CC BY
34
Б1ЯЛАГГЧНЫЯ НАВУК1
27
УДК 599.742.73
С. А. Зятьков1, Г. Г. Гончаренко2
1 Старший преподаватель, кафедра зоологии, физиологии и генетики, физиологии и генетики. УО «Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины»,
г. Гомель, Республика Беларусь 2Член -корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук, профессор, кафедра зоологии, физиологии и генетики, заведующий кафедрой зоологии, физиологии и генетики, УО «Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины» г. Гомель, Республика Беларусь
МИКРОСАТЕЛЛИТНЫЕ ЛОКУСЫ В ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДАКТИЛОСКОПИ И ПОРОД ДОМАШНЕЙ КОШКИ FELIS CATUS L.
В работе представлены данные по геному домашней кошки Felis catus. Рассмотрены микросателлитные локусы в качестве наиболее удобных генетических маркеров для дактилоскопии особей и пород F. catus. Охарактеризованы идентификационная панель, основанная на использовании 10 локусов с динуклеотидными повторами с вероятностью совпадения генотипа, равной 10~10, а также 11-локусная панель с тетрануклеотидными повторами с вероятностью совпадения 10~б-10~8.
Ключевые слова: микросателлиты, Felis catus, STR-локус, праймеры, идентификационная
панель.
Введение
Успешное развертывание исследований по проекту «Геном кошки» (2002-2007) [1, 657686], [2, 1675-1689] дало возможность анализировать на молекулярном уровне, как отдельные структурные гены, так и любые другие участки ДНК в геномах этого вида. Установлено, что гаплоидный геном домашней кошки Felis catus L. (19 хромосом) содержит 2,7 х 10 нуклеотидных пар (н.п.) и более 20 тыс. генов [2, 1675-1689].
В последние годы на основе данных по структуре генома стремительно развиваются методы ДНК-идентификации, позволяющие проводить дактилоскопию отдельных особей, генетическую паспортизацию пород и установление видовой принадлежности особей семейства (сем.) Кошачьи.
Целью данной статьи было охарактеризовать микросателлитные локусы в качестве наиболее удобных генетических маркеров для дактилоскопии особей и пород F. catus. и рассмотреть многолокусные идентификационные панели, использующиеся в практической работе.
Результаты исследований и их обсуждение
Характеристика микросателлитных локусов
Одним из наиболее удобных и широко используемых маркеров для ДНК-идентификации являются микросателлиты. Это особый класс ДНК-маркеров, представляющих собой фрагменты ДНК с большим количеством - до ста и выше - тандемно повторяющихся идентичных «мотивов». отивом является короткая последовательность из нескольких (от двух до восьми) пар отидов, обычно называемая «повтором» [3, 21-28].
В зависимости от длины повтора микросателлиты классифицируют на локусы с ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклеотидными повторами. Таким образом, микросателлитом, или кросателлитным локусом (STR-локусом, Short Tandem Reapets) называют участок ДНК, расположенный в конкретной хромосоме и содержащий короткие тандемные повторы.
Аллели микросателлитного локуса отличаются друг от друга числом повторов и, как следствие, длиной. Микросателлитные локусы высокополиморфны, т. е. для каждого из них имеется много аллелей. Например, локус FCA149, локализованный в хросмосоме В1 домашней кошки, содержит динуклеотидные повторы ТГ [4, 1039-1051]. В популяциях F. catus обнаружено
© Зятьков С. А., Гончаренко Г. Г., 2017
28
ВЕСН1К МДПУ iMH I. П. ШАМЯК1НА №2(50) 2017
6 аллелей этого локуса (с числом повторов от 13 до 18). Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего повторы ТГ и прилежащие к повторам справа и слева (фланкирующие) последовательности ДНК. представлены на рисунке 1. Из рисунка хорошо видно, что данный аллель локуса РСЛ149 имеет 17 повторов ТГ. Поэтому формула данного локуса записывается как БСЛ149 (ТГ)17 [4, 1039-1051].
5'- ggacttccat ttaataagac ccccactccc tggaaagaaa tatgtgtgtg tgtgtgtgtg
tgtgtgtgtg tgtgtgtacg tattcatccc acacatggtg agacacccag antnctctag-3'
Рисунок 1. -
Фрагмент ДНК, содержащий ТГ повторы локуса FCA149 и фланкирующие участки
Микросателлитные фрагменты выявляют методом полимеразной цепной реак
ции (ПЦР), ента Д
обеспечивающим амплификацию - многократное увеличение копий данного фрагмента ДНК. Синтез этого фрагмента инициируется ДНК-затравками в виде пары праймеров, синтетических олигонуклеотидов, комплементарных нуклеотидным последовательностям на границах исследуемого фрагмента. Так как микросателлитные аллели короткие и вместе с праймерами обычно не превышают 200-300 п.н., то даже сильно поврежденный биологический материал может содержать полные копии исследуемого фрагмента ДНК, обеспечивая их успешную амплификацию. Именно по этой причине ПЦР микросателлитов оказался особенно важным для судебно-медицинских исследований. Для исследуемого микросателлитного локуса конструируют такую пару праймеров, чтобы комплементарные им фланкирующие участки ДНК были высокоспецифичны, т.е. отсутствовали в других участках генома. Длина праймеров должна быть не менее 20-30 п.н., их 3'-концы не должны быть комплементарными друг другу [5, 74-78].
Интересным примером микросателлитного локуса является протоонкоген вируса саркомы кошки fes/fps, который расположен в длинном плече хромосоме 15 человека и содержит тетрануклеотидные повторы ATTT в интроне 5 этого гена. Повторы ATTT и определяют микросателлитный локус, обозначаемый как FES/FPS. В популяциях человека обнаружен ряд аллелей локуса FES/FPS с числом повторов от 7 до 15. На рисунке 2 дана нуклеотидная последовательность фрагмента интрона 5 гена fes/fps между позициями 4631 и 4800, где располагаются повторы ATTT (полная длина гена fes/fps превышает 12 тыс. пар нуклеотидов). Формула STR-локуса FES/FPS записывается как (ATTT)lb поскольку в наиболее характерном аллеле содержится 11 повторов ATTT (на рисунке 2 выделены жирным). На этом же рисунке подчеркнуты участки ДНК для пары праймеров, которые успешно используются при амплификации аллелей локуса FES/FPS.
Рисунок 2. - Фрагмент ДНК, содержащий АТТТ повторы микросателлитного локуса FES/FPS и фланкирующие участки, расположенные в интроне 5 протоонкогена вируса саркомы кошки fes/fps, локализованного в длинном плече хромосоме 15 человека
Необходимо подчеркнуть, что в последние десятилетия были разработаны эффективные методы анализа микросателлитов с использованием праймеров, меченных флуоресцентными красителями, с последующей детекцией продуктов реакции с помощью автоматических секвенаторов ДНК [6, 1026-1031].
Б1ЯЛАГ1ЧНЫЯ НАВУК1
29
они не является
методов
Панель микросателлитных локусов для идентификации особей F. саи За последние годы было установлено, что микросателлитные локусы у всех исследованных видов являются высокополиморфными, включая и микросателлиты Е. саЫв, с десятками аллелей в каждом локусе и высокими темпами мутирования [7, 278-281], [8, 235-245], [9, 2749-2757].
Поскольку микросателлитные локусы являются селективно-нейтральными, подвержены действию естественного отбора. Комбинация аллелей таких локусов уникальной характеристикой каждой особи.
Интересно отметить, что уже в первой работе, посвященной разработке дактилоскопии кошек на основе микросателлитов Менотти-Раймонд с соавторами [4, 1039-1051 использовали 10 микросателлитных локусов с динуклеотидными повторами. В предыду разделе нашей статьи приведен пример (рисунок 1) для одного локуса FCA 149. В нем обнаружено 6
аллелей, содержащих динуклеотидный мотив ТГ с количеством повторов от 13 до 18. Следовате_____,
при 6 аллелях в популяциях Е. са1ш по этому локусу будет 21 различный генотип. Если использовать для идентификации кошек, кроме локуса FCA 149, еще один локус также с 6 аллелями, это позволит различать (21х21) 441 генотип. В работе Менотти-Раймонд и др. [4, 1039-1051] использовалось 10 микросателлитных локусов, количество аллелей в каждом из которых варьировало от 5 до 10. Это означает, что количество возможных многолокусных генотипов по этим 10 генам у кошек составляет более 10 миллиардов (1010). Иными словами, только у одной особи Е. саи из 10 млрд генотип при использовании этого набора локусов может совпасть с какой-либо другой особью. Таким образом, разработанная по 10 микросателлитным локусам идентификационная панель позволяет проводить точную генетическую дактилоскопию любой особи Е. са(ш.
В дальнейшем исследователи предложили для дактилоскопии кошек использовать набор из 11 микросателлитных локусов, содержащих тетрануклеотидные повторы [10, 1061-1070]. Тетрануклеотидный мотив, хромосомная локализация, количество аллелей, а также оптимальный набор праймеров для амплификации этих 11 локусов приведены ниже в таблице 1. Данная идентификационная панель позволяет проводить точную генетическую дактилоскопию для 28 пород Е. саи с вероятностью совпадения генотипов у двух особей, равной 10-6, а для непородистых - 10-8 [10, 1061-1070]. Эта панель прошла этапы сертификации и получила статус стандарта для ДНК-тестирования в криминалистических лабораториях США.
Таблица 1. - Характеристика 11 тетрануклеотидных микросателлитных локусов иллюстрирующих ДНК идентификационную панель
Локус Мотив м ца оз о а 2 § ма ок ро Хр ол о вт й се ел £ ё лл Кло ал Размер ампликонов, н.п. Последовательность праймеров 5'-3' с указанием флуоресцентной метки
РОД 723 (ааДД)8 а (аДДД)15 Д1 20 243-317 г 6РДМ-ТаДДааОТДДааОДОаДТДаДТДаТО и аООДОООДааТаТООТаОТТО
РОД 731 (ООДТ)8/(ООДТ)П В1 6 337-401 Г 6РДМ-ДТООДТОТаТООДТООДТОТДТТ и ааТОДаОДТОТООДОТТаДаа
РОД 733 (аДТД)п В2 16 128-226 г аДТООДТОДДТДааТДДДТааДТДДДаДДаДТа и 6РДМ-ТааОТаДаТДДТДТТООДОТаТОТОТО
РОД 736 (ДТДО)10 (ОД)3 (ДТДа)14 В4 23 164-222 г У1О-ООаДаОТОТаТТОТаааТДТаДД и аТаТОТТТОТДаТТааТОааТОТаТОТДТОТа
РОД 740 (аДТД)п О1 7 308-336 г КЕБ-ООДДааДаОТОТаТаДТаОДДД и аТТОООДОДааТДДДОДТОДДООДД
РОД 742 (ОТТТ)ц Б4 15 122-175 г КЕБ-ДДДТТТОДДТаТОТТаДОДДОаОДТДДа и аООДааДДОДООДТаТТаааОТД
РОД 749 (аДТД)ю/ (аДТД)6 Р2 14 276-416 г РЕТ-аДааДаОТТДОТТДДаДаОДТаОаТТО иаТаТОТТДДДООТДТДТТОааДТТаТаООТаОТ
Р124 (аДДД)15 Е1 20 255-367 г У1О-ТаТаОТаааТДТаДДаООТДОТа и аТаТОТТООДТаОООДТДДДааОТОТаД
Р53 (аДДД)8 Д1 11 115-272 г РЕТ-ООТДТаТТаааДаТДаДаДТОДООТ и аТаТОТТаДаТааОТаТааОДТТТОО
Р85 (ОТТТ)10(ОТ)„(Т)4(ОТТТ)15 В1 32 183-301 г КЕБ-ТДДДТОТааТООТОДОаТТТТО и аООТаДДДДТаТДТООДТОДОТТОДаДТ
РОД 441 (аДТД)9 Б3 8 113-137 г аТаТОТТаДТОааТДааТДааТДаДТДТДа и У1О-ДТДТааОДТДДаООТТаДДаОДДД
:
"С
30
ВЕСН1К МДПУ ÎMH I. П. ШАМЯК1НА №2(50) 2017
Необходимо добавить, что для контроля происхождения и индивидуальной идентификации кошек Международным обществом генетики животных (ISAG) с 2006 года рекомендована также идентификационная панель, использующая систему маркеров, основанную на анализе 9 микросателлитных локусов с ди- и тетрануклеотидными повторами [11, 371-377], [12, 1-7].
Выводы
Таким образом, в данной статье рассмотрены микросателлитные локусы в качестве наиболее удобных генетических маркеров для дактилоскопии особей и пород F. catus. Охарактеризованы идентификационная панель, основанная на использовании 10 локусов динуклеотидными повторами с вероятностью совпадения генотипа, равной 10-10, а также локусная панель с тетрануклеотидными повторами с вероятностью совпадения 10-6-10-8
Работа проводилась в рамках тем ГПНИ 16-14 и ГПНИ 16-32, при Государственных программ «Биотехнологии» и «Природопользование и экология».
СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. O'Brien, S. J. The Feline Genome Project / S. J. O'Brien [et al.] // P. 657-686.
2. Initial sequence and comparative analysis of the cat genome / J. U. Pontius[et al.] // Genome Res., 2007. - V. 17. - P. 1675-1689.
3. Tautz, D. Notes on the definition and nomenclature of tandemly repetitive DNA sequences / D. Tautz // DNA Fingerprinting: State of the Science, Basel, Switzerland, 1993.- P. 21-28.
4. Genetic Individualization of Domestic Cats Using Feline STR Loci for Forensic Applications / M. Menotti-Raymond [et al.] // Journal Of Forensic Sciences, 1997. - V. 42 (6). - P. 1039-1051.
5. Животовский, Л. А. Микросателлитная изменчивость в популяциях человека и методы ее изучения / Л. А. Животовский // Вестник ВОГиС, 2006. - Т. 10. - № 1. - С. 74-96.
6. Ziegle, J. S. Application of automated DNA sizing technology for genotyping microsatellite loci / J. S. Ziegle, Y. Su, K.P. Corcoran // Genomics, 1992. - V. 14. - P. 1026-1031.
7. Spontaneous mutation rates to new length alleles at tandem repetitive hypervariable loci in human DNA / A. J. Jeffreys [et al.] // Nature, 1988. - V. 332. - P. 278-281.
8. Spontaneous mutation at the hypervariable mouse minisatellite locus Ms6-hm: flanking DNA sequence and analysis of germline and early somatic mutation events / R. Kelley [et al.] // Proc. R. Soc. Lond. B., 1991. - V. 245. - P. 235-245.
9. Henderson, S. T. Instability of simple sequence DNA in Saccharomyces cerevisiae / S. T. Henderson, T.D. Petes // Mol. Cell. Biol., 1992. - V. 12. - P. 2749-2757.
10. An STR Forensic Typing System for Genetic Individualization of Domestic Cat (Felis catus) Samples / M. A. Menotti-Raymond [et al.] // J. Forensic. Sci., 2005. - Vol. 50 (5). - P. 1061-1070.
11. An international parentage and identification panel for the domestic cat (Felis catus) / M. J. Lipinski [et al.] // Anim Genet., 2007. - V. 38(4). - P. 371-377.
12. Lyons, L. A. Genetic testing in domestic cats / L. A. Lyons // Molecular and Cellular Probes, 2012. -mcp.2012.
Поступила в редакцию: 01.11.2016 E-mail: [email protected]
Zyat'kov Sergey A., Goncharenko Grigory G.
doi:10.1016 / j.mcp.2012.04.004.
016 / i.mcp.2l
MICROSATELLITE LOCI IN THE GENETIC FINGERPRINTING OF SPECIES AND BREEDS OF DOMESTIC CATS FELIS CATUSL.
This article describes the genome of the domestic cat Felis catus. The forensic genotyping panel of 10 dinucleotide STR loci (power of discrimination 10-10) and 11 tetranucleotide STR loci (power of discrimination 10"6-10"8) for F. catus was characterized.
Keywords: Microsatellites, Felis catus, STR-locus, primers, identification panel.
