Научная статья на тему 'Микроразмножение перспективных сортов черешни (Prunus aviumL. ) в условиях in vitro'

Микроразмножение перспективных сортов черешни (Prunus aviumL. ) в условиях in vitro Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
299
94
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Корзина Н. В.

Выявлен морфогенетический потенциал органов и тканей черешни с разными сроками созревания плодов. Определены оптимальные концентрации регуляторов роста в питательной среде, активизирующие процесс побегообразования и ризогенеза микропобегов в условиях in vitro.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Micropropagation of perspective sweet cherry (Prunus avium L.) varieties in conditions in vitro

The researches results of sweet cherry organs and tissues, free from pathogens have been given in

Текст научной работы на тему «Микроразмножение перспективных сортов черешни (Prunus aviumL. ) в условиях in vitro»

культур / Под ред. Е.Н. Седова, Т.П. Огольцовой. - Орел: ВНИИСПК, 1999. - 608 с.

7. Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур / Под ред. Е.Н. Седова. - Орел: ВНИИСПК, 1995. - 503 с.

8. Рябов И.Н. Сортоизучение и первичное сортоиспытание косточковых плодовых культур в Государственном Никитском ботаническом саду // Сотроизучение косточковых плодовых культур на юге СССР. - М.: Колос, 1969. - Т. XLI. - С. 5-83.

9. Смыков В.К. Интенсификация селекции и ускорение внедрения новых сортов плодовых культур // Труды Никит. ботан. сада. - Ялта, 1989. - Т. 107. - С. 6-15.

10. Смыков В.К., Смыков А.В. Мобилизация исходного материала для селекции плодовых культур // Труды Никит. ботан. сада. - Ялта, 2004. - Т. 122. - С. 6-8.

11. Список сортов растений, занесенных в Государственный реестр, пригодных для распространения в Украине и рекомендованных для выращивания в Автономной Республике Крым на 2008-2009 годы. - Симферополь, 2008. - 32 с.

МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ СОРТОВ ЧЕРЕШНИ (PRUNUS

AVIUML.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Н.В. КОРЗИНА Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Начало изучению изолированных органов и тканей черешни (Prunus avium L.) в условиях in vitro было положено Tukey в 40-х годах прошлого столетия [20]. Для выведения раносозревающих сортов были проведены опыты с культурой зародышей персика и черешни. На протяжении последующих десятилетий создание новых сортов являлось ведущим направлением биотехнологических исследований косточковых плодовых культур.

В настоящее время в связи с высокой степенью поражения вирусной, бактериальной и грибной инфекцией промышленных насаждений методы биотехнологии активно применяют для получения оздоровленного ценного посадочного материала [3, 5-7, 11]. Так, разными авторами указывается высокая степень поражения сортов черешни (30-90%), едва вступившие в полное плодоношение сады становятся нерентабельными. В частности, в Крыму на черешне обнаружены вирусы некротической кольцевой пятнистости листьев (PNRSV), скручивания листьев черешни (CLRV), мозаики резухи (AMV), хлоротической кольцевой пятнистости листьев (ClRSV) [3-5, 11]. В связи с тем, что вирусы являются облигатными внутриклеточными патогенами растений, прямая борьба с ними практически невозможна. В последние годы исследования по оздоровлению растений интенсивно проводятся в Никитском ботаническом саду-Национальном научном центре [3, 7]. В наших исследованиях, несмотря на использование в опытах отобранных со здоровых растений эксплантов, при их культивировании применялись профилактические мероприятия от патогенов -вводились в питательную среду вироциды.

Получение в условиях in vitro растений является актуальным для видов с низкой способностью к побегообразованию и, в особенности, к ризогенезу. Из литературных источников известно, что черешня относится к трудноразмножаемым культурам. В процессе клонального микроразмножения отмечена низкая способность формирования микропобегов и развития корней [1, 8, 9, 15, 16, 18, 19]. Поэтому, несмотря на имеющиеся экспериментальные работы, многие вопросы культивирования черешни до сих пор остаются малоизученными. Цель данной работы - выявить морфогенетический

потенциал органов и тканей разных генотипов черешни в культуре in vitro и получить полноценные регенеранты.

Объекты и методы исследования

Объектом исследования являлись сорта черешни (Призерша, Рубиновая Ранняя, Сказка, Талисман и Анонс) разных сроков созревания плодов. При постановке опытов применяли как общеизвестные методы, так и разработанные в отделе биотехнологии и биохимии растений НБС-ННЦ [2, 8, 10]. Отбор черенков осуществлялся с внешне здоровых и предварительно протестированных на отсутствие вирусов деревьев в зимний (декабрь - февраль), весенний (март, апрель), летний (июнь, август) и осенний (ноябрь) периоды. Тестирование проводили с использованием растений-индикаторов: Chenopodium foetidum Schrad., Nicotiana glutinosa L., Nicotiana tabacum L. ('Samsun'), Cucumis sativus L. ('Delikatess') и методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для освобождения растительного материала от экзогенной бактериальной и грибной инфекций в качестве стерилизующих агентов применяли растворы этанола и гипохлорита натрия. Для гарантии получения здоровых регенерантов в качестве профилактики в питательную среду вводили вироцид - рибовирин в концентрации 1-3 мг/л. Микропобеги культивировали на питательных средах Gamborg и Eveleigh (В5) [14], Murashige и Skoog (MS) [17] и в наших модификациях. Для индукции множественного побегообразования и ризогенеза в питательную среду вводили регуляторы роста: 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрациях 1,0-4,4 мкМ, К6-(2-изопентил)аденин (2ip) -1,97-3,94 мкМ, гибберелловая кислота (ГК3) - 0,15-2,89 мкМ, Р-3-индолилмасляная кислота (ИМК) - 2,46-7,35 мкМ, а-нафтилуксусная кислота (НУК) - 5,37-10,74 мкМ, индолилуксусная кислота (ИУК) - 2,85-5,71 мкМ. Пробирки с микропобегами помещали в культуральную комнату с заданным режимом (интенсивность освещения 2,0-2,5 клк, 16 часовой фотопериод и температура 24±1°С). Статистическую обработку данных проводили на компьютере с использованием программного обеспечения Microsoft Office Exel 2003.

Результаты и обсуждение

В работе с культурой тканей и органов черешни использовали сортообразцы, свободные от вирусной инфекции, предварительно протестированные на отсутствие вирусов с применением методов травянистых растений-индикаторов. Для введения эксплантов в условия in vitro были отработаны режимы стерилизации с применением разных концентрациий гипохлорита натрия и установлено, что почки сортов раннего и раннесреднего сроков созревания плодов (Призерша и Рубиновая Ранняя) наиболее чувствительны к действию стерилизующего агента. Менее повреждались почки сортов Талисман и Сказка.

Для успешной регенерации микропобегов важное значение имеют приемы изолирования первичных эксплантов. Показано, что активно развиваются экспланты всех изучаемых сортов черешни, у которых при введении в стерильные условия на питательные среды MS и В5 срез в базальной (нижней) части проведен под углом 40-45°. В этом случае отмечено появление зачатков листьев через 4 суток культивирования in vitro, в то время как микропобеги с ровным срезом в базальной части только увеличились в размерах (рис. 1).

Отличия в развитии сохраняются на протяжении последующих 1 -2 пассажей: у микропобегов в опытном варианте листья сформированы и увеличились в размерах, в то время как в контрольном варианте (с ровным срезом в базальной части) листовые пластинки еще полностью не раскрыты (рис. 2).

Для снятия апикального доминирования и индукции множественного побегообразования были испытаны регуляторы роста БАП (1,0-4,4 мкМ), 2ip (1,97-3,94 мкМ) и ГК3 (0,15-2,89 мкМ) в разных концентрациях и сочетаниях. Показано, что

экспланты черешни сортов Призерша, Рубиновая Ранняя и Анонс, введенные в условия in vitro, на питательной среде, дополненной 2ip и ГК3, незначительно увеличиваются в размерах и темнеют, при этом на среде с добавлением БАП и ГК3 у эксплантов формируются зеленые листья.

а баб

Рис. 1. Микропобеги черешни через 4 суток культивирования: а - со срезом в базальной части под углом 40-45°; б - с ровным срезом в базальной

части

а б

Рис. 2. Микропобеги черешни через 40 суток культивирования: а - со срезом в базальной части под углом 40-45°; б - с ровным срезом в базальной

части

На этапе собственно микроразмножения высоким морфогенетическим потенциалом обладали микропобеги сортов среднего и позднесреднего сроков созревания плодов (Сказка и Талисман). Формирование конгломератов микропобегов отмечали через 25-30 суток культивирования на модифицированной питательной среде МС, дополненной 1,04,4 мкм БАП и 0,44-2,88 мкМ ГК3. Как показали исследования, коэффициент размножения микропобегов сортов Сказка, Талисман и Анонс (1:16-1:20) был выше, чем у сортов Призерша и Рубиновая Ранняя раннего и раннесреднего сроков созревания плодов (1:1-1:4) (рис. 3).

Заключительным этапом микроразмножения in vitro является укоренение полученных микропобегов. Для индукции ризогенеза были испытаны как агаризированные, так и жидкие питательные среды, которые являлись модификациями среды MS с уменьшенным вдвое содержанием макросолей, дополненные регуляторами роста ауксинового ряда.

Успешное укоренение микропобегов происходило на питательных средах, содержащих 2,85-5,7 мкМ ИУК и 5,37-10,7 мкМ НУК соответственно.

« q

с

о

а: с> "S

о ^

о ю о с о

а:

О

аз ■

q о

а:

20 18 16 14 12 |jo 8 6 4 2 0

1

2

6

7

3 4 5

номер пассажа

Рис. 3. Влияние генотипа на коэффициент размножения микропобегов черешни

Присутствие в среде ИМК ускоряло появление корней у микропобегов на 4-6 суток по сравнению с контрольным вариантом, однако полученные регенераты не развивались в нестерильнык условиях. Показано, что у микропобегов черешни сорта Сказка корни формировались как на жидкой, так и на агаризированной питательный средах. Однако на среде с агаром корни были многочисленные, в то время как на жидкой среде развилось не более 3-4 корней на микропобег (рис. 4).

а б

Рис. 4. Развитие корней у микропобегов черешни: а - на жидкой питательной среде; б - на агаризованной питательной среде

В ходе опытов наблюдали явление спонтанного ризогенеза у микропобегов сорта Сказка на питательной среде, не содержащей регуляторов роста ауксинового ряда. Из базальной части регенерантов развились тонкие корни (1-3 шт/микропобег), при этом на них формировались корни второго порядка. Подобное явление не характерно для древесных культур и некоторыми авторами объясняется как накопление эндогенных ауксинов в растительных тканях в результате их длительного культивирования (рис. 5).

Полученные регенеранты с развитыми корнями высаживали в стерильный субстрат (смесь торфа, перлита, песка в разных соотношениях) для адаптации в условия in vivo.

Рис. 5. Спонтанный ризогенез у микропобегов черешни

Выводы

Показано, что лучшее развитие и дифференциацию первичных эксплантов черешни наблюдали в том случае, когда срез в базальной части проведен под углом 40-45°С. Установлено, что микропобеги сортов среднего (Сказка) и среднепозднего (Талисман) сроков созревания плодов обладали более высоким морфогенетическим потенциалом, чем микропобеги сортов с ранним (Призерша), раннесредним (Рубиновая Ранняя) и поздним (Анонс) сроками созревания плодов. Определены регуляторы роста и их концентрации, повышающие эффективность микроразмножения и индукцию корнеобразования. Получены полноценные регенеранты сортов черешни.

Список литературы

1. Бленда А.В. Мкроклональне розмноження in vitro представниюв пщродини Prunoidae // Физиология и биохимия культурных растений. - 2000. - Т. 32, № 5. - С. 428-434.

2. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. - М.: Наука, 1964. - 272 с.

3. Биотехнологические системы оздоровления косточковых плодовых культур и получение безвирусного посадочного материала / Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Чирков С.Н., Смыков А.В., Вожегова Р.А. // Фактори експериментально'1 еволюцп органiзмiв: Зб. наук. пр. / Укр. т-во генетиюв i селекцiонерiв iм. М.1. Вавилова. - К.: Логос, 2008. - Т. 5. -2008. - С. 410-415.

4. Вердеревская Т.Д., Маринеску В.Г. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда. - Кишинев: Штиинца, 1985. - 311 с.

5. Вирусы, поражающие косточковые плодовые культуры, и биотехнологиеские пути создания устойчивых форм / Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Митрофанова И.В., Кузнецова Н.В. // Бюресурси та вiруси: V Мiж. конф., 10-13 вересня 2007. - К., 2007. - С. 182.

6. Высоцкий В.А. Культура изолированных тканей и органов плодовых растений, оздоровление и клональное микроразмножение // С.-х. биология. -1983. - № 7. - С. 42-47.

7. Изучение вирусов и вирусных болезней косточковых плодовых культур на юге Украины и особенности оздоровления растений in vitro / Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Ежов В.Н., Лесникова-Седошенко Н.П., Лукичева Л.А., Смыков А.В., Сенин В.В., Литвинова Т.В. // Бюл. Никит. ботан. сада. - 2005. - Вып. 91 - С. 111-120.

8. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. - К.: Наукова думка, 1992. - 232 с.

9. Кузнецова Н.В. Влияние регуляторов роста на эффективность регенерации растений при клональном микроразмножении черешни (Prunus avium L.) // Бюл. Никит. ботан. сада. - 2008. - Вып. 97. - С. 52-55.

10. Методы биотехнологии в селекции и размножении субтропических и плодовых культур / Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Смыков А.В., Лесникова Н.П. // Труды Никит. ботан. сада. - 1999. - Т. 118. - С. 188-189.

11. Митрофанова О.В., Михайлов А.П., Чехов А.В. Биотехнологические аспекты освобождения от вирусов и клонального микроразмножения некоторых экономически важных многолетних культур // Труды Никит. ботан. сада - 1997. - Т. 119. - С. 7-34.

12. Митрофанова О.В., Митрофанова И.В. Состояние и перспективы биотехнологических исследований садовых культур на юге Украины // Садiвництво: Мжвщомчий тематичний науковий збiрник. - 2000. - Вип. 50. - С. 269-281.

13. Фомина Е.Г., Жук Н.Г. Клональное микроразмножение районированных в Беларуси сортов Cerasus // Плодоводство. - 1994. - Т. 9. - С. 64-74.

14. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. - 1968. - V. 46, № 5. - Р. 417-421.

15. Gregor Osters, Luthar Zlata, Stampak Franci. The importance of the sterilization proceducing vigorous cherry plants (Prunus sp.) in vitro // Acta agriculturae slovenica - 2004. -V. 83. - P. 45-51.

16. Kuznetsova N.V., Mitrofanova O.V Investigation of regeneration ability of four cultivars of sweet cherry (Prunus avium L.) in conditions in vitro // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: IX междунар. конф. Звенигород, 8-12 сентября 2008 г. -Звенигород, 2008. - С. 60.

17. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15, № 3. - P. 473-497.

18. Sauer Annemarie. In vitro - Vermehrung verschiedener genotypen von Prunus avium L. // Gartenbauwissenschaft. - 1983. - Bd. 48. - S. 124-127.

19. Snir Iona. In vitro micropropagation of sweet cherry cultivars // HortScience. - 1982.

- V. 17, № 2. - P. 735-736.

20. Tukey H.B. Embryo abortion in early-riponing varieties of Prunus avium // Bot. Gaz.

- 1933. - V. 94. - P. 433-468.

АЙВА ЗВИЧАЙНА (CYDONIA OBLONGA MILL.) В Л1СОСТЕПУ УКРА1НИ: П1ДСУМКИ ШТРОДУКЦП I СЕЛЕКЦП

С.В. КЛИМЕНКО, доктор бюлог1чних наук Нацюнальний боташчний сад iм. М.М. Гришка НАН Украши, Кшв

Вступ

Айва звичайна (Cydonia oblonga Mill.) - визнана сировина для одержання желюючих продукпв, завдяки високому вмюту пектинових речовин - природних сорбешив [2, 13]. Плоди айви полiвiтамiннi [18, 22]. Айва звичайна - основна карликова пщщепа для грушi [19].

Айву культивують бшьш шж у 40 крашах св^у, однак насадження п у бшьшосп краш невелию [26]. ФАО не публшуе даних про виробництво плодiв у крашах св^у [1]. Питома вага айви в Укрш'ш серед зерняткових культур за площами насаджень складае 0,33%. Щодо валових зборiв, то за 1995-2005 рр. айва в структурi садiв зерняткових становить 0,42%. Урожайшсть айви в крш'ш становить 100-250 ц/га залежно вщ ^матичних умов вирощування, сортових i агротехшчних властивостей. Зараз айву вирощують переважно у приватних господарствах. Вона займае близько 1000 га, або

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.