CC BY
61
УДК 633.39: 631.531.027.34
МИТОТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ЧАСТОТА ХРОМОСОМНЫХ НАРУШЕНИЙ В КОРЕШКАХ АМАРАНТА ПОД ВЛИЯНИЕМ ГАММА-ИЗЛУЧЕНИЯ
Е. В. ГУДЫМ
Харьковский национальный аграрный университет имени В. В. Докучаева Харьковский район, Харьковская область, Украина, 62483, e-mail: elena-gudym00@rambler.ru
(Поступила в редакцию 05.09.2016)
Одной из наиболее актуальных проблем в настоящее время является поиск новых видов высокобелковых растений, отличающихся от традиционных по комплексу полезных свойств и признаков. Среди новых растительных ресурсов питания, используемых человечеством, особое место занимает амарант, которой в дальнейшем может стать одной из основных продовольственных культур. В мутационной селекции амаранта большое значение имеет расширение генетической изменчивости по различным морфо - биологическим и биохимическим признакам, что можно достичь методом экспериментального мутагенеза. В статье представлены исследования влияния гамма-излучения на образование мутантных форм, среди которых можно было бы выделить формы с ценными хозяйственными признаками. Показано, что сорта амаранта Сэм, Харьковский 1, Студенческий вида А. hуpochondriacus чувствительны к действию гамма-излучения, которое изменяет протекания митоза, что отражается в нарушениях формирования митотического аппарата, увеличении частоты нарушений митоза на уровне веретена деления и их суммарной частоты. Отмечено, что облучение в дозах 400 Гр и 700 Гр приводит к снижению митотической активности, а в некоторых случаях до полного подавления деления клеток. Было выявлено, что доза гамма-излучения 15 Гр, 30 Гр повышает митотическую активность клеток корневой меристемы. При воздействии высоких доз поражаются структура и функции генома, что проявляется в общем увеличении доли клеток с хромосомными аберрациями (мостами и фрагментами). В варианте с дозой 150 Гр процент нарушений растет от 6,7 у сорта Сэм до 7,7у сорта Харьковский 1.
Ключевые слова: амарант, митотическая активность, гамма-излучение, митоз, клетка, хромосомные нарушения, мосты, фрагменты.
One of the most pressing problems at the present time is the search for new types of high-protein plants, differing from traditional ones according to a complex of useful properties and characteristics. Among new plant food resources used by mankind, amaranth occupies a special place. It may be one of the major food crops in the future. In the mutation breeding of amaranth it is very important to expand genetic alterability according to various morphological-biological and biochemical characteristics, which can be achieved by experimental mutagenesis. The article presents research into the influence of gamma radiation on the formation of mutant forms, among which one could select forms with valuable economic traits. We have shown that amaranth varieties Sam, Kharkovskii-1, and Studencheskii of type A. hupochondriacus are sensitive to gamma radiation, which changes the course of mitosis, which is reflected in impaired formation of mitotic apparatus and increased frequency of mitosis abnormalities at the level of division spindle and their summary frequency. We have noted that the irradiation doses of 400 Gy and 700 Gy reduce mitotic activity and, in some cases, completely suppress cell division. We have established that gamma radiation dose of 15 Gy, 30 Gy increases the mitotic activity of root meristem cells. High doses affect the structure and function of genome, which is manifested in a general increase in the proportion of cells with chromosomal aberrations (bridges and fragments). In the variant with a dose of 150 Gy, the percentage of abnormalities increases from 6.7 in variety Sam to 7.7 in variety Kharkovskii-1.
Keywords: amaranth, mitotic activity, gamma radiation, mitosis, cell, chromosomal abnormalities, bridges, fragments.
Введение
Одной из основных задач мутационной селекции растений является изучение генетической активности мутагенных факторов с целью установления оптимальных условий для получения максимального количества наследственных изменений у исходного растительного материала [1]. Как известно, спонтанные мутации обусловлены изменениями в молекулярной структуре генов, количества или структуры хромосом. Они являются единственным источником появления принципиально новых признаков и свойств живых организмов. Все мутагенные факторы, которые используются для создания новых форм, делятся на физические, химические и биологические. К физическим мутагенам относятся радиация, температурный фактор, ультразвук. Радиация представлена электромагнитным и корпускулярным излучением. Наиболее эффективно используется в практической селекции электромагнитное излучение, в частности гамма-излучение.
Работами ряда исследователей [2, 4] убедительно доказано, что с помощью мутагенов можно изменить такие признаки, как урожайность, высота стебля и плотность колоса, окраска и качество зерна, устойчивость к болезням и т. д., сохранив в то же время основную совокупность свойств исходного сорта.
Известно, что мутагены неодинаково воздействуют на отдельные генотипы растений. Получение мутантных форм и их изучение - это только первый этап селекционной работы. Более важным является использование мутантов в гибридизации с целью получения положительных трансгрессий. Однако, получение мутантов и использование их для гибридизации требуют изучения генетической природы возникающих изменений, что имеет огромное значение для подбора эффективных и специфически действующих мутагенов. Мутанты, обладающие комплексом морфологических, физиологических и биохимических изменений, затрагивающих хозяйственно ценные свойства, в дальнейшем могут быть использованы для локализации генов, определяющих данный признак, с последующей гибридизацией и расщеплением в популяциях гибридов. Изучение уровня митотической активности, частоты и спектра хромосомных аберраций в первых пострадиационных митотических циклах клеток корневой меристемы позволяет получить достоверную оценку уровня первичных повреждений генетических систем и активности репарационных процессов [2].
Одним из убедительных доказательств поражающего действия мутагенов и основных показателей генетической изменчивости организмов на клеточном уровне являются хромосомные аберрации, появление которых зависит от природы и дозы мутагена, чувствительности клеток различных генотипов к мутагенному действию [3, 4]. Как известно, при высоких дозах снижение митотического индекса вызывает угнетение синтеза ДНК, связанное с нарушением работы матричных систем клеток. При летальных и сублетальных дозах большое значение для клеток имеет прямое или опосредованное воздействие радиации на компоненты хроматина. При воздействии высоких доз меняются структура и функции генома, что проявляется в общем увеличении доли клеток с хромосомными аберрациями, угнетении, задержке и даже полном подавлении митозов [5].
Цитологическими методами исследований амаранта начал заниматься F.W. Grant еще в 60 гг. ХХ в., продолжили работу в 1972 г. T. N. Khoshoo и M. Pal [6], внимание которых было сосредоточено на более детальном изучении хромосом. Начиная с 90 гг. ХХ в., учеными проводились исследования по подсчету количества хромосом у разных видов амаранта и построения идиограм. В 2013 г. M. Bonarosa et al. [7] изучали хромосомные аберрации в митозе, изменчивость и распределение гете-рохроматина в клетках амаранта
Селекция амаранта осложнена смешанной системой опыления [5] и скрытой изменчивостью его генома [6]. Поэтому для этой культуры является важным поиск методов, позволяющих расширить и повысить эффективность различных селекционно-генетических программ. В связи с этим требуется изучение генетики отдельных признаков амаранта, которое имеет большое значение для выявления и сохранения генетического разнообразия культуры, помогает выбрать наиболее эффективные методы и направления работы по созданию нового селекционного материала.
Цель наших исследований - изучение влияния различных доз гамма-излучения на частоту мито-тических нарушений в клетках корневой меристемы различных сортов амаранта.
Основная часть
Исходным материалом для исследования были три сорта амаранта вида Amaranthus hypochondriacus (Сэм, Харьковский 1, Студенческий). Проводили обработку семян физическим мутагеном (гамма-излучение). Источник облучения - 60Со. Дозы облучения: 15 Гр, 30 Гр, 40 Гр, 150 Гр, 400 Гр и 700 Гр. Место проведения обработки - ННЦ Институт метрологии (Украина, Харьков). Установка - ДЕТУ 12-05-02. За контроль использовали семена амаранта без обработки. Исследования проводили на трехдневных корешках амаранта, пророщенных в термостате.
В каждом варианте анализировали 5000 клеток с 10 корешков. Подсчитывали количество клеток в разных фазах митоза (профаза, метафаза, анафаза, телофаза) согласно методике, описанной в работе З. П. Паушевой [9]. Митотический индекс (МИ) выражали в промилле, т. е. количество митозов на 1000 клеток. Определяли частоту митотических нарушений с помощью анафазного метода: в каждом варианте просматривали 500-600 анафаз. По отношению количества анафазных клеток с нарушениями к общему количеству просмотренных анафазных клеток определяли процент клеток с нарушениями, согласно методике, описанной в работах Т. И. Гопций, З. П. Паушевой [8, 9].
Общеизвестно, что облучение всеми видами ионизирующей радиации вызывает изменения в характере и уровне активности пролиферативных процессов. Облучение в малых дозах значительно повышает уровень митотической активности и сокращает продолжительность митотического цикла. В то же время облучение в дозах порядка нескольких сотен Гр приводит к угнетению митотической активности, а в некоторых случаях до полного подавления деления клеток. При воздействии высоких доз поражаются структура и функции генома, что проявляется в общем увеличении доли клеток с хромосомными аберрациями (мостами и фрагментами), угнетении, задержке и даже полном подавлении митозов [2].
В целом, по характеру протекания митоза в корневой меристеме амаранта после гамма-облучения сортов Студенческий, Харьковский 1 и Сэм значительных различий не наблюдалось, но они отличались по количеству клеток, которые находились в стадиях профазы, метафазы, анафазы и телофазы. Учитывая количество клеток в стадиях митоза и общее количество просмотренных клеток, вычисляли митотический индекс (МИ), который уменьшался с ростом дозы мутагена.
По результатам исследований установлено, что обработка семян сортов амаранта Сэм, Харьковский 1, Студенческий гамма-лучами в дозе 15 Гр несколько повышала митотическую активность по сравнению с контролем. Так, например, у сорта Студенческий митотический индекс в дозе 15 Гр составил 38,2 %о, что на 0,8 %о превышает результат, полученный в контроле - 37,4 %о. В то же время обработка семян амаранта дозами 150 Гр, 400 Гр и 700 Гр негативно влияет на процесс деления клеток, а иногда и полностью подавляет митотическую активность. Так, у сорта Студенческий митотический индекс в дозе 150 Гр был меньше контроля на 4 %о и составлял 33,4 %о. Увеличение дозы облучения до 700 Гр приводило к уменьшению митотического индекса до 29 %о (табл. 1).
Сорт Доза у-излучения Исследовано клеток, шт. Количество клеток в фазах Митотический индекс, %о
профаза метафаза анас >аза телофаза
шт. % шт. % шт. % шт. %
Студенческий контроль 5000 380 7,6 570 11,4 560 11,2 361 7,2 37,4
15 Гр 5000 384 7,3 580 11,3 549 10,9 369 6,6 38,2
30 Гр 5000 341 6,8 543 10,8 538 10,8 311 6,2 34,7
40 Гр 5000 320 6,4 530 10,6 530 10,6 288 5,8 33,4
150 Гр 5000 280 5,6 514 10,2 520 10,4 251 5,1 31,3
400 Гр 5000 264 5,3 493 9,8 517 10,3 248 4,9 30,1
700 Гр 5000 259 5,2 495 9,3 510 10,2 245 4,8 29,5
НСРо,5 - - - - - - - - - 0,036
Харьковский 1 контроль 5000 367 7,3 558 11,2 558 11,6 353 7,1 36,7
15 Гр 5000 369 7,1 561 10,8 553 11,1 358 7,2 37,1
30 Гр 5000 339 6,8 538 10,7 548 10,9 330 6,6 36,5
40 Гр 5000 321 6,4 519 10,3 535 10,7 321 6,4 33,9
150 Гр 5000 288 5,8 490 9,8 515 10,3 305 6,1 31,9
400 Гр 5000 260 5,2 488 9,7 511 10,2 286 5,7 30,9
700 Гр 5000 255 5,1 482 9,6 506 10,1 262 5,2 30,1
НСРо,5 - - - - - - - - - 0,031
Сэм контроль 5000 375 7,5 564 11,3 564 11,3 363 7,3 37,3
15 Гр 5000 384 7,3 567 11,1 551 11,1 369 7,1 37,9
30 Гр 5000 358 7,2 544 10,8 544 10,9 331 6,6 35,5
40 Гр 5000 331 6,6 531 10,6 531 10,6 287 5,7 33,6
150 Гр 5000 297 5,9 512 10,2 522 10,4 275 5,5 32,1
400 Гр 5000 263 5,3 491 9,8 516 10,3 252 5,1 30,4
700 Гр 5000 257 5,1 475 9,5 508 10,1 249 4,9 29,8
НСРо,5 - - - - - - - - - 0,034
Доза гамма-излучения 15 Гр для сортов амаранта (вид А. hуpochondriacus) Сэм, Харьковский 1, Студенческий повышает митотическую активность клеток корневой меристемы. Повышение дозы снижает митотическую активность. В результате анализа нарушений митоза установлено, что митотическая активность в меристемах корешков амаранта зависит от дозы гамма-излучения и сорта. Специфика реакции генотипа проявляется в разной частоте хромосомных аберраций при одинаковых дозах мутагена. В целом, по частоте митотических нарушений в корневой меристеме амаранта после гамма-излучения сортов Студенческий, Харьковский 1 и Сэм значимых различий не выявлено, но они отличались по количеству фрагментов и мостов в клетках, которые увеличивались с ростом дозы мутагена (табл. 2).
Таблица 2. Частота клеток с хромосомными аберрациями в митозе корневой меристемы амаранта после гамма-излучения
Доза у-излучения Сорт Иследовано анафазных клеток Частота клеток с нарушениями
фрагменты мости общее количество
шт. % шт. % шт. % доля признака (р)
контроль Студенческим 560 - - 2 0,4 2 0,4 0,004
15 Гр 549 4 0,7 5 0,9 9 1,6 0,016
30 Гр 538 7 1,3 11 2 18 3,3 0,033
40 Гр 530 8 1,5 12 2,3 20 3,8 0,038
150 Гр 520 11 2,1 25 4,8 36 6,9 0,069
400 Гр 517 24 4,6 78 15,1 102 19,7 0,197
700 Гр 510 58 11,4 82 16,1 140 27,5 0,275
НСР05 - - - - - - - 0,014
контроль Харьковским 1 558 1 0,2 1 0,2 2 0,4 0,004
15 Гр 553 3 0,5 5 0,9 8 1,4 0,014
30 Гр 548 5 0,9 10 1,8 15 2,7 0,027
40 Гр 535 7 1,3 12 2,2 19 3,5 0,035
150 Гр 515 9 1,7 31 6 40 7,7 0,077
400 Гр 511 35 6,8 55 10,8 90 17,6 0,176
700 Гр 506 60 11,9 75 14,8 135 26,7 0,267
НСР05 - - - - - - - 0,012
контроль Сэм 564 - - 1 0,2 1 0,2 0,002
15 Гр 551 5 0,9 4 0,7 9 1,6 0,016
30 Гр 544 8 1,5 11 2 19 3,5 0,035
40 Гр 531 10 1,9 12 2,3 22 4,2 0,042
150 Гр 522 6 1,1 29 5,6 35 6,7 0,067
400 Гр 516 33 6,4 52 10,1 85 16,5 0,165
700 Гр 508 66 12,9 78 15,4 134 28,3 0,264
НСР05 - - - - - - - 0,017
Летальными для амаранта являются дозы 400 Гр и 700 Гр. Хромосомные аберрации могут иметь морфологическое проявление, что приводит к получению растений с морфо-биологическими изменениями, которые можно использовать в качестве исходного материала в селекции культуры. В нашем случае обработка дозой 150 Гр имеет большой выход измененных растений, проверка которых свидетельствует об образовании мутантных форм. Так, у сорта амаранта Студенческий при облучении дозой 15 Гр выявлено всего девять клеток с нарушениями, что составляет 1,6 % от общего количества клеток, из них четыре клетки с фрагментами и пять с мостами. При облучении этого сорта дозой 700 Гр идентифицировано 140 клеток с нарушениями, т. е. 27,5 % от общего количества, из них 58 - с фрагментами, 82 - с мостами.
У сорта Харьковский 1 в варианте с дозой 15 Гр эти показатели составляли восемь клеток (1,4 %), из которых три - фрагменты, пять - мосты; в дозе 700 Гр найдено 135 клеток с нарушениями (26,7 %), среди которых 60 с фрагментами и 75 с мостами.
У сорта Сэм при облучении в дозе 15 Гр выявлено девять клеток с нарушениями (1,6 %), в том числе пять с фрагментами и четыре - с мостами. В дозе 700 Гр нарушения имели 134 клетки (28,3 %), при этом в 66 отмечено наличие фрагментов, а в 75 - мостов.
Количество клеток с нарушениями в корневой меристеме амаранта после гамма-излучения превышало результаты, полученные в контроле (0,4 % для сортов Студенческий и Сэм и 0,2 % для Харьковский 1).
Заключение
Одной из наиболее актуальных проблем в настоящее время является поиск новых видов высокобелковых растений, отличающихся от традиционных по комплексу полезных свойств и признаков. Среди новых растительных ресурсов питания, используемых человечеством, особое место занимает амарант, которой в дальнейшем может стать одной из основных продовольственных культур. В мутационной селекции амаранта большое значение имеет расширение генетической изменчивости по различным морфо - биологическим и биохимическим признакам, что можно достичь методом экспериментального мутагенеза.
Таким образом, на основе проведенных исследований установлено, что предпосевная обработка семян гамма-излучениями влияет на митотическую активность в корневой меристеме амаранта. С одной стороны, дозы 15 Гр, 30 Гр способствуют процессу деления клеток, что выражается в повышении митотического индекса по сравнению с контрольным вариантом. С другой, дозы 400 Гр, 700 Гр приводят к угнетению митотической активности, резкому уменьшению митотического индекса. Сорта амаранта Сэм, Харьковский 1, Студенческий вида А. hypochondriacus чувствительны к действию гамма-излучения. При увеличении дозы гамма-излучения наблюдается повышение частоты хромосомных нарушений. Летальными для амаранта являются дозы 400 Гр и 700 Гр. В варианте с дозой 150 Гр процент нарушений растет от 6,7 % у сорта Сэм до 7,7 % у сорта Харьковский 1.
ЛИТЕРАТУРА
1. Козаченко, М. Р. Експериментальний мутагенезв селекци ячменю / М. Р. Козаченко. - Х., 2010. - 296 с.
2. Ларченко, Е. А. Сравнительный анализ наследственной изменчивости растений при мутагенной обработке генеративных клеток и семян кукурузы / Е. А. Ларченко, В. В. Моргун // Цитология и генетика. - 2000. - № 4. - С. 16-20.
3. Клименко, Я. В. Частота хромосомных аберраций озимой пшеницы индуцированных мутагенами при воздействии на семена и проростки / Я. В. Клименко, К. А.Ларченко // Физиология и биохимия культурных растений. - 2006. - № 3. -С. 222-227.
4. Моргун, В. В. Спонтанная и индуцированная мутационная изменчивость и ее использование в селекции растений / В. В. Моргун // Генетика и селекция в Украине на рубеже тысячелетий. - М.: Логос, 2001. - С. 144-174.
5. Тэфэри, Й. В. Создание исходного материала для селекции ярового ячменя с раздельным и комплексным применением гамма-лучей и химических мутагенов: дис. ... канд. сельскохозяйственных наук / Й. В. Тэфэри. - Х, 2006. - 19 с.
6. Khoshoo, T. N. Cytogenetic patterns in Amaranthus / T. N. Khoshoo, Pal M, Lewis K. R. - New York: Chromosomes Today, 1972. - Р. 259-267
7. Bonarosa M. Cytogenetic studies in four cultivated Amaranthus (Amaranthaceae) species / M. Bonarosa, L. Poggio, E. Greizerstein. - USA: Comp Cytogenet, 2013. - 114 p.
8. Гопций, Т. И. Амарант: биология, выращивание, перспективы использования, селекция / Т. И. Гопций. - М : Харьковский гос. ун-т им. В. В. Докучаева, 1999. - 272 с.
9. Паушева, З. П. Практикум по цитологии растений / З. П.Паушева. - М.: Наука, 1980. - 304 с.
