. Targeting the epidermal growth factor receptor in bladder cancer.
J Carcinogene Mutagene 2013;4:143. DOI: 10.4172/2157-2518.1000143.
10. Mooso B.A., Vinall R.L., Mudryj M.
et al. The role of EGFR family inhibitors in muscle invasive bladder cancer: a review of clinical data and molecular evidence. J Urol 2015;193(1):19-29. DOI: 10.1016/j.juro.2014.07.121. PMID: 25158272.
11. Chaux A., Cohen J.S., Schultz L. et al. High epidermal growth factor receptor immunohistochemical expression
in urothelial carcinoma of the bladder is not associated with EGFR mutations in exons 19 and 21: a study using formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues. Hum. Pathol 2012;43(10):1590-5. DOI: 10.1016/j.humpath.2011.11.016. PMID: 22406363.
12. Carlsson J., Wester K., De La Torre M. et al. EGFR-expression in primary urinary bladder cancer and corresponding metastases and
the relation to HER2-expression. On the possibility to target these receptors with radionuclides. Radiol Oncol 2015;49(1):50-8.
DOI: 0.2478/raon-2014-0015. PMID: 25810701.
13. Hussain M., Daignault S., Agarwal N. et al. A randomized phase 2 trial
of gemcitabine/cisplatin with or without cetuximab in patients with advanced urothelial carcinoma. Cancer 2014;120(17):2684-93. DOI: 10.1002/cncr.28767. PMID: 24802654.
14. Miller K., Morant R., Stenzl A. et al.
A phase II study of the Central European Society of Anticancer-Drug Research (CESAR) Group: Results of an open-label study of gemcitabine plus cisplatin with or without concomitant or sequential gefitinib in patients with advanced or metastatic transitional cell carcinoma of the urothelium. Urol Int 2016;96(1):5-13. DOI: 10.1159/000381589. PMID: 26068576.
15. Powles T., Huddart R.A., Elliott T. et al. Phase III, double-blind, randomized trial that compared maintenance lapatinib versus placebo after first-line chemotherapy in patients with human epidermal growth factor receptor 1/2-positive metastatic bladder cancer. J Clin Oncol 2017;35(1):48-55.
DOI: 10.1200/Jœ.2015.66.3468. PMID: 28034079.
16. Pfost B., Seidl C., Autenrieth M. et al. Intravesical alpha-radioimmunotherapy with 213Bi-anti-EGFR-mAb defeats human bladder carcinoma in xenografted nude mice. J Nucl Med 2009;50(10): 1700-8. DOI: 10.2967/jnumed.109.065961. PMID: 19793735.
17. Yang X., Kessler E., Su L.J. et al. Diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein DAB389EGF
for the treatment of bladder cancer. Clin Cancer Res 2013;19(1):148-57. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-1258. PMID: 23172881.
18. Grivas P.D., Day K.C., Karatsinides A. et al. Evaluation of the antitumor activity of dacomitinib in models of human
bladder cancer. Mol Med 2013;19:367-76. DOI: 10.2119/molmed.2013.00108. PMID: 24166682.
19. Tsai Y.C., Ho P.Y., Tzen K.Y. et al. Synergistic blockade of EGFR and HER2 by new-generation EGFR tyrosine kinase inhibitor enhances radiation effect in bladder cancer cells. Mol Cancer Ther 2015;14(3):810-20. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-13-0951. PMID: 25589492.
20. Railkar R., Krane L.S., Li Q.Q. et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) targeted photoimmunotherapy (PIT) for the treatment of EGFR expressing bladder cancer. Mol Cancer Ther 2017;16(10):2201-14.
DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-16-0924. PMID: 28619755.
21. Arantes-Rodrigues R., Colaço A., Pinto-Leite R. et al. In vitro and in vivo experimental models as tools
to investigate the efficacy of anti-neoplastic drugs on urinary bladder cancer. Anticancer Res 2013;33(4):1273-96. PMID: 23564765.
22. Dominguez-Escrig J.L., Kelly J.D., Neal D.E. et al. Evaluation of the therapeutic potential of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor gefitinib in preclinical models
of bladder cancer. Clin Cancer Res 2004;10(14):4874-84. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-04-0034. PMID: 15269164.
23. Mansure J.J., Nassim R., Chevalier S. et al. A novel mechanism of PPAR gamma induction via EGFR signalling constitutes rational for combination therapy in bladder cancer.
PLoS One 2013;8(2):e55997.
DOI: 10.1371/joumal.pone.0055997. PMID: 23409107.
24. Bhuvaneswari R., Gan Y.Y., Soo K.C., Olivo M. Targeting EGFR with photodynamic therapy in combination with Erbitux enhances in vivo bladder tumor response. Mol Cancer 2009;8:94. DOI: 10.1186/1476-4598-8-94. PMID: 19878607.
25. Wu M.L., Li H., Yu L.J. et al. Short-term resveratrol exposure causes in vitro and in vivo growth inhibition and apoptosis of bladder cancer cells. PLoS One 2014;9(2):e89806. DOI: 10.1371/ journal.pone.0089806. PMID: 24587049.
26. Fazel J., Rotzer S., Seidl C. et al. Fractionated intravesical radio-immunotherapy with (213) Bi-anti-EGFR-MAb is effective without toxic side-effects in a nude mouse model
of advanced human bladder carcinoma. Cancer Biol Ther 2015;16(10):1526-34. DOI: 10.1080/15384047.2015.1071735. PMID: 26177233.
27. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям
в биомедицинских исследованиях. Под ред. Н.Н. Каркищенко, С.В. Грачева. М.: Профиль-2С, 2010. 358 с. [Guidelines for laboratory animals and alternative models in biomedical research. Ed. N.N. Karkishchenko, S.V. Grachev. Moscow: Profil-2S Ltd, 2010. 358 p. (In Russ.)].
28. Chan E., Patel A., Heston W., Larchian W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research.
BJU Int 2009;104(9):1286-91. DOI: 10.1111/j.1464-410X.2009.08577.x. PMID: 19388981.
29. Einama T., Ueda S., Tsuda H. et al. Membranous and cytoplasmic expression
of epidermal growth factor receptor in metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma. Exp Ther Med 2012;3:931-36. DOI: 10.3892/ etm.2012.518. PMID: 22969995.
30. Ueda S., Ogata S., Tsuda H. et al. The correlation between cytoplasmic overexpression of epidermal growth factor receptor and tumor aggressiveness: poor prognosis in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas 2004;29:e1-8.
PMID: 15211117.
31. Kankaya D., Kiremitci S., Tulunay O., Baltaci S. Prognostic impact
of epidermal growth factor receptor on clear cell renal cell carcinoma: Does it change with different expression patterns? Indian Journal of Pathology and Microbiology 2016;59:35-40. DOI: 10.4103/0377-4929.178219. PMID: 26960632.
32. Kallio J.P., Hirvikoski P., Helin H. et al. Membranous location of EGFR immunostaining is associated with good prognosis in renal cell carcinoma. Br J Cancer 2003;89:1266-9. DOI: 10.1038/ sj.bjc.6601241. PMID: 14520458.
33. Tomas A., Futter C.E., Eden E.R. EGF receptor trafficking: consequences for signaling and cancer. Trends Cell Biol 2014;24(1):26-34. DOI: 10.1016/j.tcb. 2013.11.002. PMID: 24295852.
34. Pirker R., Pereira J.R., von Pawel J. et al. EGFR expression as a predictor
of survival for first-line chemotherapy plus cetuximab in patients with advanced non-small-cell lung cancer: analysis of data from the phase 3 FLEX study. The Lancet Oncology. 2012;13:33-42. DOI: 10.1016/S1470-2045(11)70318-7. PMID: 22056021
