CC BY
236
8
КОМПЬЮТЕРНАЯ ФОТОНИКА
МИКРОСКОП-СПЕКТРОФОТОМЕТР С МАТРИЧНЫМ
ФОТОПРИЕМНИКОМ
Н.Р. Белашенков, И.П. Гуров, А.И. Лопатин, А.В. Мельников
Рассмотрен вариант построения микроскопа-спектрофотометра, оснащенного матричным фотоприемником, для исследования микрообъектов и их локальных спектральных свойств. Проведен анализ характеристик микроскопа-спектрофотометра в сравнении с существующим прибором МСФУ-К производства ОАО «ЛОМО». Предложена методика анализа данных и повышения точности получаемых результатов с учетом особенностей наблюдения микрообъектов и характеристик матричного фотоприемника.
Введение
Для получения спектров пропускания и отражения микрообъектов в ряде случаев используют специальный тип микроскопов, называемых микроскопами-спектрофотометрами. Основная методика наблюдений заключается в том, что излучение с определенного участка поверхности микрообъекта направляют на вход спектрофотометрической насадки, которая регистрирует спектр. При этом микроскоп-спектрофотометр построен так, что микроскоп является основным функциональным узлом, а спектрофотометр - вспомогательным.
В настоящей статье рассматривается принципиально иной подход к построению микроскопа-спектрофотометра, когда основным узлом является спектрофотометр, а не микроскоп. При этом микроскоп является как бы «кюветным отделением», если сравнивать с классической схемой спектрофотометра, когда он расположен между источником монохроматического излучения и приемником.
В предлагаемом варианте для регистрации излучения на выходе микроскопа-спектрофотометра возможно использовать матричный фотоприемник, что позволяет получить за одно сканирование по длинам волн количество спектров, равное количеству элементов матрицы, а не единственный интегральный спектр, как в традиционных микроскопах-спектрометрах. Помимо этого, предлагаемый микроскоп-спектрофотометр позволяет получить информацию о спектре не по широкому полю, а от отдельных участков микрообъекта, размер которых зависит главным образом от разрешения матрицы (от размеров ее светочувствительных элементов) и от характеристик объектива.
Классический вариант построения микроскопа-спектрофотометра
Рассмотрим вначале принцип построения микроскопа-спектрофотометра МСФУ-К, выпускаемого ОАО «ЛОМО».
В состав микроскопа-спектрофотометра МСФУ-К входят микроскоп с комплектом объективов и окуляров и спектрофотометрическая насадка с приемником излучения (ФЭУ) [1]. Оптическая схема спектрофотометрической части МСФУ-К показана на рис. 1.
Объектив 2 формирует изображение объекта 1 в плоскости зеркальной линзы 11. Плоское зеркало 14 направляет излучение, отраженное от линзы 16, на ахроматический объектив 13, который переносит изображение исследуемого объекта в фокальную плоскость окуляра 12.
В центре каждой из шести линз 11 имеется участок круглой формы без отражающего слоя диаметром 0,1; 0,3; 0,5; 1,0; 2,0 мм, а также прямоугольной формы размером 0,05x2,5 мм. При визуальном наблюдении объекта через окуляр 12 этот участок представляет собой темное пятно и служит для выбора на поверхности исследуемого объекта участка для
фотометрирования. Излучение, попадающее на участок без отражающего слоя, проходит через линзу 11 и поступает в монохроматор.
Плоское зеркало 9 и объектив 10 направляют поток излучения на плоскую дифракционную решетку 4 (600 штрихов на миллиметр). Отраженные от решетки дифрагированные потоки излучения фокусируются объективом 5 в плоскости выходной щели 6 монохроматора. Последовательное выделение монохроматического излучения осуществляется поворотом дифракционной решетки. Монохроматическое излучение, выходящее из щели 6, с помощью линзы 7 собирается на приемной площадке фотоприемника 8. В данной схеме в качестве приемника используется фотоэлектронный умножитель. Применение высокостабильного и высокочувствительного фотоэлектронного умножителя ФЭУ R928 фирмы HAMAMATSU (Япония) позволяет регистрировать спектры отражения в диапазоне длин волн от 380 до 800 нм, а также спектры люминесценции в диапазоне от 350 до 800 нм.
Микроскопы-спектрофотометры, аналогичные по принципу работы прибору МСФУ-К, как уже отмечалось выше, за одно сканирование монохроматора по длинам волн позволяют записать только один спектр. Полученный при этом спектр является характеристикой не отдельного малого участка объекта, размер которого позволяет разрешить объектив, а интегральной спектральной характеристикой по площади объекта. Преимуществом классического построения прибора является возможность исследовать спектры люминесценции за счет того, что спектральная приставка расположена после объектива микроскопа, и имеется возможность освещать исследуемый объект возбуждающим люминесцентцию излучением.
Прибор с матричным фотоприемником
Предлагаемый вариант микроскопа-спектрофотометра включает три основных узла: монохроматор с осветителем, микроскоп и монохромную цифровую видеокамеру. Блок-схема разработанного лабораторного образца микроскопа-спектрофотометра представлена на рис. 2.
Излучение от галогенной лампы 1 фокусируется зеркальным конденсором 2 на входную щель монохроматора 3. На выходе монохроматора размещен волоконный жгут 4, с помощью которого освещение направляется на исследуемый образец в микроскопе 5. При помощи объектива изображение объекта формируется в плоскости матрицы видеокамеры 6. Таким образом, прибор работает по принципу спектрофотометра, так как объект размещается между монохроматором и приемником излучения.
Лабораторный образец построен на основе серийного монохроматора МДР-206, микроскопа МИКМЕД-6 и цифровой видеокамеры с КМОП матрицей фирмы OmniVision.
Методика наблюдений аналогична работе со спектрофотометром. Вначале проводится сканирование по заданным длинам волн без образца (как известно, эта процедура в спектрофотометрии называется записью базовой линии) затем производится сканирование по тем же длинам волн, но уже с образцом, после чего выполняется операция деления результатов, полученных с образцом, на базовую линию. В результате получают оценку спектра пропускания исследуемого образца.
В созданном лабораторном образце микроскопа-спектрофотометра монохроматор и видеокамера подключены к персональному компьютеру и управляются при помощи специальной компьютерной программы.
Управление системой и синхронизация работы монохроматора и видеокамеры
Микроскоп-спектрофотометр функционирует в автоматическом режиме сканирования по длинам волн. Дискретные значения длин волн задаются требуемым спектральным диапазоном и шагом сканирования по длине волны. Видеокамера регистрирует изображения на дискретных длинах волн, выделяемых монохроматором. При работе монохроматора проявляется влияние механических вибраций, поэтому перед записью изображения необходимо установить некоторую задержку, чтобы изображение, получаемое от видеокамеры, было устойчивым.
г
Рис.2. Оптическая схема микроскопа-спектрофотометра
Блок-схема, определяющая автоматизированный режим работы микроскопа-спектрофотометра, представлена на рис. 3.
Рис.3. Алгоритм управления и синхронизации микроскопа-спектрофотометра
Рассмотренный алгоритм управления является достаточно простым, однако не позволяет проводить точные измерения, если выходной оцифрованный сигнал с матрицы имеет низкую разрядность (например, 8 бит) и, следовательно, ограниченный динамический диапазон. При этом достаточно точные измерения возможны, если выходящее из монохроматора излучение имеет равномерное спектральное распределение. Если это условие не выполняется, то точность значительно снижается. Для устранения этого недостатка реализованы рассматриваемые ниже специальные алгоритмы, которые позволяют повысить точность получаемых результатов.
Сканирование с подстройкой времени экспозиции
Время экспозиции видеокамеры (время накопления) определяет временной интервал накопления заряда в ячейках матрицы под действием освещающего излучения. С помощью этого параметра можно управлять уровнем сигнала.
При существенно неравномерном спектре излучения и ограниченной разрядности цифрового сигнала видеокамеры в ряде случаев оказывается невозможным записать базовую линию. Изменяя значение времени экспозиции для участков спектра с разной интенсивностью, можно записать базовую линию без потери точности. В режиме спектрального сканирования образца нужно изменять время экспозиции на те же значения и на тех же участках спектра, что и при записи базовой линии.
Устранения влияния темнового тока фотоприемной матрицы
Известно, что светочувствительные матрицы характеризуются значением «темнового» тока (см., например, [2]), влияние которого необходимо учитывать при малых значениях интенсивности регистрируемого излучения. При делении результатов измерения, полученных при сканировании образца, на значения базовой линии величины числителя и знаменателя включают заметную составляющую темного тока, что является источником погрешностей оценки коэффициента спектрального пропускания образца.
Для повышения точности значения темнового тока для каждого элемента матрицы вычитаются из базовой линии и измеренных результатов сканирования образца. Для
получения оценки значений темнового тока предварительно регистрируется темновое изображение матрицы при перекрытом освещающем пучке.
Компенсация неравномерности освещения по полю
Формирование освещения по полю с высокой степенью равномерности, особенно при использовании объективов малого увеличения (4-10 крат) с широким полем, представляет достаточно сложную техническую задачу. Компенсировать влияние неравномерности освещения можно с использованием компьютерной обработки, а именно, при записи базовой линии для каждого пиксела и делении результатов при сканировании образца по длинам волн на значения базовой линии для каждого пиксела.
Накопление и усреднение видеокадров для уменьшения влияния шума матрицы
Матрица видеокамеры имеет собственные случайные шумы (тепловые, дробовые и др.), величина которых зависит от многих факторов (температуры, уровня освещенности и
т.д.) [2].
Влияние составляющих шума можно уменьшить, если провести усреднение по набору видеокадров. Для этого после установки монохроматора на заданную длину волны регистрируются несколько изображений с последующим попиксельным усреднением. Дисперсия составляющих шума, аппроксимируемых гауссовским распределением вероятности, при этом уменьшится как корень квадратный из числа усредненных видеокадров.
Метод особенно полезен, когда при измерениях в условиях малой освещенности недостаточно максимального значения экспозиции и приходится увеличивать коэффициент усиления, и дисперсия шума возрастает прямо пропорционально увеличению коэффициента усиления.
Компьютерная программа визуализации результатов
Алгоритмы управления микроскопом-спектрофотометром и обработки данных реализованы в специальной компьютерной программе. Вид окна программы показан на рис. 4.
Основное поле графического интерфейса программы разделено на две части. Расположенная слева часть представляет изображение, синтезированное с помощью визуализации записанных спектров. В правой части отображается спектр в выбранной пользователем точке поля изображения. Совместная визуализация участка изображения и спектров в отдельных точках позволяет оценить свойства микрообъекта на выбранных участках, например, на неоднородностях микрообъекта и на границах неоднородностей, представляющих интерес для исследователей.
Заключение
Проведенные исследования лабораторного образца показали высокую эффективность предложенного варианта микроскопа-спектрофотометра. Основное преимущество прибора по сравнению с известными приборами аналогичного назначения состоит в многократном увеличении получаемой полезной информации за одно сканирование по длинам волн. Преимущество достигается на основе эффективного использования современных возможностей оптоэлектроники и компьютерных технологий.
Разработаны методы и алгоритмы, обеспечивающие повышение точности, достоверности получаемых результатов и расширяющие сферу применения предложенного варианта микроскопа-спектрофотометра в биологии, медицине, криминалистике и т.д.
ЩНЕЕНЙЗИ ЗЕ
Рис.4. Внешний вид программы управления и обработки данных
Важно отметить, что лабораторный образец собран из серийно выпускаемых узлов без существенной дополнительной доработки. При проведении экспериментов установлена возможность использования в качестве составных частей микроскопа-спектрофотометра различные комбинации серийных микроскопов, монохроматоров и цифровых черно-белых камер, что обеспечивает вариативность основных характеристик прибора в зависимости от решаемой задачи в заданной области исследований.
Литература
1. Каталог и описание продукции ОАО «ЛОМО»: http://www.lomo.ru/site/catalog/.
2. Ишанин Г.Г. Приемники излучения оптических и оптико-электронных приборов. Л.: Машиностроение, 1986.
