CC BY
22doi: 10.17116/terarkh201587634-39
© Коллектив авторов, 2015
Мочевые биомаркеры повреждения подоцитов: значение для оценки течения и прогноза хронического гломерулонефрита
H.В. ЧЕБОТАРЕВА, И.Н. БОБКОВА, Н.В. НЕПРИНЦЕВА, Л.В. КОЗЛОВСКАЯ, З.Т. МАЛКАНДУЕВА
ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия
Urinary biomarkers for podocyte injury: Significance for evaluating the course and prognosis of chronic glomerulonephritis
N.V. CHEBOTAREVA, I.N. BOBKOVA, N.V. NEPRINTSEVA, L.V. KOZLOVSKAYA, Z.T. MALKANDUEVA
I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia
Резюме
Цель исследования. У больных с различными вариантами хронического гломерулонефрита (ХГН) оценить выраженность повреждения подоцитов по уровню подоцитарных маркеров в моче и определить значение этих показателей как критериев активности и прогноза заболевания.
Материалы и методы. Обследовали 73 больных ХГН: 20 с неактивным течением нефрита (1-я группа), 23 с выраженным мочевым синдромом (2-я группа), 30 с нефротическим синдромом — НС (3-я группа), среди них 7 больных с тяжелым НС, у 7 НС сочетался с остронефритическим синдромом. Контрольную группу составили 8 здоровых лиц. В обследованных группах уровень подоцитурии (ПЦУ) изучен методом цитофлоуметрии с помощью антител, меченных подокаликсином, уровни нефринурии (НУ), белка теплового шока-27 (БТШ-27) в моче и интерлейкина-6 (ИЛ-6), каспазы-9, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) оценены методом ELISA.
Результаты. У пациентов с активным ХГН выявляется высокий уровень маркеров повреждения подоцитов: ПЦУ и НУ, коррелирующие с уровнем протеинурии, тяжестью НС и выраженностью подоцитопении. У пациентов с наиболее тяжелым течением нефрита с НС, особенно в сочетании с нарушенной функцией почек, выявлен нарастающий дисбаланс факторов воспаления (ИЛ-6), апоптоза (каспаза-9) и защиты (БТШ-27, VEGF), что отражает несостоятельность механизмов самозащиты подоцитов и способствует торпидному течению ХГН. Интенсивная ПЦУ и НУ является прогностически неблагоприятным признаком, указывающим на риск развития гломерулосклероза.
Заключение. Рассмотренные показатели являются универсальными для всех больных ХГН, протекающим с протеинурией, и могут применяться для мониторирования течения заболевания, причем факторы повреждения должны рассматриваться в совокупности с факторами защиты.
Ключевые слова: хронический гломерулонефрит, протеинурия, повреждение подоцитов, подоцитурия, интерлейкин- 6, белок теплового шока 27, каспаза-9, VEGF.
Aim. To estimate the degree of podocyte injury in patients with different types of chronic glomerulonephritis (CGN) from the urinary level of podocyte markers and to determine the significance of these indicators as criteria for disease activity and prognosis. Subjects and methods. Seventy-three patients with CGN, including 20 with inactive nephritis (Group 1), 23 with obvious urologi-cal syndrome (Group 2), 30 with nephrotic syndrome (NS) (Group 3), among them there were 7 patients with severe NS and 7 with NS concurrent with acute nephritic syndrome, were examined. A control group consisted of 8 healthy individuals. In the examined groups, the degree of podocyturia (PCU) was investigated by flow cytometry using podocalyxin-labeled antibodies and the levels of nephrinuria (NU), heat shock protein 27 (HSP27) in urine, interleukin 6 (IL-6), caspase 9, and vascular endothelial growth factor (VEGF) were estimated by ELISA.
Results. The patients with active CGN were found to have a high level of markers for podocyte injury: PCU and NU, which correlate with the magnitude of proteinuria, severity of NS, and degree of podocytopenia. Those with the severest NS, that concurrent with renal dysfunction in particular, were observed to have a progressive imbalance of inflammatory (IL-6), apoptotic (caspase-9), and defensive (HSP27 and VEGF) factors, which displays the incompetence of self-defense mechanisms in podocytes and contributes to the torpid course of CGN. Progressive PCU and NU are a poor prognostic sign indicating the risk of glomerulonephritis. Conclusion. The indicators considered are universal for all patients with CGN running with proteinuria and may be used to monitor the course of the disease; moreover, the damaging factors should be considered in conjunction with the defensive factors.
Key words: chronic glomerulonephritis, proteinuria, podocyte injury, podocyturia, interleukin 6, heat shock protein 27, caspase-9, vascular endothelial growth factor.
АГ — артериальная гипертония
АД — артериальное давление
БМИ — болезнь минимальных изменений
БМК — базальная мембрана клубочков
БТШ-27 — 27-й белок теплового шока
ГН — гломерулонефрит
ГС — гломерулосклероз
ДП — дисфункция подоцитов
МН — мембранозная нефропатия
МС — мочевой синдром НС — нефротический синдром НУ — нефринурия
ОНС — остронефритический синдром ПД — подоциты ПУ — протеинурия ПЦУ — подоцитурия
СКФ — скорость клубочковой фильтрации
ФСГС — фокальный сегментарный гломерулосклероз
ХГН — хронический гломерулонефрит VEGF — фактор роста эндотелия сосудов
WT-1 — антиген опухоли Вильмса а-ФНО — а-фактор некроза опухоли
В последние годы в экспериментальных моделях хронического гломерулонефрита (ХГН), а также в клинических исследованиях показано, что повреждение подоцита (ПД) — ключевого компонента клубочкового фильтрационного барьера — является универсальным механизмом развития протеинурии (ПУ) и формирования гломеруло-склероза (ГС) независимо от морфологического варианта нефрита [1]. ПД формируют щелевидную мембрану, участвуют в регуляции внутриклубочкового гидростатического давления, поддерживают структуру и функцию соседних клеток и базальной мембраны клубочков (БМК). Типичными изменениями ПД а при повреждении являются сглаживание его ножек с распластыванием цитоплазмы вдоль БМК, отщепление отдельных структурных белков [2]. При более длительном воздействии на ПД повреждающих факторов активируются механизмы апопто-за, наблюдается отслоение подоцитов от БМК с их экскрецией в мочевое пространство (подоцитурия — ПЦУ), образуются дефекты фильтрационного барьера, что лежит в основе развития ПУ и нефротического синдрома (НС) [3]. В связи с ограниченной способностью ПД к пролиферации их потеря более 20% (подоцитопения) способствует формированию синехий между капиллярными петлями и капсулой клубочка и в конечном счете ведет к развитию ГС и ухудшению функции почек [4].
В свете общепринятой концепции повреждения ПД как детерминанты развития ПУ и прогрессирующего повреждения клубочков особое значение приобретают методы неинвазивной оценки дисфункции ПД с использованием мочевых тестов.
Цель исследования: у больных с различными вариантами ХГН оценить выраженность повреждения ПД по уровню подоцитарных маркеров в моче и определить значение этих показателей как критериев активности и прогноза заболевания.
Материалы и методы
Обследовали 75 больных с различными формами ХГН: 37 (49%) женщин и 38 (51%) мужчин в возрасте от 18 до 74 лет, средний возраст 41,6 (27; 55) года. Контрольную группу составили 10 здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными пациентами. Морфологически диагноз подтвержден у 48 больных: у 14 выявлен мезангиопролиферативный ГН, у 5 — ме-зангиокапиллярный ГН, у 10 — мембранозная нефропатия (МН), у 5 — болезнь минимальных изменений (БМИ), у 5 — фокальный сегментарный ГС (ФСГС), у 9 — нефросклероз.
Сведения об авторах:
Чеботарева Наталья Викторовна — к.м.н., в.н.с. отд. нефрологии НИЦ
Непринцева Наталья Викторовна — аспирант каф. нефрологии и гемодиализа
Козловская Лидия Владимировна — д.м.н., проф. каф. внутренних, профессиональных заболеваний и пульмонологии медико-профилактического факультета
Малкандуева З.Т. — студентка 5-го курса, центр инновационных образовательных программ «Медицина будущего»
Результаты исследования молекулярных медиаторов сравнивали в 3 группах больных, различающихся по степени активности ХГН и выраженности нарушений функции почек.
В 1-ю группу вошли 20 пациентов с неактивным течением заболевания: 15 с латентным ХГН, 5 с полной ремиссией ХГН после успешной иммуносупрессивной терапии. У больных этой группы выявлялась ПУ около 1 (0,76 (0,27; 1,1)) г/сут, у 10 из них изолированная, а у остальных — в сочетании с умеренной эри-троцитурией. Функция почек у 13 больных оставалась сохранной, у 7 отмечалось стойкое снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) до 62 (55; 71) мл/мин и повышение концентрации креатинина в сыворотке крови до 1,4 (1,3; 1,89) мг/дл. Артериальная гипертония (АГ) при артериальном давлении (АД) от 150/100 до 220/120 мм рт.ст. наблюдалась у 6 пациентов.
Во 2-ю группу включены 23 пациента с выраженным мочевым синдромом (МС): 18 больных, у которых ХГН изначально протекал с МС и персистировал в течение 2 (1; 7) мес, а также 5 больных, у которых МС был результатом неполной ремиссии НС. Клинически 2-я группа больных ХГН характеризовалась ПУ 1—3 (2,0 (1,74; 3,0) г/сут; у 11 больных выявлялась изолированная ПУ субнефротического уровня, у 12 — ПУ сочеталась с умеренной эритроцитурией. Функция почек у 13 больных была в пределах нормы, у 10 отмечалось стойкое нарушение функции почек — СКФ 44,5 (36; 76) мл/мин, креатинин 1,72 (1,34; 2,13) мг/дл. АГ при АД от 150/90 до 180/100 мм рт.ст. выявлялась у 10 больных.
В 3-ю группу вошли 30 больных с НС, включая 16 с умеренным НС (ПУ 7,51 (4,8; 9,16) г/сут) и 7 с тяжелым НС: анасарка, гипоальбуминемия менее 20 г/л, ПУ 11,6 (8,35; 18,6) г/сут; у 7 пациентов НС сочетался с остронефритическим синдромом (ОНС): АГ, эритроцитурия, преходящее нарушение функции почек — креатинин от 1,27 до 3,22 (1,71 (1,35; 1,99)) мг/дл. У 8 больных 3-й группы наряду с сохраняющейся активностью ХГН — ПУ 7,52 (4; 12,0) г/сут — отмечалась стойкая дисфункция почек — СКФ 43 (35; 67) мл/мин, креатинин 1,8 (1,41; 2,44) мг/дл, а также высокая АГ (АД максимально до 220/100 мм рт.ст.).
Наряду с общеклиническим обследованием методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA) проведена оценка уровней в моче следующих показателей: нефрина (основного структурно-функционального белка подоцитов), интерлейки -на-6 (ИЛ-6; ведущего провоспалительного цитокина), белка теплового шока-27 (БТШ-27; защитного белка-шаперона клеточного происхождения), каспазы-9 (маркера апоптоза), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), регулирующего проницаемость клубочкового фильтра, а также выживаемость ПД.
Помимо того, исследована ПЦУ методом цитофлоуметрии осадка мочи с подсчетом количества ПД (целых клеток и их фрагментов), меченных антителами к подокаликсину (Pdx).
Исследуемые показатели экскреции стандартизованы по концентрации креатинина в утренней порции мочи.
В ткани почки с использованием иммуногистохимического метода оценили выраженность подоцитопении, проведя подсчет ПД, меченных антителами к их ядерному маркеру — антигену опухоли Вильмса (WT-1). В качестве контроля использованы образцы ткани почек, удаленных в связи с урологическими причинами, при исследовании которых не выявлено патологии клубочков.
Статистический анализ данных проводили с применением стандартных методик с помощью программы Statistica 6,0. Для сравнения 2 групп использовали непараметрический критерий
Контактная информация:
Бобкова Ирина Николаевна — д.м.н., зав. отд. нефрологии НИЦ, проф. каф. нефрологии; e-mail: <irbo.mma@mail.ru>
Манна—Уитни. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена.
Результаты
Мы изучили экскрецию с мочой основных маркеров ДП, в частности структурно-функционального белка нефрит. Уровень нефринурии (НУ) в группах больных с активными протеинурическими формами ХГН (2-я и 3-я группы) оказался выше, чем у больных с неактивным течением заболевания и у здоровых лиц, — 14,2 (9,45;22,5), 7,9 (1,7; 9,5) и 7,25 (5,4; 9,8) нг/мл соответственно (р<0,05). У больных с НС (3-я группа) НУ была значительно выше, чем у пациентов с субнефротической ПУ (2-я группа) (табл. 1). Установлена достоверная прямая корреляция (Иб=0,27; р<0,05) между НУ и суточной ПУ у больных ХГН 2-й и 3-й групп. По нашим данным, у больных с активным течением ХГН при наличии АГ величина НУ достоверно выше, чем у пациентов с нормальным АД, — 16,1 (12,5; 27,8) и 10 (8,4; 14,6) нг/мл соответственно (р<0,01). Выявлена прямая корреляция между НУ и средним АД (2-я и 3-я группы ^=0,3; р=0,032).
Наряду с уровнем в моче нефрина — специфического для ПД белка мы изучили экскрецию с мочой самих ПД. Подобно НУ у больных с ХГН и НС (3-я группа) этот показатель достоверно превышал таковой у пациентов с суб-нефротической ПУ (2-я группа) (см. табл. 1). Наиболее высокие уровни ПУ отмечены у больных с тяжелым НС — 16 (3,2; 38,3) кл/мкл против 6,8 (1,5; 14,5) кл/мкл у пациентов с умеренным НС (р<0,05).
Помимо общепринятых маркеров повреждения ПД мы изучили экскрецию с мочой БТШ-27 — одного из основных внутриклеточных защитных белков. Его синтез индуцируется в клетках, в том числе в ПД, в ответ на повреждение, отражая степень клеточного «стресса». Уровень БТШ-27 в моче больных ХГН увеличивался от 1-й к 3-й группе (см. табл. 1). У больных с тяжелым НС уровень мочевой экскреции БТШ-27 достоверно выше, чем у пациентов с умеренным НС, — 1,35 (0,93; 4,02) и 0,84 (0,71; 1,81) нг/мл соответственно (р<0,05). Установлена достоверная прямая корреляция между уровнем БТШ-27 в моче больных с НС и суточной ПУ (^=0,40; р<0,05) и обратная — между уровнем в моче БТШ-27 и альбумином в сыворотке крови (Иб=—0,36; р<0,05).
Различия между морфологическими формами ХГН по НУ и ПЦУ, а также экскреции БТШ-27 с мочой недостоверны, решающую роль играла выраженность НС.
Между изученными нами показателями (ПЦУ, НУ, уровень в моче БТШ-27) выявлены достоверные корреляции, наиболее сильные у больных с НС, что свидетель-
ствует в пользу их значения как патогенетически связанных маркеров ДП (табл. 2).
Помимо маркеров повреждения ПД мы оценили экскрецию с мочой одного из основных провоспалительных цитокинов — ИЛ-6. У пациентов с НС (3-я группа) уровень экскреции ИЛ-6 с мочой оказался достоверно выше, чем у пациентов 2-й группы без НС, — 9,97 (1,95; 25,6) и 5,44 (1,3; 12,8) нг/мл соответственно (р<0,05). При этом нами установлены достоверные прямые корреляции между величиной ПЦУ, мочевыми показателями БТШ-27 и ИЛ-6 (К5=0,39; р<0,05 и К5=0,2; р<0,05 соответственно). Наиболее сильные связи между этими маркерами отмечены в группе больных ХГН с НС (К5=0,61; р<0,01 и К^=0,44; р<0,05 соответственно), что указывает на сопряженное развитие ДП и иммунного воспаления в клубочках почек и подчеркивает роль этих процессов в формировании НС у больных ХГН.
В эксперименте на различных моделях протеинуриче-ских нефропатий подтверждено большое значение апоп-тоза в механизмах потери ПД в клубочках почек и в развитии подоцитопении. Мы изучили экскрецию с мочой маркера апоптоза каспазы-9. У больных ХГН с НС экскреция каспазы-9 с мочой достоверно выше, чем у пациентов без НС, и именно в группе с НС выявлялись самые высокие уровни НУ и ПЦУ (см. табл. 1).
В сопоставлении с НУ мы изучили уровень экскреции с мочой ангиогенного фактора УБОР, оказывающего ан-тиапоптотическое действие в эндотелиальных клетках и ПД. В нашем исследовании по мере нарастания НУ у больных с НС отмечалось повышение экскреции с мочой УБОР, в то время как у больных с прогрессирующим течением заболевания, характеризующимся высокой ПУ и нарушением функции почек, уровень УБОБ в моче резко снижался (рис. 1).
При иммуногистохимическом исследовании биопта-тов ткани почек больных ХГН мы выявили уменьшение количества меченных ПД в клубочке у больных ХГН 2-й и 3-й групп, особенно выраженное (>50% от нормы) у пациентов с торпидным течением НС. Это отражает наиболее значительную потерю ПД в клубочках почек у больных данной категории. Выявлена достоверная обратная корреляция между числом меченных ПД в клубочке и выраженностью ПЦУ (К^=-0,39; р<0,01) (рис. 2).
Таблица 2. Взаимосвязь показателей повреждения подо-цитов у больных ХГН с НС
Показатель БТШ-27 в моче НУ
ПЦУ =0,42; р<0,01 Я§=0,9; р<0,05
НУ =0,42; р<0,01 —
Таблица 1. Уровень подоцитарных маркеров в моче у больных ХГН
Группа НУ, нг/мл ПЦУ, клеток/мкл БТШ-27, нг/мл Каспаза-9, нг/мл УБОБ, пг/мл
Здоровые («=10) 7,9 (1,7; 9,5) 0 (0; 6) 0,73 (0,66; 0,96) 31,0 (31,2; 31,6) 62,2 (54,8; 73,5)
1-я: ХГН неактивный («=20) 7,25 (5,4; 9,8) 5,4 (1,0; 9,43) 0,72 (0,65; 0,98) 31,5 (31,4; 32,0) 70,25 (50,0; 75,5)
2-я: ХГН с МС (п=23) 9,7 (7,6;12,9)* 5,38 (1,63; 18) 0,76 (0,68; 1,14) 31,4 (31,3; 32,35) 71,2 (55,8; 88,2)
3-я: ХГН с НС («=30) Р1—2 14,4 (10; 24,1)** 7 (2,09; 20,6)* 1,1(0,73; 1,83)* 33,0 (32,0; 34,1)* 125,2 (95,6; 179,7)**
Р1—3' Р2—3 Р1—3' Р2—3 Л—Г Р2—3 P1—3, Р2—3 P1—3, Р2—3
Примечание. * — р<0,05; ** — р<0,01.
1ну, нг/мл ЩуЕСГ, пг/мл
25 т 140
120
100 80
10 + 60 40
20
к
и
■
щ
Здоровые ХГН без НС ХГН с НС ХГН с НС
и ПН
Рис. 1. Соотношение экскреции с мочой VEGF и нефрина у больных ХГН.
ПН — почечная недостаточность.
Рис. 2. Оценка выраженности подоцитопении по экспрессии WT-1 в ткани почки у 48 больных ХГН.
Для оценки прогностического значения изученных биомаркеров повреждения ПД мы проанализировали ответ на иммуносупрессивную терапию у 55 больных с ХГН и НС в зависимости от исходного уровня НУ и ПЦУ. По нашим данным, купирование НС и достижение ремиссии нефрита в течение ближайших 6 мес наблюдались у больных с меньшими показателями ПЦУ (<20 клеток/мкл) и НУ (<17 нг/мл). В то же время у 70% больных с высокими исходными уровнями ПЦУ (>20 клеток/мкл) и НУ (>17 нг/мл) НС характеризовался торпидным течением, несмотря на применение рекомендованных схем иммуносу-прессивной терапии в течение длительного срока (от 9 мес до 3 лет) (рис. 3).
Обсуждение
Установлено, что изменение структуры и функции ПД (подоцитопатия), ранее считавшееся специфическим
признаком болезни БМИ, встречается при различных формах гломерулонефрита (ГН) и других нефропатиях [5]. Выполняя важную роль в поддержании структуры и функции почечного клубочка в норме, ПД имеют первостепенное значение при повреждении клубочка и прогрессиро-вании заболевания почек. В эксперименте показано, что появление и нарастание в моче маркеров повреждения ПД служит более чувствительным, чем ПУ, показателем активности болезни [6].
Своеобразной «платформой» передачи сигналов, необходимых для поддержания функций ПД (правильной организации цитоскелета, поляризации, эндоцитоза, дифференцировки, ограничения пролиферации и жизнеспособности клетки в целом), служит межподоцитарная щелевая диафрагма [7]. Стереотипной реакцией ПД на разнообразные повреждающие факторы (иммунные, ге-модинамические, метаболические) является снижение экспрессии структурных белков щелевой диафрагмы и интегринов, что приводит к изменениям цитоскелета, формы ножек ПД, нарушению адгезии к БМК со слущи-ванием ПД в мочевое пространство, в результате чего нарушается барьерная функция ПД, развивается ПУ [8]. В моче пациентов с различными формами ГН обнаруживаются специфические для ПД белки, а также сами ПД. Часть ПД, выявляемых в моче, еще сохраняют жизнеспособность, что подтверждено возможностью их выращивания при помещении в культуральную среду, а часть ПД, экскретируемых с мочой, находятся в состоянии апоптоза
[9].
В проведенном нами исследовании показатели НУ и ПЦУ изменялись однонаправлено и были достоверно выше у больных с активным течением ГН, коррелируя с выраженностью ПУ. Наиболее высокие уровни маркеров ДП мы выявили у больных с прогрессирующим течением нефрита — сочетанием НС и ОНС, быстропрогрессирующей почечной недостаточностью, т.е. яркими клиническими проявлениями активного иммунного воспаления, приводящего к распространенному повреждению ПД.
Мы показали, что уровни ПЦУ и НУ сопоставимы при различных морфологических формах нефрита, и это позволяет рассматривать изученные показатели как универсальные маркеры повреждения ПД. Выявленные нами закономерности изменения НУ согласуются с данными литературы об уменьшении экспрессии нефрина в ткани почки при активных нефропатиях независимо от их морфологической формы (болезнь БМИ, ФСГС, МН, мезан-гиальные формы ГН, волчаночный нефрит, диабетическая нефропатия) [8].
В настоящее время среди маркеров повреждения богатых актином клеток, в том числе ПД, рассматривают БТШ-27 [1]. В физиологических условиях этот белок, располагаясь внутриклеточно, не связан с волокнами актина. Под влиянием повреждающих факторов олигомеры БТШ-27 объединяются в ПД с актиновыми микрофила-ментами и способствуют их стабилизации, чтобы противостоять стрессовому изменению клеточного цитосклета
[10]. Показано, что наибольшей защитной активностью обладают нефосфорилированные олигомеры БТШ-27. Фосфорилирование БТШ-27 с помощью р38-МАР-киназы влечет потерю связи с актиновыми микрофила-ментами, ремоделирование актиновой сети, агрегацию и перераспределение микроволокон в клетке и распласты-
1,0
0,8
С,
Н
с х 0,6
н
ц о 0,4
ю
о
сл и 0,2
J
0,0
-0,2
• Купирование НС о Персистирование НС п--'-^
-,—,—,—,—,—г-
t
1
..........
> 20 PDX/мкл
< 20 PDX/мкл
10 15 20 25 30 35 40 45 50 Время ответа, мес
55
1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
Достигнута ремиссия НС (полная и неполная) Сохраняется НС
"I
1 ...
НУ >17 нг/мл
^ 1-—-!—&
НУ <17 нг/мл
6 12 18 24 30
Длительность иммуносупрессивной терапии, мес
36
Различия между группами статистически достоверны, p<0,01 (p<0,001)
Рис. 3. Ответ на иммуносупрессивную терапию у 55 больных ХГН с НС в зависимости от исходного уровня подоци-тарных биомаркеров.
РБХ/мкл — количество окрашенных подокаликсином частиц в микролитре осадка мочи. р<0,001 — для различий между группами. а — ПУ; б — НУ.
б
а
ванию ножек ПД, что рассматривают как патофизиологическую основу нарушения проницаемости клубочков [11].
В нашем исследовании уровень защитного БТШ-27 в моче был выше у пациентов с НС, особенно при тяжелом его течении, и прямо коррелировал с выраженностью ПУ, что находит объяснение в свете современных представлений об участии этого белка в регулировании формы ножек ПД — одного из ключевых звеньев развития нефротиче-ской ПУ. Об этом свидетельствует и выявленная нами прямая корреляция мочевого уровня БТШ-27 с выраженностью повреждения ПД, в частности с ПЦУ.
Поскольку БТШ-27 является внутриклеточным про-тективным фактором, его выход из клеток и высокая экскреция с мочой у больных с тяжелым течением ХГН могут рассматриваться как свидетельство напряженности и несостоятельности внутриклеточной самозащиты на территории ПД. Это также подтверждает выявленное нами у больных активным ХГН (особенно с НС) повышение уровней в моче провоспалительного ИЛ-6 и защитного БТШ-27, коррелирующие с выраженностью ПЦУ.
Наши данные согласуются с результатами проведенных ранее экспериментальных работ, продемонстрировавших роль провоспалительных медиаторов, продуцируемых клетками клубочка, в том числе ИЛ-6 и а-фактора некроза опухоли (а-ФНО), в развитии повреждения ПД при протеинурических формах ХГН [12].
Основной источник ИЛ-6 в моче больных ХГН в настоящее время остается предметом изучения. Клетки ме-зангия, а также макрофаги, лимфоциты и эндотелиальные клетки могут секретировать ИЛ-6 в ответ на воздействие факторов воспаления [13]. Однако в биоптатах почек пациентов со значительной мочевой экскрецией ИЛ-6 не находят мононуклеарных и лимфоцитарных инфильтратов, что предполагает наличие и другого источника этого
фактора [14]. Полагают, что таким источником ИЛ-6 могут быть ПД. Так, в работе К. Lai и соавт. [15] на культуре клеток показано, что ПД имеют рецепторы к основным провоспалительным цитокинам и при активации сами могут продуцировать ИЛ-6 и а-ФНО, являясь не только объектом повреждения, но и активным участником воспаления в клубочках почек.
У обследованных пациентов мы оценили уровень в моче каспазы-9 — маркера, отражающего интенсивность процесса апоптоза клеток почки, и сопоставили его с показателем повреждения ПД — НУ. Отмечено одновременное увеличение экскреции с мочой этих биомаркеров по мере нарастания активности нефрита, что указывает на сопряженность процессов апоптоза и повреждения ПД, участвующих в развитии ПУ.
Мы также сопоставили уровень НУ и экскреции с мочой VEGF, оказывающего антиапоптотическое действие. По данным эксперимента, он продуцируется ПД, поддерживает структуру и функцию эндотелиального монослоя и самих ПД, способствуя, таким образом, сохранению целостности фильтрационного барьера [16]. У больных с прогрессирующим течением нефрита с нарушением функции почек мы отметили резкое снижение экскреции с мочой VEGF при неуклонно нарастающей НУ. В экспериментальных работах показано, что нарушение фосфо-рилирования нефрина в условиях дефицита VEGF ослабляет связывание нефрина с ПД, в результате чего внеклеточная часть молекулы нефрина отщепляется от мембраны ПД и экскретируется с мочой [16]. Так, A. Hara и соавт. [17] продемонстрировали, что дефицит VEGF у здоровых крыс приводит к развитию артериальной гипертонии и умеренной ПУ, а при анти-БМК-нефрите — к более тяжелому его течению с массивной ПУ вследствие повреждения ПД. Усиление процессов повреждения ПД и истоще-
ние продукции УБОБ у больных с прогрессирующими формами ХГН в нашем исследовании можно рассматривать как отражение дисбаланса механизмов апоптоза и выживаемости ПД с последующей прогрессирующей их потерей и развитием подоцитопении.
По данным многочисленных экспериментальных и клинических исследований, число ПД в клубочках служит основной детерминантой развития ГС [4, 18]. Так как ПД являются высокодифференцированными клетками с ограниченным пролиферативным потенциалом, уменьшение их числа приводит к необратимому дефекту клубочкового фильтра, способствует формированию синехий между капиллярными петлями и капсулой клубочка почки и является пусковым механизмом для начала склерозирования клубочков. В нашем исследовании с помощью иммуногистохимического метода мы подтвердили прогрессирующую потерю ПД (по степени экспрессии '^Г-1) в клубочках почек у пациентов с НС, особенно при тор-пидном его течении. Эти изменения сопровождались высокой экскрецией с мочой маркеров повреждения ПД (НУ, ПЦУ, БТШ-27). Это обосновывает возможность применения подоцитарных маркеров для мониторирова-
ния течения активных протеинурических форм ХГН, оценки риска прогрессирования, прогнозирования ответа на лечение. Так, мы установили, что у большинства больных с высоким уровнем маркеров повреждения ПД (ПЦУ и НУ) в течение ближайших 6 мес не удавалось купировать НС и достичь ремиссии нефрита, несмотря на проведение рекомендованной для этих видов нефрита имму-носупрессивной терапии.
Заключение
Таким образом, процессы повреждения и самозащиты, обусловленные общностью клеточно-молекулярных взаимодействий, протекают одновременно на территории структурно-функциональной единицы клубочка — ПД. Повреждение ПД вследствие дисбаланса этих противодействующих систем является универсальным механизмом развития протеинурии и формирования ГС независимо от формы ГН. Повышение маркеров ДП наряду со снижением показателей самозащиты ПД отражают риск дальнейшего прогрессирования заболевания и являются факторами неблагоприятного прогноза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Smoyer W, Mundel P. Regulation of podocyte structur during the development of nephritic syndrome. J Mol Med. 1998;76:172-183.
2. Huh W, Kim DJ, Kim M-K, Kim YG, Oh HY, Ruotsalainen V, Tryggvason K. Expression of nephrin in acquired human glomerular disease. Nephrol Dial Transplant. 2002;17:478-484.
3. Kanwar YS, Rosenzweig LJ. Altered glomerular permeability as a result of focal detachment of the visceral epithelium. Kidney Int. 1982;21:565-574.
4. Kriz W, Greitz N, Lemley KV. Progression of glomerular diseases: is the podocyte the culprit? Kidney Int. 1998;54:687-697.
5. Camici M. Urinary detection of podocyte injury. Biomed Pharma-cother. 2007;61:245-249.
6. Yu D, Peterman U, Kunter S, Et Rong S, Shankland SJ, Floege J. Urinary podocyte loss is a more specific marker of ongoing glomerular damage than proteinuria. J Am Soc Nephrol. 2005;16(6):1733-1741.
7. Huber TB, Bensing T. The slit diaphragm: a signaling platform to regulate podocyte function. Curr Opin Nephrol Hypertension. 2005;14(3):211-216.
8. Koop K, Eikmans M, Baelde HJ, Kawachi H, de Heer E, Paul LC, Bruijn JA. Expression of podocyte-associated molecules in acquired human kidney diseases. J Am Soc Nephrol. 2003;14:2063-2071.
9. Vogelmann SU, Nelson WJ, Myers BD, Lemley KV. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 2003;285:40-48.
10. Mehlen P, Hickey E, Weber LA. Large unphosphorylated aggregates as the active form of hsp27 which controls intracellular reactive oxygen species and glutathione levels and generated a protection against TNFa in NIH-3T3-ras cells. Biochem Biophys Res Commun. 1997;241:187-192.
11. Preville X, Schultz H, Knauf U, Gaestel M, Arrigo AP. Analysis of the role of Hsp25 phosphorylation reveals the importance of the
oligomerization state of this small heat shock protein in its protective function against TNF-a and hydrogen peroxide-induced cell death. J Cell Biochem. 1998;69:436-452.
12. Lai KN, Leung JC, Chan LY, Saleem MA, Mathieson PW, Lai FM, Tang SC. Activation of podocytes by mesangial-derived TNF-a: glomerulo-podocytic communication in IgA nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2008;294:945-955.
13. Gordon C, Richards N, Howie AJ, Richardson K, Michael J, Adu D, Emery P. Urinary IL-6: a marker for mesangial proliferative glomerulonephritis? Clin Exp Immunol. 1991;8:145-149.
14. Lee SJ, Borsting E, Decleves AE, Singh P, Cunard R. Podocytes express IL-6 and Lipocalin2/Neutrophil gelatinase-associated lipocalin in lipopolysaccharide-induced acute glomerular injury. Nephon Exp Nephrol. 2012;121:86-96.
15. Lai KN, Leung JC, Chan LY, Saleem MA, Mathieson PW, Lai FM, Tang SC. Activation of podocytes by mesangial-derived TNF-a: glomerulo-podocytic communication in IgA nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2008;294:945-955.
16. Garovic VD, Wagner SJ, Petrovic LM, Gray CE, Hall P, Sugi-moto H, Kalluri R, Grande JP. Glomerular expression of nephrin and synaptopodin but not podocin is decreased in kidney sections from women with preeclampsia. Nephrol Dial Transplant. 2007;22:1136-1143.
17. Hara A, Wada T, Furuchi K, Sakai N, Kawachi H, Shimizu F, Shibuya M, Matsushima K, Yokoyama H, Egashira K, Kaneko S. Blokade of VEGF accelerates proteinuria via decrease in nephrin expression in rat crescentic glomerulonephritis. Kidney Int. 2006;69(11):1986-1995.
18. Lemley KV, Lafayette A, Safai G, Derby G, Blouch K, Squarer A, Myers BD. Podocytopenia and disease severity in IgA nephropathy. Kidney Int. 2002;61:1475-1485.
Поступила 09.02.2015
