Научная статья на тему 'МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ'

МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
76
14
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ЛЕНТИВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ / ТРАНСДУКЦИЯ / ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ / РЕКОМБИНАЦИЯ / МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Набережнов Денис Сергеевич

Лентивирусные векторы широко используются в молекулярной биологии для доставки генов в эукариотические клетки с целью получения модифицированных клеточных линий. Начиная с 2000-х годов применения лентивирусных векторов их основные преимущества и недостатки были хорошо описаны. Преимуществами лентивирусных векторов являются простота получения высокого вирусного титра, способность трансдуцировать делящиеся и неделящиеся клетки и возможность псевдотипирования. К недостаткам лентивирусных векторов относят относительно небольшую длину вставки, которая может быть упакована, а также, в некоторых случаях, неспецифическую интеграцию вирусной кДНК в геном клетки. В статье описано новое свойство лентивирусных векторов - смена матрицы вирусной обратной транскриптазой на участке вирусного генома, содержащего повторы из нескольких нуклеотидов и, как следствие этого, микросателлитная нестабильность этой области.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Набережнов Денис Сергеевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

MICROSATELLITE INSTABILITY OF LENTIVIRAL VECTORS

Lentiviral vectors are widely used in molecular biology to deliver genes to eukaryotic cells for to obtain modified cell lines. Since the early 2000s, scientists have use of lentiviral vectors. Their main advantages and disadvantages have been well described. Advantages of lentiviral vectors are the ease of obtaining a high viral titer, transduceable dividing and non-dividing cells and the possibility of pseudotyping. Disadvantages are relatively short length of DNA insert and thought the nonspecific integration of the viral cDNA into the cell genome. New property of lentiviral vectors is recombinogenic template switching in region of viral genome containing repeats of several nucleotides and as a result microsatellite instability of this region is describe.

Текст научной работы на тему «МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ»

Научная статья Original article УДК 577.214.6

МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ

MICROSATELLITE INSTABILITY OF LENTIVIRAL VECTORS

Набережнов Денис Сергеевич, кандидат биологических наук, Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта, Российской академии наук; г. Москва, nds.xvii@gmail.com

Naberezhnov Denis Sergeevich, PhD, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences; Moscow, nds.xvii@gmail.com

Аннотация. Лентивирусные векторы широко используются в молекулярной биологии для доставки генов в эукариотические клетки с целью получения модифицированных клеточных линий. Начиная с 2000-х годов применения лентивирусных векторов их основные преимущества и недостатки были хорошо описаны. Преимуществами лентивирусных векторов являются простота получения высокого вирусного титра, способность трансдуцировать делящиеся и неделящиеся клетки и возможность псевдотипирования. К недостаткам лентивирусных векторов относят относительно небольшую длину вставки, которая может быть упакована, а также, в некоторых случаях, неспецифическую интеграцию вирусной кДНК в

геном клетки. В статье описано новое свойство лентивирусных векторов -смена матрицы вирусной обратной транскриптазой на участке вирусного генома, содержащего повторы из нескольких нуклеотидов и, как следствие этого, микросателлитная нестабильность этой области.

Annotation. Lentiviral vectors are widely used in molecular biology to deliver genes to eukaryotic cells for to obtain modified cell lines. Since the early 2000s, scientists have use of lentiviral vectors. Their main advantages and disadvantages have been well described. Advantages of lentiviral vectors are the ease of obtaining a high viral titer, transduceable dividing and non-dividing cells and the possibility of pseudotyping. Disadvantages are relatively short length of DNA insert and thought the nonspecific integration of the viral cDNA into the cell genome. New property of lentiviral vectors is recombinogenic template switching in region of viral genome containing repeats of several nucleotides and as a result microsatellite instability of this region is describe.

Ключевые слова: лентивирусные векторы, трансдукция, обратная транскрипция, рекомбинация, микросателлитная нестабильность

Keywords: lentiviral vectors, transduction, reverse transcription, recombination, microsatellite instability

ВВЕДЕНИЕ

Ретровирусы, а именно вирус иммунодефицита человека, пожалуй, является наиболее используемым вирусом, применяющимся в биотехнологии, что связано не только с его способностью вызывать СПИД (хотя безусловно это тоже сыграло свою значительную роль так как способствовало его изучению), но и с рядом его особых свойств, делающих векторы на его основе очень удобной системой доставки генов в клетки млекопитающих. Векторы на основе ВИЧ (лентивирусные векторы) обладают способностью встраиваться в геном инфицированной клетки тем самым обеспечивая стабильную экспрессию находящихся в геноме вируса генов. Поверхностный белок вируса

gp120 легко заменяется на другие белки, что позволяет менять тропизм вируса и получать псевдотипы, специфичные к определенным клеткам и тканям, либо наоборот расширить тропизм вируса [1]. Эффективность трансдукции лентивирусными векторами очень велика и для большинства типов клеток составляет почти 100%, кроме того, вирус заражает клетки, находящиеся в любой стадии клеточного цикла, в том числе в G0 [2]. Лентивирусный вектор обладает умеренной иммуногенностью поэтому может быть использован для трансдукции клеток тканей организма [3]. Все перечисленные преимущества сделали лентивирусные векторы удобным инструментом получения клеточных линий млекопитающих, экспрессирующих требуемый разработчику белок.

Разработчиками было создано множество вариантов лентивирусных векторов из которых в настоящее время используются (self-inactivating, SIN) [4] лентивирусные векторы второго и третьего поколения [5].

Сборка лентивирусного вектора не представляет сложности и не отличается от молекулярного клонирования любой другой последовательности в плазмиду, но длина клонируемого участка ограничена примерно 7 т.п.о., причем эффективность сборки резко (в десятки и сотни раз) уменьшается с увеличением длины [6,7]. Еще одним ограничением вирусов на основе ВИЧ, является их генетическая нестабильность, связанная с неточностью работы обратной транскриптазы вируса и рекомбинацией между мРНК вируса [8]. По разным оценкам от 0,1 до 0,5% интегрирующихся в геном вирусов содержит хотя бы одну мутацию [9]. Также интеграция лентивируса неспецифична и происходит в любом месте геномной ДНК, что несущественно для культуры клеток, но может представлять опасность для целого организма так как может привести к злокачественной трансформации клеток.

В статье описано еще одно свойство лентивируснных векторов рекомбинация между цепями вирусного генома во время обратной транскрипции на участке содержащим повторы из нескольких нуклеотидов.

МЕТОДЫ

Культивирование клеточных линий. Клетки HEK293T культивировали в 24-луночных планшетах в среде DMEM (Панэко, Россия), с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки крови (Панэко, Россия) в инкубаторе при 37° C с 5% CO2.

Трансфекция. За 5 часов до трансфекции клеточную среду меняли. Клетки трансфицировали с использованием TurboFect (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с протоколом производителя. Лентивирусная плазмида и пакующие плазмиды были смешаны в отношении 1:1:1. Плазмидную ДНК для трансфекции выделяли при помощи набора Наборы Plasmid Miniprep (Evrogen, Россия) получали, в соответствии с протоколом производителя. Через двое суток среду меняли и добавляли среду с антибиотиком зеоцин для селекции в концентрации 100 мкг/мл.

Трансдукция. Клеточные стоки собирались на второй и третий день после трансфекции, после чего были профильтрованы через фильтр 0,22 мкм. Вирусные стоки добавлялись к клеткам HEK293T, с 80% конфлюэнтностью.

Проточная цитометрия. Клетки отделяли от поверхности 24-луночного планшета при помощи раствора 0,25% трипсина (Панэко, Россия) и раствора Версена (Панэко, Россия), промывали и ресуспендировали в растворе Дюльбекко (Панэко, Россия). Образцы анализировали с использованием проточного цитометра FACSCalibur (BD, США), используя канал FL1 и FL2. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Flowing Software 2. Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изменение длины микросателлитных повторов - эффект

проявляющийся в клетке при нарушении системы репарации [10], смещение цепей при синтезе комплементарной цепи ДНК-полимеразой [11] и во время ПЦР [12]. Для изучения изменения длины микросателлитных повторов в лентивирусный вектор, содержащий слитные через пептид Т2А флуоресцентные белки ZsGreen1 и mCherry были клонированы повторы CA10, CAзl, GC20 и GGGT8 между флуоресцентными белками таким образом, что вставка этих повторов сдвигает рамку считывания белка mCherry и он не экспрессируется (рис. 1). Если на месте повтора во время обратной транскрипции лентивируса произойдет изменение длины повтора, то с вероятностью 1/3 это приведет к восстановлению экспрессии белка mCherry. В качестве контроля использовался вектор без вставки с белком mCherry, находящимся вне рамки считывания.

Рисунок 1. Экспрессионная кассета, использованная для изучения изменения длины микросателлитов в лентивирусах.

Плазмидами векторами, содержащие повторы и контрольным вектором без повтора трансфецировались клетки ^№093^ Аналогично лентивирусными векторами, содержащие повторы и контрольным вектором без повтора трансдуцировалась клеточная линия HEK293T после чего клетки исследовались при помощи проточной цитометрии (рис. 2).

Рисунок 2. Дот-плот распределения клеток по уровню флуоресценции зеленого цвета (Zsgreen) и красного цвета (mCherry), а) клетки трансдуцированные контрольным вектором без повтора, б) клетки трансдуцированные вектором с повтором CA31.

В клетках трансдуцированных плазмидными векторами флуоресценция красного белка mCherry не наблюдалась. В клетках трансдуцированных лентивирусными векторами, содержащими повторами уровень флуоресценции белка mCherry составлял 19% для CA10, 23% для CA31, 31% для GC20 и 25% для GGGT8 (рис. 2, а), в то время как для лентивирусного вектора не содержащего повторы флуоресценция белка mCherry не наблюдалась (рис. 2, б). Такой результат говорит о том, смена матрицы происходит каждый раз, когда обратная транскриптаза лентивируса начинает синтезировать повтор. Таким частота рекомбинации на участке микросателлита составляет около 100% в то время как для неповторяющейся последовательности лентивируса такая частота составляет 0,001% (1 рекомбинация на 1 т.п.о.) [13]. Механизм в данном случае, по-видимому, отличен от механизма проскальзывания и заключается в эффективном смене матрицы.

Таким образом при использовании повторов в лентивирусных векторах необходимо учитывать их микросателлитную нестабильность.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-34-60031.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Литература

1. Joglekar A.V., Sandoval S. Pseudotyped Lentiviral Vectors: One Vector, Many Guises // Hum Gene Ther Methods. 2017. Vol. 28, № 6. P. 291-301.

2. Yamashita M., Emerman M. Retroviral infection of non-dividing cells: old and new perspectives // Virology. 2006. Vol. 344, № 1. P. 88-93.

3. Annoni A. et al. Modulation of immune responses in lentiviral vector-mediated gene transfer // Cell Immunol. 2019. Vol. 342. P. 103802.

4. Zufferey R. et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery // J Virol. 1998. Vol. 72, № 12. P. 9873-9880.

5. T D. et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system // Journal of virology. J Virol, 1998. Vol. 72, № 11.

6. Kumar M. et al. Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors // Hum Gene Ther. 2001. Vol. 12, № 15. P. 1893-1905.

7. Sweeney N.P., Vink C.A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre // Mol Ther Methods Clin Dev. 2021. Vol. 21. P. 574-584.

8. Onafuwa-Nuga A., Telesnitsky A. The remarkable frequency of human immunodeficiency virus type 1 genetic recombination // Microbiol Mol Biol Rev. 2009. Vol. 73, № 3. P. 451-480, Table of Contents.

9. Laakso M.M., Sutton R.E. Replicative fidelity of lentiviral vectors produced by transient transfection // Virology. 2006. Vol. 348, № 2. P. 406-417.

10. Schoniger S., Ruschoff J. Mismatch Repair Deficiency and Microsatellite

Instability: 3 // Encyclopedia. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2022. Vol. 2, № 3. P. 1559-1576.

11. Castillo-Lizardo M., Henneke G., Viguera E. Replication slippage of the thermophilic DNA polymerases B and D from the Euryarchaeota Pyrococcus abyssi // Front Microbiol. 2014. Vol. 5. P. 403.

12. Brookes C. et al. Characterising stutter in forensic STR multiplexes // Forensic Sci Int Genet. 2012. Vol. 6, № 1. P. 58-63.

13. Chen J., Powell D., Hu W.-S. High frequency of genetic recombination is a common feature of primate lentivirus replication // J Virol. 2006. Vol. 80, № 19. P. 9651-9658.

References

1. Joglekar A.V., Sandoval S. Pseudotyped Lentiviral Vectors: One Vector, Many Guises // Hum Gene Ther Methods. 2017. Vol. 28, № 6. P. 291-301.

2. Yamashita M., Emerman M. Retroviral infection of non-dividing cells: old and new perspectives // Virology. 2006. Vol. 344, № 1. P. 88-93.

3. Annoni A. et al. Modulation of immune responses in lentiviral vector-mediated gene transfer // Cell Immunol. 2019. Vol. 342. P. 103802.

4. Zufferey R. et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery // J Virol. 1998. Vol. 72, № 12. P. 9873-9880.

5. T D. et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system // Journal of virology. J Virol, 1998. Vol. 72, № 11.

6. Kumar M. et al. Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors // Hum Gene Ther. 2001. Vol. 12, № 15. P. 1893-1905.

7. Sweeney N.P., Vink C.A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre // Mol Ther Methods Clin Dev. 2021. Vol. 21. P. 574-584.

8. Onafuwa-Nuga A., Telesnitsky A. The remarkable frequency of human immunodeficiency virus type 1 genetic recombination // Microbiol Mol Biol Rev. 2009. Vol. 73, № 3. P. 451-480, Table of Contents.

9. Laakso M.M., Sutton R.E. Replicative fidelity of lentiviral vectors produced by transient transfection // Virology. 2006. Vol. 348, № 2. P. 406-417.

10. Schoniger S., Ruschoff J. Mismatch Repair Deficiency and Microsatellite Instability: 3 // Encyclopedia. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2022. Vol. 2, № 3. P. 1559-1576.

11. Castillo-Lizardo M., Henneke G., Viguera E. Replication slippage of the thermophilic DNA polymerases B and D from the Euryarchaeota Pyrococcus abyssi // Front Microbiol. 2014. Vol. 5. P. 403.

12. Brookes C. et al. Characterising stutter in forensic STR multiplexes // Forensic Sci Int Genet. 2012. Vol. 6, № 1. P. 58-63.

13. Chen J., Powell D., Hu W.-S. High frequency of genetic recombination is a common feature of primate lentivirus replication // J Virol. 2006. Vol. 80, № 19. P. 9651-9658.

© Набережнов Д. С., 2023 Международный журнал прикладных наук и технологий "Integral" №1/2023

Для цитирования: Набережнов Д. С. МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ// Международный журнал прикладных наук и технологий "Integral" №1/2023

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.