CC BY
267
УДК 576.385.7
И.Б. Бродский1, С.А. Брянцева1, А.М. Ковалева1, Е.Ф. Урюпова1, С.А. Гусев1,
В.И. Сергиенко1, Д.Г. Матишов2
МИКРОЯДРА КАК МАРКЕРЫ ХРОМОСОМНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ КЛЕТОК
'Федеральное государственное учреждение «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства.
Россия, Москва;
2Институт аридных зон ЮНЦ РАН, Россия, Ростов-на-Дону
Целостность и нарушения клеточных органоидов служат важными признаками при мониторинге изменений клеток и клеточных культур. Микроядра — структуры, возникающие при нарушениях митоза (незаконченное деление ядра и расхождение хромосом к полюсам клетки). В данном обзоре описаны способы возникновения и дальнейшая судьба микроядер, а также рассмотрена возможность использования микроядер в качестве маркеров при возникновении нарушений в клетках, в частности, при их онкотрансформа-ции.
Ключевые слова: микроядра, хромосомная нестабильность, маркер нарушений в клетках.
I.B. Brodsky1, S.A. Bryantseva1, A.M. Kovaleva1, E.F. Uryupova1, S.A. Gusev1, V.I. Sergienko1, D.G. Matishov2
MICRONUCLEI AS MARKERS OF CHROMOSOMAL ABNORMALITIES IN CELLS
'Federal State Institution "Research Institute of Physical and Chemical Medicine" of Federal Medical and Biological Agency, Moscow, Russia. 2Institute of Arid Zones of South Scientific Center of Russian Academy of Science, Rostov-on-Don, Russia
Integrity and abnormalities of cell organoids are significant characteristics used to monitor the alterations of cells and cell cultures. Micronuclei are formed in cells as a result of mitotic defects (deficient nuclear fission and chromosome disjunction to spindle poles). Here we describe the formation and subsequent fate of micronuclei, and consider the application of micronuclei as markers of cell's abnormalities, and malignant transformation in particular.
Key words: micronuclei, chromosomal instability, marker of cell's abnormalities.
Введение
Клеточная терапия и тканевая инженерия находят все более широкое применение в современной медицине. В терапевтических целях используют кератиноциты [1], фибробласты [2, 3], гепатоци-ты [4], эндотелиальные клетки [5], макрофаги [6], различные виды (типы) стволовых клеток [7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и др.]. Клиническое применение клеток, как правило, предполагает их культивирование «in vitro». Однако хорошо известно, что клетки, выращенные в культуре, часто характеризуются хромосомной нестабильностью и могут подвергаться онкотрансформации [15, 16].
В связи с этим понятен интерес исследователей к поиску простых и эффективных методов оценки безопасности применения различных типов клеток в терапии и тканевой инженерии. Среди различных методов оценки хромосомных нарушений тест на возникновение микроядер может оказаться достаточно простым, технологичным и эффективным [17, 18].
Следует отметить, что в настоящее время интерес к изучению образования микроядер в клетках постоянно растет. Число статей, посвященных этому вопросу, за последние 10 лет увеличилось в 2 раза (рис. 1).
ОБЗОРЫ
Журнал фундаментальной медицины и биологии Рост числа публикаций о микроядрах за последние 10 лет
ЁОО
450
о сг и
JUL1
150
U
'""в Si 17
^Ш 4 Б П
e J в ЭЗ ¡8 35 О * 3
1Э99 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 £007 2008 2009
ГОДЫ
Рис. 1. Рост числа публикаций, связанных с исследованиями микроядер по годам.
(Данные поисковой системы PubMed по критерию встречаемости терминов «т1сгопис1еш»/«т1сгопис1еЬ>).
Формирование микроядер
Микроядра — небольшие, округлые хроматин-содержащие интерфазные структуры, обнаруживаемые в цитоплазме клеток. Морфологически они сходны с основным ядром клетки, но по размерам значительно ему уступают. Показано, что микроядра могут содержать как целые хромосомы [26], так и хромосомные фрагменты [27, 28]. По этому признаку методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) их делят на два типа: центромер-позитивные (С+) и центромер-негативные (С-) [29].
Микроядра образуются при перемещении аб-берантных хроматиновых структур из ядра в цитоплазму. В культивируемых клетках заключение хромосомного материала в отдельную оболочку может происходить либо благодаря отпочкованию части ядерного материала во время фазы синтеза ^-фаза) клеточного цикла, либо благодаря конденсации ядерной оболочки вокруг неразошедших-ся хромосом после завершения митоза [30]. Следует отметить, что в большинстве случаев микроядра возникают при замедленном расхождении хромосом к полюсам делящейся клетки [31].
Рис. 2. Потенциальные последствия меротелических присоединений.
(A) Нормальное расхождение хроматид к полюсам клетки в анафазе. (B) Образование отстающей хроматиды. (C) Нерасхождение хроматид. Светлыми точками показаны окрашенные FISH участки. Серый цвет - хромосомы в митозе или хроматин в интерфазных клетках. Центросомы показаны в виде темных точек [32].
При нормальном делении клеток сестринские хроматиды двигаются к соответствующему полюсу. Движение осуществляется обычно в сторону того полюса, с которым хроматиду связывает большее число прикрепленных микротрубочек. Этот процесс начинается после формирования метафазной пластинки, когда хромосомы разрываются в месте соединения (в области центромеры) и хроматиды начинают движение к противоположным полюсам клетки: от каждой хромосомы одна хроматида движется к одному полюсу, другая — к другому (рис. 2А). Если же число прикрепленных к центромере микротрубочек обоих полюсов эквивалентно, то во время анафазы хроматиды остаются на месте - образуется отстающая хроматида (рис. 2В). Такое присоединение микротрубочек к кинетохо-ру называется меротелическим. Если эта хромати-да не попадает в ядра, образующиеся при делении клеток, то формируется микроядро (рис. 2С) [32].
На клетках линии HeLa (клетки линии церви-кальной карциномы человека) было показано, что спонтанное образование микроядер происходит при некорректном выстраивании хромосом в ме-тафазе, при запаздывании хромосом и дефектах формирования хромосомных мостиков на более поздних стадиях митоза. Большинство микроядер образуется из запаздывающих хромосом. Микроядра могут спонтанно возникать из: (1) микроядер, присутствующих в материнской клетке; (2) ядерных фрагментов, возникающих во время митоза; (3) хромосом, вытолкнутых в миниклетки, с последующим их слиянием с дочерними клетками [28].
Потенциальная судьба микроядер и клеток с микроядрами
Дальнейшая судьба микроядер может быть описана несколькими сценариями. У клетки, содержащей микроядро, может произойти нарушение
деления, вероятно как следствие активации путей репликации или репарации ДНК. Она может также переходить в апоптоз (рис. 3А). Если клетка делится, хромосома в микроядре может реплицироваться нормально. Если также произошла нормальная сегрегация в следующем митозе, то могут образоваться две диплоидные клетки (рис. 3В). В микроядре также возможно нарушение сегрегации и репликации. Это может привести к образованию одной дочерней клетки, которая сохраняет микроядро, и одной дочерней клетки без микроядра (рис. 3С). Микроядро может реплицироваться, но не может быть сегрегировано правильно в следующем митозе. В результате происходит ин-гибирование клеточного деления с образованием двуядерной клетки (рис. 3D) [32].
Все зависит от того, будет ли ДНК хроматиды, расположенной в микроядре, подвергаться репликации. Если репликация будет происходить, то будет ли ДНК нормально конденсироваться и будут ли хроматиды расходиться должным образом при последующем делении?
В одном из исследований обнаружено, что Х-хромосома в микроядре лимфоцита может подвергаться множественным раундам репликации без расхождения [33]. В другом случае хроматида в микроядре может реплицироваться неправильно, возможно, ввиду неисправности механизма репликации ДНК при изменении геометрии микроядра [32]. В любой из этих двух ситуаций клетка с микроядром может задерживаться в интерфазе, в то время как в клетке наблюдается активация ДНК репликации. Также клетка может вступить в следующий митоз с частично реплицированным микроядром. В этой модели формирование микроядра может приводить к объединению с основным хромосомным набором клетки уже в следующем митозе [32].
Рис. 3. Потенциальная судьба клеток с микроядром.
(А) Нарушение деления клетки или апоптоз (не показано). ф) Нормальная репликация хромосом и образование диплоидных клеток. (С) Нарушение сегрегации и репликации. ф) Образование двуядерной клетки [32].
Известно, что если клетка с микроядром вступила в митоз, то она чаще образует клетки с дополнительными микроядрами, однако, возможно формирование нормальных клеток без микроядер. Установлено, что наличие в клетке микроядер может указывать на развитие апоптоза [34]. Образование микроядер играет важную роль в геномной пластичности опухолевых клеток [35].
Существует альтернативная гипотеза о том, что после образования микроядер в клетке, они, вероятно, вытесняются или уничтожаются [30]. Однако точное понимание судьбы хромосом в микроядрах, а также клеток, их содержащих, является важным направлением будущих исследований.
Микроядерный скрининг при онкотрансформации
В настоящее время считается, что возникновение рака, как правило, сопровождается хромосомной нестабильностью. Так, в частности, исследования лимфоцитов периферической крови показали, что частота хромосомных аберраций в этих клетках может быть использована для предсказания риска возникновения рака [20]. Хромосомная нестабильность была показана и при нарушении амплификации центросом, при этом у пациентов было отмечено развитие рака молочной железы [36]. Показано, что хромосомная нестабильность проявляется в разной степени в клетках опухоли молочной железы [37]. Хромосомная нестабильность становится причиной возникновения хромосомного разнообразия в популяциях опухолевых клеток, что дает этим клеткам возможность расселяться и эволюционировать в организме [38].
Первоначально для анализа хромосомной нестабильности использовали исследование митотиче-ских хромосом [39, 40]. Однако этот метод характеризовался большим количеством ограничений: очень маленький размер получаемых анафазных фигур, требующая большого количества времени работа с препаратами, высокий уровень аберраций у контрольных животных и т.д. В качестве альтернативы исследователи стали использовать микроядерный тест, который позволяет быстро анализировать довольно большое число клеток [41, 28].
Для проверки клеток на наличие микроядер сейчас проводят следующий стандартный тест: препарат (например, эпителий ротовой полости) подсушивают, обрабатывают фиксатором Карнуа в течение 10 мин. и окрашивают в 2% красителе Гимзы в течение 10 мин. В светлом поле трансмиссионного светового микроскопа при 400-х кратком увеличении просматривают по 1000—2000 клеток/ пациент и подсчитывают число микроядер в клетках, а также число клеток, содержащих микроядра. Скачкообразное увеличение числа микроядер и клеток, содержащих микроядра, было отмечено при переходе от контрольных пациентов к тем, у которых отмечено предраковое состояние, а также
при развитии опухоли у пациентов с предраковой стадией [42]. Изменчивость распределения частот между пациентами была максимальной у больных со сформированной опухолью, за ними следовали предраковые и контрольные пациенты. Связь между образованием микроядер и развитием рака показана во многих исследованиях [43, 44, 45, 46, 47, 48].
Таким образом, микроядерный тест является чувствительным маркером хромосомных нарушений.
Помимо стандартного теста на наличие микроядер для повышения эффективности используют метод блокирования цитокинеза, который позволяет проводить подсчет микроядер только в тех клетках, которые успели разделиться. Этот метод основан на использовании цитохалазина B, ингибитора полимеризации актина, блокирующего цитокинез без нарушения деления ядра. При этом клетки, успевшие разделиться, становятся двух, трех и более ядерными. Данный метод все чаще стал применяться при стандартной оценке количества микроядер в качестве теста in vitro на гено-токсичность и испытание генотоксинов человека in vivo [49].
К чувствительным маркерам хромосомной нестабильности относят также ядерные «почки», которые по своему происхождению немного отличаются от микроядер. В микроядрах преобладает ДНК с теломерными и теломерно-центромерными участками, в то время как в ядерных «почках» эти участки хромосом отмечены не были [50].
Заключение
Не вызывает сомнения тот факт, что микроядра возникают в клетке при нарушениях процесса деления. Образование этих структур связано с хромосомной нестабильностью в клетке. Методика обнаружения микроядер в клетках сравнительно проста. И если будут разработаны подходы к автоматическому подсчету микроядер и клеток с микроядрами, то данный метод может быть с успехом востребован при оценке безопасности использования тех или иных клеток в терапевтических целях.
Особую важность эта проблема приобретает в связи с активными исследованиями, посвященными использованию различных типов стволовых клеток в клеточной терапии и тканевой инженерии. В литературе слабо освещены вопросы, связанные с обнаружением микроядер в мезенхимальных стволовых клетках (МСК). Немногочисленные работы описывают формирование микроядер в МСК при воздействии химических веществ [51, 52, 53] и радиоактивного облучения [54].
Можно предположить, что исследования в этом направлении помогут разработать эффективные методы идентификации потенциально опасных для трансплантации стволовых клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Oie Y., Hayashi R., Takagi R. et al. A novel method of culturing human oral mucosal epithelial cell sheet using post-mitotic human dermal fibroblast feeder cells and modified keratinocyte culture medium for ocular surface reconstruction. The British Journal of Ophthalmology. 2010;94(9):1244-1250.
2. Mitterberger M., Marksteiner R., Margreiter E. et al. Myoblast and fibroblast therapy for post-prostatectomy urinary incontinence: 1-year follow up of 63 patients. The Journal of Urology. 2008;179(1):226-231.
3. Harvey R.P. Regenerative medicine: Heart redevelopment Nature. 2010;467:39-40.
4. Dhawan A., Strom S.C., Sokal E. et al. Human hepatocyte transplantation. Methods in Molecular Biology. 2009;640:525-534.
5. Dudek A.Z. Endothelial lineage cell as a vehicle for systemic delivery of cancer gene therapy. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 2010;156(3): 136146.
6. Cao Q., Zheng D., Wang Y.P. et al. Macrophages and Dendritic Cells for Treating Kidney Disease. Nepron. Experimental Nephrology. 2010;117(3):e47-e52.
7. Barnab^Heider F., Бтойп J. Stem cells for spinal cord repair. Cell Stem Cell. 2008;3:16-24.
8. Segers V.F.M., Lee R.T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 2008;451:937-942.
9. Timmers L., Limb S.K., Arslana F. et al. Reduction of myocardial infarct size by human mesenchymal stem cell conditioned medium. Stem Cell Research. 2008;1:129-137.
10. Reinders M.E.J., Fibbe W.E., Rabelink T.J. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy in renal disease and kidney transplantation. Nephrology Dialysis Transplantation. 2010;25(1):17-24.
11. Sravanti K., Gerecht S. Engineering blood vessels using stem cells: innovative approaches to treat vascular disorders. Expert Review in Cardiovascular Therapy. 2010;8:1433-1445.
12. Zhongmin Z., Yong Z., Lei H. et al. More insight into mesenchymal stem cells and their effects inside the body. Expert Opinion on Biological Therapy. 2010;10(2):215-230.
13. Kumar S., Chanda D., Ponnazhagan S. Therapeutic potential of genetically modified mesenchymal stem cells. Gene Therapy. 2008;15:711-715.
14. Chen S.L., Zhu C.C., Liu Y.Q. et al. Mesenchymal stem cells genetically modified with the angiopoietin-1 gene enhanced arteriogenesis in a porcine model of chronic myocardial ischaemia. Journal of International Medical Research. 2009;37(1):68-78.
15. Rosland G.V., Svendsen A., Torsvik A. et al. Long-term cultures of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells frequently undergo spontaneous malignant transformation. Cancer Research. 2009;69(13):5331-5339.
16. Rubio D., Garcia S., Cueva T. De la et al. Human mesenchymal stem cell transformation is associated with a mesenchymal-epithelial transition. Experimental Cell Research. 2008;314:691-698.
17. Si H., Robertson E.H. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-encoded latency-associated nuclear antigen induces chromosomal instability through inhibition of p53 function. Journal of Virology. 2006;80(2):697-709.
18. Witczak M., Kociszewska I., Wilczynski J et al. Evaluation of chromosome aberrations, sister chromatid exchange and micronuclei in cultured cord-blood lymphocytes of newborns of women treated for epilepsy during pregnancy. Mutation Research. 2010;701(2):111-117.
19. Kaur J., Dey P. Micronucleus to distinguish adenocarcinoma from reactive mesothelial cell in effusion fluid. Diagnostic Cytopathology. 2010;38(3):177-179.
20. Bonassi S., Norppa H., Ceppi M. et al. Chromosomal aberration frequency in lymphocytes predicts the risk of cancer: results from a pooled cohort study of 22,358 subjects in 11 countries. Carcinogenesis. 2007;29(6):1178-1183.
21. Katic J., Cemeli E., Baumgartner A. et al. Evaluation of the genotoxicity of 10 selected dietary/environmental compounds with the in vitro micronucleus cytokinesis-block assay in an interlaboratory comparison. Food and chemical toxicology. 2010;48(10):2612-2623.
22. Ponzinibbio M.V., Crudeli C., Peral-García P. et al. Low-dose radiation employed in diagnostic imaging causes genetic effects in cultured cells. Acta Radiologica. 2010;51(9):1028-1033.
23. Singh S., Datta N.R., Krishnani N. et al. Radiation therapy induced micronuclei in cervical cancer - does it have a predictive value for local disease control? Gynecologic Oncology. 2005;97:764-771.
24. Fred C., Grawé J., Törnqwist M. Hemoglobin adducts and micronuclei in rodents after treatment with isoprene monoxide or butadiene monoxide. Mutation Research. 2005;585:21-32.
25. Gurr J.-R., Wang A.S.S., Chen C.-H. et al. Ultrafine titanium dioxide particles in the absence of photo activation can induce oxidative damage to human bronchial epithelial cells. Toxicology. 2005;213:66-73.
26. Leach N.T., Jackson-Cook C. The application of spectral karyotyping (SKY) and fluorescent in situ hybridization (FISH) technology to determine the chromosomal content(s) of micronuclei. Mutation Research. 2001;495:11-19.
27. Roy S.K., Thilagar A.K., Eastmond D.A. Chromosome breakage is primarily responsible for the micronuclei induced by 1,4-dioxane in the bone marrow and liver of young CD-1 mice. Mutation Research. 2005;586:28-37.
28. Rao X., Zhang Y., Yi Q., Hou H. et al. Multiple origins of spontaneously arising micronuclei in HeLa cells: Direct evidence from long-term live cell imaging. Mutation Research. 2008;646:41-49.
29. Lindberg H.K., Falck G.K., Järventaus H. et al. Characterization of chromosomes and chromosomal fragments in human lymphocyte micronuclei by telomeric and centromeric FISH. Mutagenesis. 2008;23(5):371-375.
30. Shimizu N., Itoh N., Utiyama H. et al. Nuclear waste disposal. Selective entrapment of extrachromosomally amplified DNA by nuclear budding and micronucleation during S phase. Journal of Cell Biology. 1998;140:1307-1320.
31. Cimini D., Degrassi F. Aneuploidy: the matter ofbad connections. Trends in Cell Biology. 2005;15(8):442-451.
32. King R.W. When 2+2=5: The origins and fates of aneuploid and tetraploid cells. Biochimica et biophysica acta. 2008;1786(1):4-14.
33. Leach N.T., Jackson-Cook C. Micronuclei with multiple copies of the X-chromosome: do chromosomes replicate in micronuclei? Mutation Research. 2004;554(1-2):89-94.
34. Kirsch-Volders M., Elhajouji A., Cundari E. et al. The in vitro micronucleus test: a multi-endpoint assay to detect simultaneously mitotic delay, apoptosis, chromosome breakage, chromosome loss and non-disjunction. Mutation Research. 1997;392(1-2):19-30.
35. Utani K-i., Kohno Y., Okamoto A. et al. Emergence of micronuclei and their effects on the fate of cells under replication stress. PLoS ONE. 2010;5(4).
36. Lingle W.L., Barrett S.L., Negron V.C. Centrosome amplification drives chromosomal instability in breast tumor development. PNAS. 2002;99(4):1978-1983.
37. Yoon D.-S., Wersto R.P., Zhou W. et al. Variable levels of chromosomal instability and mitotic spindle checkpoint defects in breast cancer. American Journal of Pathology. 2002;161(2): 391-397.
38. ChongFeng G., Furge K., Koeman J. et al. Chromosome instability, chromosome transcriptome, and clonal evolution of tumor cell populations. PNAS. 2007;104 (21):8995-9000.
39. Major J., Jakab M. G., Tompa A. The frequency of induced premature centromere division in human populations occupationally exposed to genotoxic chemicals. Mutation Research. 1999; 445(2):241-249.
40. Aydemir N., Bilaloglu R. Genotoxicity of two anticancer drugs, gemcitabine and topotecan, in mouse bone marrow in vivo. Mutation Research. 2003;537:43-51.
41. Miller R.C. The micronucleus test as an in vivo cytogenetic method. Environmental Health Perspectives. 1973;6:167-170.
42. Saran R., Tiwari R.K., Reddy P.P. et al. Risk assessment of oral cancer in patients with pre-cancerous states of the oral cavity using micronucleus test and challenge assay. Oral Cancer. 2008;44:354-360.
43. Fenech M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research. 2000;455:81-95.
44. Murgia E., Ballardin M., Bonassi S. et al. Validation of micronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes as early cancer risk biomarker in a nested case-control study. Mutation Research. 2008;639:27-34.
45. Karaman A., Binici D.N., Kabalar M.E. et al. Micronucleus analysis of patients with colorectal adenocarcinoma and colorectal polyps. World Journal of Gastroenterology. 2008; 14 (44):6835-6839.
46. Iarmarcovai G., Bonassi S., Botta A. et al. Genetic polymorphisms and micronucleus formation: a review of the literature. Mutation Research. 2007;658:215-233.
47. Yan B., Peng Y., Li C. Y. Molecular analysis of genetic instability caused by chronic inflammation. Methods in Molecular Biology. 2009;512:15-28.
48. Santos R.A., Teixeira A.C., Mayorano M.B. et al. Basal levels of DNA damage detected by micronuclei and comet assays in untreated breast cancer patients and healthy women. Clinical and Experimental Medicine. 2010;10(2):87-92.
49. Falck G., Catalán J., Norppa H. Influence of culture time on the frequency and contents of human lymphocyte micronuclei with and without cytochalasin B. Mutation Research. 1997;392: 71-79.
50. Lindberg H.K., Wang X., Järventaus H. et al. Origin of nuclear buds and micronuclei in normal and folate-derived human lymphocytes. Mutation Research. 2007;617:33-45.
51. Nutley E.V., Tcheong A.C., Allen J.V. et al. Micronuclei induced in round spermatids of mice after stem cell treatment with chloral hydrate: evaluations with centromeric DNA probes and kinetochore antibodies. Environmental and molecular mutagenesis. 1996;28(2):80-89.
52. Lähdetie J., Grawé J. Flow cytometric analysis of micronucleus induction in rat bone marrow polychromatic erythrocytes by 1,2;3,4-diepoxybutane, 3,4-epoxy-1-butene and 1,2-epoxy-butane-3,4-diol. Cytometry. 1997;28:228-235.
53. Chang P.Y., Torous D., Lutze-Mann L. et al. Impact of p53 status on heavy-ion radiation-induced micronuclei in circulating erythrocytes. Mutation Research. 2000;466:87-96.
54. Koshimoto C., Takahashi S., Kubota Y. et al. Evaluation of the effect of gamma-irradiation on fetal erythropoesis in rats using blood cell volume as the index. Journal of Radiation Research. 1994;35:74-82.
