CC BY
60
ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИОННЫХ РАБОТ
УДК 616.366-003.7
А.А. САГДАТОВА1, Р.Х. ЗУЛКАРНЕЕВ1, Э.К. ХУСНУТДИНОВА23, А.Х. НУРГАЛИЕВА3, Ш.З. ЗАГИДУЛЛИН1
1Башкирский государственный медицинский университет, 450000, г. Уфа, ул. Ленина, д. 3 2Уфимский научный центр РАН, Институт биохимии и генетики, 450054, г. Уфа, Проспект Октября, д. 71 3Башкирский государственный университет, 450076, г. Уфа, ул. З. Валиди, д. 32
Многофакторная клинико-генетическая модель развития желчнокаменной болезни
Сагдатова Алия Альфридовна — аспирант кафедры пропедевтики внутренних болезней, тел. +7-917-77-259-60, e-mail: aliyasg@rambler.ru Зулкарнеев Рустем Халитович — доктор медицинских наук, профессор кафедры пропедевтики внутренних болезней, тел. (347)246-53-97, e-mail: zrustem@ufanet.ru
Хуснутдинова Эльза Камилевна — доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой генетики и фундаментальной медицины, зав. отделом геномики и лабораторией молекулярной генетики человека, тел. (347) 2-299-671, e-mail: biodekanat@yandex.ru Нургалиева Альфия Хаматьяновна — кандидат биологических наук, доцент кафедры генетики и фундаментальной медицины, тел. (347) 2-299-671, e-mail: Alfiyakh83@gmail.com
Загидуллин Шамиль Зарифович — доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней, тел. (347)246-53-97, е-mail: zshamil@inbox.ru
В статье представлены результаты обследования 195 пациентов с диагнозом «желчнокаменная болезнь». Проведен анализ взаимосвязи между клинико-лабораторными факторами, липидным спектром сыворотки крови и полиморфными локусами rs693 (7673С>Т)гена APOB-100 и^4131229 (¡7892 Т>С)гена ABCG5 с использованием ROC-анализа и бинарной логистической регрессии. В качестве независимых факторов развития заболевания были определены: наличие генотипа Х+Х- гена АРОВ-100 (rs693) и фенотипические признаки: масса тела более 56 кг, лейкоцитоз >6*109/л, липидные нарушения (ЛПВП<1,26 ммоль/л, ЛПНП>1,68 ммоль/л), связанный билирубин > 2,9 мкмоль/л. Построена математическая модель вероятности развития желчнокаменной болезни, на основе которой создана диагностическая шкала признаков развития ЖКБ.
Ключевые слова: желчнокаменная болезнь, полиморфизм генов аполипопротеина В-100, ABCG5, липопротеины.
A.A. SAGDATOVA1, R.Kh. ZULKARNEEV1, E.K. KHUSNUTDINOVA23, A.KH. NURGALIEVA3, Sh.Z. ZAGIDULLIN1
1 Bashkir State Medical University, 3 Lenin Str., Ufa, Russian Federation, 450000
2Ufa Scientific Center of the Russian Academy of Sciences, Institute of Biochemistry and Genetics,
71 Prospekt Oktyabrya, Ufa, Russian Federation, 450054
3Bashkir State University, 32 Validi Str., Ufa, Russian Federation, 450076
Multiple-factor clinical-genetic model of the cholelithiasis development
Sagdatova AA — post-graduate student of the Department of Internal Diseases Propaedeutics, tel. +7-917-77-259-60, e-mail: aliyasg@rambler.ru Zulkarneev R.Kh. — D. Med. Sc., Professor of the Department of Internal Diseases Propaedeutics, tel. (347) 246-53-97, e-mail: zrustem@ufanet.ru Khusnutdinova E.K. — D. Biol. Sc., Professor, Head of the Department of Genetics and Fundamental Medicine, Head of the Department of Genomics, Head of the Laboratory of Human Molecular Genetics, tel. (347) 2-299-671, e-mail: biodekanat@yandex.ru Nurgalieva A.Kh. — Cand. Biol. Sc., Associate Professor of the Department of Genetics and Fundamental Medicine, tel. (347) 2-299-671, e-mail: Alfiyakh83@gmail.com
Zagidullin Sh.Z. — D. Med. Sc., Professor, Head of the Department of Internal Diseases Propaedeutics, tel. (347) 246-53-97, e-mail: zshamil@inbox.ru
'6 (107) сентябрь 2017 г.
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ^ 109
The article presents the results of a study of 195 patients with a diagnosis of cholelithiasis. The relationship was analyzed between clinical laboratory factors, serum lipid spectrum and polymorphic loci rs693 gene APOB-100 and rs4131229 gene ABCG5 using ROC analysis and binary logistic regression. The independent disease development factors were genotype X+X-gene apoB-100 and the following phenotypic characteristics: the body weight over 56kg, leukocytosis > 6*109/L, lipid disorders (HDL<1,26 mmol/L, LDL> 1.68 mmol/l), conjugated bilirubin> 2,9 mmol/l). The mathematical model of the probability of gallstone disease was built. The diagnostic scale of GD development features was made on the basis of the model.
Key words: cholelithiasis, gene polymorphism of the apolipoprotein B-100, ABCG5, lipoproteins.
Заболевания желчного пузыря встречаются у 10-40 % в популяции в зависимости от таких факторов, как возраст, пол, численность населения, ожирение и сахарный диабет 2-го типа, и являются серьезным экономическим бременем [1]. Относительная частота патологии вне зависимости от возраста выше в женской популяции 17%), чем в мужской (~ 8%) [2].
Известно, что причинами образования камней в желчном пузыре являются ускоренная кристаллизация холестерина (ХС) в перенасыщенной холестерином желчи, накопление ХС в стенке или полости желчного пузыря, нарушения в обмене апобелка, ответственного за транспорт ХС в клетку, функциональное нарушение моторики желчного пузыря (гипофункция) с длительным застоем желчи, гиперсекреция слизи на фоне воспаления в стенках желчевыводящих путей, дислипидемия, генетическая предрасположенность [3].
С конца 1980-х гг. проводились исследования для выявления ассоциации генов-кандидатов с желчнокаменной болезнью (ЖКБ). Был выявлен ряд генов, участвующих в гомеостазе холестерина — основного компонента конкрементов (аполипопротеина Е (АроЕ) и B (АроВ), белка транспортера холесте-рин-эстеразы (СЕТР), холестерол-7а-гидроксилазы, рецептора А холецистокинина (CCKAR), ЛПНП рецептора (LDLR), АТФ-связанного кассетного (АВС) трансмембранного белка — транспортера холестерина ABCG5 и G8 и др.) [4]. Однако мало изучена взаимосвязь полиморфных вариантов генов АроВ-100 и ABCG5 с фенотипическими признаками заболевания.
Цель исследования — построение модели развития желчнокаменной болезни на основе анализа взаимосвязи наиболее значимых клинических признаков, а также полиморфных вариантов генов аполипопротеина В-100 APOB-100(rs693), АТФ-связанного кассетного (АВС) трансмембранного белка — транспортера холестерина ABCG5 (rs4131229), контролирующих липидный обмен и
их фенотипической реализации у больных с ЖКБ и практически здоровых лиц.
Материал и методы. Группу больных составили 195 взрослых индивидов в возрасте от 21 до 87 лет (средний возраст 56,1 ± 0,9 года) с установленным диагнозом «желчнокаменная болезнь» (К. 80) в стадии обострения, госпитализированных в гастроэнтерологическое и хирургическое отделения ГКБ № 21 г. Уфа. Распределение по половому признаку среди пациентов было следующим: мужчин — 47 (24 %), женщин — 148 (76 %). Критериями исключения были злокачественные опухоли, тяжелые сопутствующие заболевания, туберкулез, психические заболевания. В качестве контроля исследована группа практически здоровых лиц, состоящая из 172 человек в возрасте 67,2 ± 0,88 лет, из них мужчин — 51 (30 %), женщин — 121 (70 %). Диагностику ЖКБ проводили на основании жалоб, анамнеза, объективного осмотра, общеклинического обследования (общий анализ крови, ультразвуковое исследование желчного пузыря), также был проанализирован липидный (общий холестерин, ЛПНП, ЛПВП, триглицериды), биохимического (билирубин общий и связанный, печеночные ферменты, щелочная фосфатаза) профиля сыворотки крови пациентов.
Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформ-ной экстракции [5]. Амплификацию исследованных локусов ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе «GeneAmpPCRSystem 2720» производства компании «Applied Biosystems» (США). Определение нуклеотидных замен проводили методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Перечень исследованных локусов, последовательности праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов, названия рестриктаз представлены в табл. 1.
Результаты оценивали методом электрофореза в 7 %-ном полиакриламидном геле и 2 %-ном агароз-
Таблица 1.
Полиморфные варианты, последовательности праймеров, номенклатура аллелей анализируемых ДНК-локусов
Ген Полиморфный вариант, dbSNP Праймеры, 5' — 3' (ссылка) Рестриктаза, аллели (размер фрагментов п.н.)
APOB-100 7673C>T rs693 GGAGACTATTCAGAAGCTAA GAAGAGCCTGAAGACTGACT (Jaime S.-C. et al., 2010) XbaI X-(C)- 710 X+ (T) - 433+277
ABCG5 i7892T>C rs4131229 ACTTCTGTCTGTGGCTTGCATT GAAAGAGATTGGAACCTAGAAG (Li Q., et al., 2012) Hha I T- 222 C - 185+37
Х
ном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете.
Статистическую обработку результатов исследования проводили c применением программного обеспечения MS Office Excel, программы SPSS (версия 15). Нормальность распределения проверялась по критерию Пирсона (х2). Различия среднеарифметических величин считали достоверными при р < 0,05. При попарном сравнении частот аллелей и генотипов, полового признака в группах больных и контроля применялся критерий х2 для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Йейтса на непрерывность.
Для количественных клинических показателей вычисляли средние величины и их стандартные ошибки (М ± m). Сравнение групп проводили с помощью T-критерия Стьюдента для независимых выборок и U-теста Манна-Уитни для распределения, отличного от нормального. Затем к полученным данным применяли ROC-анализ для получения оптимальных пороговых значений разделения с точки зрения чувствительности и специфичности, которые были использованы для перевода непрерывных показателей в дихотомические значения 0 или 1. Далее проводили полипараметрический анализ полученных данных с целью определения бинарной логистической регрессионной зависимости между ними, на основе которой была оценена вероятность наличия желчнокаменной болезни.
Результаты
При попарном сравнении частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs693в гене APOB-100 между больными ЖКБ и контрольной группой было выявлено, что в группе больных холелити-азом чаще встречались гетерозиготный генотип X+X- (52,1-59,8% случаев среди больных ЖКБ, 41,9-46,5% — в контрольной группе) (табл. 2).
При анализе фенотипических факторов (табл. 3) выявлена взаимосвязь повышенного уровня ферментов печени АЛТ и АСТ, общего и связанного билирубина, щелочной фосфатазы, лейкоцитов, уровня ЛПНП, ТГ, холестерина, гемоглобина, массы тела, индекса массы тела (ИМТ) — с желчнокаменной болезнью. Следующей задачей был выбор из множества полученных данных наиболее эффек-
тивных показателей, обладающих наилучшей предсказательной способностью и прогнозирующих развитие желчнокаменной болезни. Для ее решения использовали аппарат (ЮС-анализа (табл. 3).
Регрессионный логистический анализ показал, что наличие генотипа Х+Х-гена АроВ-100, массы тела более 56 кг, повышение уровня связанного билирубина > 2,9 мкмоль/л, нарушений липидного обмена (ЛПНП >1,68 ммоль/л и ЛПВП <1,26 ммоль/л) и лейкоцитоза > 6*109/л наиболее связаны с развитием ЖКБ. Далее переменные превратили в категориальные единицы с помощью (ЮС-анализа с созданием клинико-генетической диагностической модели и простой диагностической шкалы желчнокаменной болезни, которые могут быть внедрены в ежедневную клиническую практику (табл. 4).
На основании полученных в исследовании значений была разработана клинико-генетическая модель для диагностики наличия заболевания:
Р = 1/1 + ехр (-79,55 + 1,63*(Вес > 56 кг) (+ 3,21*(Лейкоцитоз > 6*109/л) + 2,56*(ЛПНП >1,68 ммоль/л) + 5,48*(ЛПВП <1,26 ммоль/л) + 6,39*(Связ. билирубин > 2,9 мкмоль/л) + 0,43*(Ге-нотип Х+Х-гена АроВ-100).
Обсуждение
В представленной работе структурированы кли-нико-лабораторные, биохимические и генетические показатели и впервые показано совокупное их влияние на риск развития холелитиаза. Ранее была доказана большая роль таких постоянных факторов, как пол, возраст (свыше 40 лет), наследственность, принадлежность к определенной этнической группе [6] и изменчивых факторов, характер питания, беременность и роды для женщин, избыточная масса тела, сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет, метаболический синдром, гиподинамия, ги-перхолестеринемия, гипертриглицеридемия, прием лекарственных препаратов (оральные контрацептивы, клофибраты) [7, 8].
Отдельно были изучены такие наиболее значимые факторы риска развития холецистолитиаза, как тендерные и возрастные особенности [9]. Гиперлипи-демия (повышенный уровень ЛПНП и ЛПОНП) [1], снижение уровня липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и повышение уровня триглицеридов рассмотрены как риски развития ЖКБ [10, 11].
Таблица 2.
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов ге693 гена APOB-100и гс4131229 гена ABCG5 у больных ЖКБ и практически здоровых лиц
Параметры Контроль (N = 172) ЖКБ (N = 195) Рх2
Генотипы AP0B-100 X+X+ 36(26,1) 31(18,9) 0,17
X+X- 64(46,4) 93(56,7) 0,01
X-X- 38(27,5) 40(24,4) 0,62
ABCG5 CC 25(14,9) 38(21,1) 0,18
CT 73(43,7) 80(44,4) 0,98
TT 69(41,3) 62(34,5) 0,23
Аллели AP0B-100 X+ 136(40,5) 155(47,3) 0,08
X- 200(59,5) 173(52,7) 0,08
ABCG5 C 123(36,8) 156(43,3) 0,09
T 211(63,2) 204(56,7) 0,09
Примечание: данные приведены в виде п (% от общей численности группы), где п — численность групп.
Таблица 3.
Феногенетические факторы, влияющие на развитие желчнокаменной болезни (М ± m)
Показатели Контроль (N = 172) ЖКБ (N = 195) ROC-анализ
Критерий (пороговые значения) AUC (95% ДИ) Р
Генотип X+X- гена АроВ-100, n 64 93 Р = 0,01 наличие 0,554 (0,496-0,610) 0,011
Масса тела (кг) 69,08 ± 0,86 (38-97) 5US 000 * 2 ° g £11 тЧ w CL 7 >56 0,57 (0,511-0,625) 0,04
ИМТ (кг/м2) 24,33 ± 0,37 (14,5040,40) 26,32 ± 0,35 (17,63-45,52) P = 0,001 > 21,6 0,59 (0,53-0,65) 0,01
Беременности, n 23 73 P < 0,001 > 3 0,76 (0,69-0,82) < 0,01
Сердечно-сосудистые заболевания, n 5 46 р = 0,001 наличие 0,767 (0,72-0,81) < 0,01
АЛТ (норма 0-40 Ед/л) 16,81 ± 0,63 (2-39) 70,65 ± 9,45 (6,8-904) P < 0,01 > 34 0,763 (0,71-0,81) < 0,01
АСТ (норма 0-40 Ед/л) 19,4 ± 0,7 (2-40) 58,05 ± 6,97 (9-761) P < 0,001 > 15 0,73 (0,68-0,78) < 0,0001
Общий билирубин (норма 8,5-20,5 мкмоль/л) 11,42 ± 0,3 (2-20) 26,87 ± 3,52 (5,6-561) P < 0,001 > 15,5 0,73 (0,68-0,78) < 0,001
Связанный билирубин (норма 2,0-5,1мкмоль/л) 2,20 ± 0,03 (1,5-2,9) 12,38 ± 1,74 (2-240) P < 0,001 > 2,9 0,99 (0,97-0,99) < 0,001
ЩФ (норма 35-130 Ед/л) 71,50 ± 2,74 (11-145) 171,18 ± 11,33 (6-1363) P < 0,001 > 115 0,75 (0,69-0,79) < 0,0001
ЛПВП (норма 0,77-2,19 ммоль/л) 1,26 ± 0,01 (1,09-1,9) 1,26 ± 0,04 (0,49-2,10) P = 0,898 <1,26 0,68 (0,63-0,74) < 0,001
ЛПНП (норма 0-3,0 ммоль/л) 1,98 ± 0,04 (1,68-3,26) 2,66 ± 0,07 (1,22-5,15) P < 0,001 > 1,68 0,69 (0,63-0,74) < 0,001
ТГ (норма 0,46-1,6 ммоль/л) 0,78 ± 0,01 (0,69-1,12) 1,32 ± 0,04 (0,56-3,54) P < 0,001 > 0,69 0,88 (0,83 - 0,91) < 0,001
Холестерин (норма 3,0-5,0 ммоль/л) 4,21 ± 0,05 (2,1-5,0) 5,64 ± 0,09 (2,7-9,3) P < 0,001 > 5 0,85 (0,80 - 0,89) < 0,001
Гемоглобин (норма 120-140 (ж), 130160 (м) г/л) 128,95 ± 0,43 (118-140) 133,05 ± 1,42 (5,3-260) P = 0,014 > 138 0,63 (0,57-0,69) < 0,001
Лейкоциты (норма 4,0-9,0 * 109г/л) 4,29 ± 0,14 (1,0-8,0) 8,59 ± 0,27 (3,7-31,8) P < 0,001 > 6 0,877 (0,834 - 0,912) < 0,001
Х
Таблица 4.
Параметры модели бинарной логистической менной болезни
регрессии и диагностическая шкала желчнока-
Заболевание Факторы риска Р OR, отношение шансов 95%-ный доверительный интервал Признак Баллы
Масса тела, кг < 0,001 5,13 2,50 10,52 > 56 1
< 56 0
Лейкоциты, *109/л < 0,001 24,76 13,32-46,04 > 6 1
< 6 0
Билирубин связанный, < 0,001 598,47 33,88-10570,72 > 2,9 1
LO мкмоль/л <2,9 0
* ЛПВП, ммоль/л < 0,001 240,85 32,74-1771,69 < 1,26 1
>1,26 0
ЛПНП, ммоль/л < 0,001 12,97 7,26-23,17 > 1,68 1
< 1,68 0
Генотип X+X-гена АроВ- 0,04 1,54 0,98-2,42 Наличие 1
100 Отсутствие 0
Изменения в структуре гена АроВ-100 регулируют транспорт липидов на различных уровнях и могут приводить к накоплению жиров в тканях и развитию атеросклероза и, как следствие, к повышенной секреции хС в желчь [12]. В нашем исследовании подтверждено внесение весомого вклада в вероятность развития желчнокаменной болезни нарушений липидного обмена ЛПНП и ЛПВП, а также генотипа Х+Х-полиморфного варианта гена АроВ-100, что подтверждает результаты аналогичных исследований ученых из Китая [13]. Напротив, исследования Sanchez-CuënJ, Aguilar-Medina М. et а1. в 2001 году в Мексике не подтвердили существования статистически значимой связи полиморфного варианта С-7673Т гена АРОВ-100 с развитием камней в желчном пузыре [14].
Создана диагностическая клинико-генетическая модель и разработана шкала для диагностики ЖКБ, которые позволяют представить количественную оценку формирования холелитиаза и выявить пациентов с факторами риска развития ЖКБ, которым необходимо провести раннюю диагностику для оптимизации лечения данного заболевания.
Этот подход может быть внедрен в ежедневную клиническую практику и перенесен в отношении других заболеваний, так как учитываются как генетические факторы, так и факторы внешней среды. Полученные данные могут быть использованы в организации диспансерной работы с больными гепа-тобилиарной патологией.
Заключение
Установлены диагностические фено-генетиче-ские критерии ЖКБ: наличие генотипа Х+Х- гена АРОВ-100, масса тела более 56 кг, лейкоцитоз >6*109/л, липидные нарушения (ЛПВП<1,26 ммоль/л, ЛПНП>1,68ммоль/л), связанный билирубин > 2,9 мкмоль/л.
Создана диагностическая клинико-генетическая модель риска развития холелитиаза.
С помощью логистического регрессионного анализа разработана шкала для диагностики ЖКБ, ко-
торая, по мере развития доступности технологий генотипирования, может быть применена в реальной клинической практике.
ЛИТЕРАТУРА
1. Rodriguez S. Lipids, obesity and gallbladder disease in women: insights from genetic studies using the cardiovascular gene-centric 50K SNP array / S. Rodriguez, Tom R. Gaunt, Yiran Guo et al. // European Journal of Human Genetics. — 2016. — № 24. — Р. 106-112.
2. Sun H. Gender and metabolic differences of gallstone diseases / H. Sun, H. Tang, S. Jiang et al. // World J Gastroenterol. — 2009. — № 15. — Р. 1886-1891.
3. Циммерман Я.С. Гастроэнтерология: руководство / Я.С. Циммерман. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. — 800 с. — С. 395-411.
4. Stinton L.M. Epidemiology of Gallbladder Disease: Cholelithiasis and Cancer / L.M. Stinton, E.A. Shaffer // Gut and Liver. — 2012. — Vol. 6, № 2. — Р. 172-187.
5. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. Walker J.M. N.Y.; Hamanpress. — 1984. — Vol. 2. — Р. 31-34.
6. Драпкина О.М. Заболевания билиарного тракта: новые методики профилактики и лечения / О.М. Драпкина // Эффективная фармакотерапия. — 2011. — № 5. — С. 36.
7. Ильченко А.А. Современный взгляд на проблему билиарного сладжа / А.А. Ильченко // РМЖ. — 2010. — Т. 18. — № 28. — С. 1707-1713.
8. Van Eijck F.C. Hartmann's gallbladder pouch revisited 60 years later / Van Eijck F.C. et al. // Surg. Endosc. — 2007. — Vol. 21. — № 7. — Р. 1122-1125.
9. Хохлачева Н.А. Возрастные и гендерные особенности развития желчнокаменной болезни / Н.А. Хохлачева, Н.Н. Сергеева, Я.М. Вахрушев // Архив внутренней медицины. — 2016. — Т. 1. — № 27. — С. 34-39.
10. Гаценко В.П. Целесообразность комплексного подхода при коррекции липидных нарушений у больных желчнокаменной болезнью и холестерозом желчного пузыря / В.П. Гаценко, Е.Р. Атькова, Р.А. Иванченкова // Лечащий врач. — 2011. — № 7. —
C. 15-19.
11. Mohr G.C. Plasma lipids and gallbladder disease / G.C. Mohr,
D. Kritz-Silverstein, E. Barrette-Connor // Am. J.Epidemiol. — 1991. — № 134. — Р. 78-85.
12. Shimada M. Overexpression of human lipoprotein lipase in transgenic mise / M. Shimada, H. Shimano, T. Gotoda et al. // J. Biol. Chem. — 1993. — Vol. 268. — Р. 17924-17929.
13. Han T. Apolipoprotein B-100 gene Xba I polymorphism and cholesterol gallstone disease / T. Han, Z. Jiang, G. Suo, S. Zhang // Clin. Genet. — 2000. — № 57. — Р. 304-308.
14. Sanchez L. Variation in the LRP-associated protein gene (LRPAP1) is associated with late-onset Alzheimer's disease / L. Sanchez, V. Alvarez, P. Gonzalez, et al. // Am. J. Med. Genet. — 2001. — №105. — Р. 76-78.
