CC BY
1УДК 543.25:543.8
Микроконцентрирование в создании электрохимических сенсоров и биосенсоров для определения органических соединений
Г. К. Будников, Г. А. Евтюгин
ГЕРМАН КОНСТАНТИНОВИЧ БУДНИКОВ — доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой аналитической химии Казанского государственного университета. Область научных интересов: электрохимические методы анализа, химические и биохимические сенсоры. E-mail Herman.Budnikov@ksu.ru
ГЕННАДИЙ АРТУРОВИЧ ЕВТЮГИН — доктор химических наук, профессор кафедры аналитической химии Казанского государственного университета. Область научных интересов: биоэлектрохимические методы анализа. E-mail Gennady.Evtugyn@ksu.ru
420008 Казань, ул. Кремлевская, д. 18, Химический институт им. A.M. Бутлерова Казанского государственного университета, кафедра аналитической химии, тел. (8432)31-54-91.
Введение
Свойства химических и биохимических сенсоров во многом определяются процессами, протекающими на границе между преобразователем сигнала и анализируемой средой. Гетерогенный характер таких процессов традиционно считается недостатком химических сенсоров, поскольку диффузионное торможение сужает диапазон определяемых концентраций и завышает предел обнаружения по сравнению с аналогичными результатами, получаемыми в гомогенных процессах [1]. Тем не менее наличие границы раздела можно использовать для улучшения аналитических и операционных характеристик сенсоров, в том числе путем использования реакционной зоны вблизи активной поверхности датчика для избирательного накопления определяемого вещества.
Применительно к электрохимическим сенсорам микроконцентрирование как часть протокола измерения нашло наиболее полное выражение в инверсион-но-вольтамперометрических методах определения металлов [2]. В них в качестве сорбента выступает сам электрод — ртуть или графит, покрытый электроосаж-денной ртутью. Накопление в амальгаме происходит в результате катодного восстановления ионов металлов, аналитическим сигналом служит анодный ток их растворения. Селективность накопления и растворения, задаваемая выбором соответствующих рабочих потенциалов, дает возможность определять некоторые металлы на уровне мкг/л, что превосходит характеристики спектральных методов анализа.
В случае органических соединений универсальных рецептов понижения предела обнаружения с использованием поверхностных эффектов нет вследствие многообразия их электрохимических реакций. Изменить положение может модификация поверхности сенсора с помощью рецепторов искусственного и естественного происхождения, обеспечивающих избирательное связывание и «узнавание» определяемого органического субстрата в последующем электрохимическом процессе. Данный прием используют в электрокатализе [3], когда на электрод наносят катализатор, облегчающий перенос электрона. Эффективен он и в других вариантах электрохимического окисления/восстановления определяемых органических соединений [4].
Описаны различные подходы к модификации сенсоров с использованием в явном и неявном виде концентрирования определяемого соединения: применение молекулярных сит [5], ионообменных смол [6], синтез полимеров с порами, соответствующими размеру молекул определяемого соединения (молекулярный импринтинг [7]). Их объединяет то, что концентрирование выступает в качестве вспомогательного приема и не затрагивает функций самого сенсора. Присутствие модификатора проявляется в понижении предела обнаружения (наклона градуировочного графика) и повышении селективности сигнала, регистрируемого и в отсутствие сорбента.
В то же время возможности избирательного накопления определяемых веществ на поверхности сенсора шире. Как классический пример высокоселективного концентрирования можно рассматривать гетерогенный иммуноанализ, в котором в качестве сорбента выступают антитела, закрепленные на нерастворимом носителе или прямо на электроде [8]. Генерирование сигнала связано с образованием комплекса антиген-антитело. В отсутствие иммунной реакции антиген, как правило, не определяется.
В данной работе приведены примеры использования других рецепторов, реализующих принципы избирательного концентрирования и формирования аналитического сигнала в отношении широкого круга органических соединений биологического значения.
Гибридные ДНК-пероксидазные сенсоры
Нуклеиновые кислоты представляют собой уникальный «инструмент» для создании сенсоров вследствие многообразия механизмов связывания белков и низкомолекулярных соединений. К ним относятся электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженным фосфатным остовом, специфическое связывание с нуклеотидами вблизи поверхности спирали ДНК, включение низкомолекулярных соединений внутрь дуплекса между парами комплементарных оснований (интеркалирование) [8, 9]. Основное внимание при создании ДНК-сенсоров уделяется обнаружению характеристических олигонуклеотидов, взаимодействующих с комплементарными нуклеотидными последовательностями (так называемым ДНК-зондом) на поверхности преобразователя сигнала. Такие гибридные сенсоры в перспективе найдут применение
Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2005, т. ХЫХ, Ж» 2
для диагностики заболеваний, врожденных генетических дефектов, обнаружения генетически модифицированных компонентов в продуктах питания и т.д. [10]. Низкомолекулярные соединения (противораковые препараты, экотоксиканты и др.) не столь радикально меняют характеристики поверхности сенсора с сорбированными нуклеиновыми кислотами, поэтому регистрировать их присутствие сложнее.
Нами предложено применять с этой целью гибридные сенсоры, содержащие в поверхностном слое фермент пероксидазу и нуклеиновые кислоты [8]. В них используется маркер — производное фенотиазина (метиленовый синий, метиленовый зеленый), который способен взаимодействовать и с ДНК, и с пероксида-зой. При добавлении маркера в раствор совместно с пероксидом водорода генерируется биокаталитический ток, связанный с циклическим превращением маркера, как показано на примере метиленового синего ниже:
Пероксидаза АО
Рис. 1. Сигнал ДНК-пероксидазного сенсора в присутствии маркера — метиленового синего:
1 — перенос маркера из раствора и его концентрирование на поверхности электрода в реакции с ДНК;
2 — пероксидазное окисление маркера; 3 — регенерация маркера на катоде, сопровождающаяся генерированием катодного биокаталитического тока
Маркеры также способны связываться с дуплексом ДНК либо за счет электростатических взаимодействий, либо путем интеркалирования (включения между парами нуклеиновых оснований). В зависимости от характера взаимодействия меняется реакционная способность маркера в пероксидазном и электрохимическом превращении.
Вещества, реагирующие с ДНК, меняют характер ее взаимодействия с маркером, что влияет на скорость его пероксидазного окисления и генерируемый биокаталитический ток. Так, сульфонамидные препараты (сульфаметоксазол, сульфатиазол и др.) вытесняют фенотиазины с поверхности спирали ДНК, что приводит к снижению поверхностной концентрации маркеров. В результате уменьшается сигнал биосенсора пропорционально концентрации сульфонамида. В случае метиленового зеленого это наблюдается в микромолярном диапазоне содержаний сульфонамидов, а в случае метиленового синего, типичного интеркаля-
тора, — при наномолярных их концентрациях. Это можно использовать для группового определения остаточных количеств сульфонамидов в биологических жидкостях [11]. Общая схема формирования сигнала ДНК-пероксидазного сенсора представлена на рис. 1.
Антрациклиновые препараты (доксорубицин, ру-бомицин) сами являются интеркаляторами, они вытесняют из спирали ДНК интеркалированную форму маркера, недоступную для фермента. В результате увеличивается концентрация свободной активной формы метиленового синего, и сигнал ДНК-пероксидазного сенсора увеличивается. Аналитические характеристики лекарственных препаратов, полученные с помощью ДНК-пероксидазного сенсора, приведены в таблице. Реакцию пероксидазного окисления фенотиазинов можно также использовать для количественного определения содержания нативной ДНК (после сорбцион-ного переноса на поверхность электрода), количественной характеристики генотоксических факторов
Таблица
Аналитические характеристики лекарственных препаратов, полученные с помощью ДНК-пероксидазного сенсора
Препарат Метиленовый синий Метиленовый зеленый
Предел обнаружения, нМ Диапазон определяемых концентраций, нМ Предел обнаружения, мкМ Диапазон определяемых концентраций, мкМ
Сульфаметоксазол 0,002 0,005-0,2 0,02 0,2-10
Сульфадиазин 0,1 0,1-1,0 0,01 0,2-8
Сульфаметазин 0,01 0,02-2 0,02 0,2-8
Сульфагуанидин 0,1 0,1-10 0,1 0,5-7
Доксорубицин 80 100-1500 - -
Рубомицин 50 100-1350 - -
(температурная денатурация, действие экстремальных рН и мутагенов) и антиоксидантной активности.
Каликсарены как модификаторы графитовых электродов
Каликсарены и их тиоаналоги образуют комплексы «гость—хозяин» с катионами металлов, а в случае функционализации — и с органическими соединениями, взаимодействующими с функциональными группами заместителей верхнего и нижнего обода [12]. Поэтому каликсаре-новую платформу часто используют в составе искусственных рецепторов.
Удобной матрицей для включения каликс-аренов в состав химических сенсоров служит полианилин, способный за счет электростатических и донорно-акцепторных взаимодействий удерживать каликсарены с сульфонатными, кар-боксилатными, амино- и пиридиниевыми группами, обеспечивая при этом регулярность строения поверхностного слоя и воспроизводимость характеристик распознавания. Так, графитовые электроды, покрытые полианилином и тетрасульфонатным производным каликс[4]резорцинарена*, позволяют селективно определять промазин и хлорпромазин. Как и в случае ДНК-пероксидазного сенсора, сигналом сенсора служил ток восстановления окисленной формы лекарственного препарата, который накапливается в слое ка-ликсарена и далее окисляется в пероксидазной реакции (рис. 2). Важно, что образование комплекса «гость—хозяин» не мешает биохимическому превращению фенотиазинового фрагмента, отделенного от катионного центра тремя метиленовыми группами. В присутствии комплексообразователей наблюдается закономерное увеличение сигнала восстановления окисленной формы лекарственных препаратов по сравнению с сигналом, получаемым с использованием немодифицированного сенсора. Также наблюдается снижение мешающего влияния электрохимически активных примесей, присутствующих в биологических жидкостях и лекарственных формах — аскорбиновой и мочевой (2,6,8-триоксипурин) кислотах и др.
По сравнению с ДНК как сорбционной матрицей слой полианилина обладает электропроводностью, что снижает перенапряжение окисления определяемых соединений и увеличивает биокаталитический ток по сравнению с током, регистрируемым при прямом окислении промазина или хлорпромазина на немоди-фицированном электроде. Кроме того, промазин и хлорпромазин, сорбированные в полианилине в присутствии каликсрезорцинаренов, могут включаться в электронный перенос электрона с электрода на активный центр пероксидазы, что приводит при добавлении пероксида водорода к генерированию биокаталитического тока.
Включение в состав 1,3-дизамещенных по нижнему ободу каликс[4]аренов амино-, амидо-, карбокси-латных групп позволяет получить синтетические рецепторы, с высокой эффективностью связывающие
Рис. 2. Схема пероксвдазного сенсора с тетрасульфонатным производным метилкаликс[4]резорцинарена, включенным в состав полианилинового покрытия, для определения хлорпромазина
карбоновые и дикарбоновые кислоты, окси- и аминокислоты Г131 **:
^Ви
^Ви
О Я
—СН2—СООН —СН2—ЫН2 —СН2—СН2—МН-СООН
Их включение в состав полианилинового покрытия позволило создать химический сенсор с потен циомет-рическим откликом на органические кислоты. В щелочной среде пиридинсодержащий каликс[4]арен образует нейтральный комплекс с оксалат-ионом. Реакция сопровождается переносом ионов водорода от полианилина, что приводит к изменению заряда поверхностного слоя и потенциала сенсора. Варьируя природу заместителей, можно получить селективные сигналы на глицин, глутаминовую и бензойную кислоты. Потен циометрические сенсоры на основе графитовых электродов, модицифицированных полианилином и каликс[4]аренами, позволяют проводить определение 0,1—10 мМ органических кислот, определению не мешают 100 и 1000-кратные избытки неорга-
* Каликсрезорцинарены синтезированы в Институте органической и физической химии им. А. Е. Арбузова КНЦ РАН и предоставлены для исследования д.х.н. Э. X. Казаковой.
** 1,3-Дизамещенные каликсарены синтезированы на кафедре органической химии Казанского государственного университета под рук. чл-корр. РАН И. С. Антипина и акад. РАН А. И. Коновалова.
Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2005, т. XL IX, № 2
нических анионов, а также ацетатов и формиатов. Помимо пленочных электродов, сходные показатели селективности и пределы обнаружения показывают угольно-пастовые электроды с каликсаренами и комплексами «гость—хозяин», включенными в состав материала электрода.
Заключение
Включение синтетических (каликсарены) и природных (нуклеиновые кислоты) рецепторов в состав электрохимических сенсоров на основе графитовых материалов позволяют значительно разнообразить их свойства. Повышение поверхностной концентрации определяемых соединений и их вовлечение в сопряженные химические и биохимические реакции расширяют спектр определяемых соединений и задают характер регистрируемого сигнала. Способ модификации и влияние электрохимического концентрирования достаточно гибко регулируются путем подбора режима нанесения покрытия (электрополимеризация, сорбци-онное осаждение) и структуры самого рецептора. Это подразумевает общий протокол изготовления чувствительных поверхностных слоев и измерения сигнала. В перспективе открывается возможность создания гибкой системы контроля состава сложных матриц с использованием химических и электрохимических сенсоров сходного дизайна и управления. Развитие подходов к направленной регуляции характеристик подобных сенсоров несомненно будет способствовать их использованию в решении конкретных аналитических задач.
Исследования проводили при поддержке РФФИ (проекты 03-03-32492-а и 04-03-97511-р^офи) и CRDF (REC-007).
ЛИТЕРАТУРА
1. Coulet P.R. Scientific Computing Automation Ed. E.J. Karja-lainen. (Europe), Elsevier, 1991, Chapter 19, p. 221—236.
2. Brainina Kh. /.. Malakhova N.A., Stojko N. Yu. Fresenius J. Anal. Chem., 2000, v. 368, p. 307-325.
3. Golabi S.M., Zare H.R., Hamehloo M. Microchem. J., 2001, v. 69, p. 111-121.
4. Lawrence N., Beckett E.L, Davis J., Compton R.G. Anal. Biochem., 2002, v. 303, p. 1-16.
5. Martineiii G., Carotta M.C., Ferroni M., Sadaoka Y., Traversa E. Sensors Actuatore B, 1999, v. 55, p. 99-110.
6. Lu T.-H., Sun l.-W. Talanta, 2000, v. 53, p. 443-451.
7. Martin-Esteban A. Fresenius J. Anal. Chem., 2001, v. 370, p. 795-802.
8. Methods in Molecular Biology. DNA—Protein Interactions. Tatowa, New Jersey: Humana Press, 2001, 636 p.
9. Mascini M., Palchetti L, Marrazza G. Fresenius J. Anal. Chem., 2001, v. 369, p. 15-22.
10. Yang M., McGovern M.E., Tompson M. Anal. Chim. Acta, 1997, v. 346, p. 259-275.
11. Будников Т.К., Евтюгин Г.А., Тольдфарб О.Э. Наукоемкие технологии, 2004, т. 56, с. 30—37.
12. Asfani /.. Böhmer V., Harrowfleld J., Vicens J., Saadioui M. Calixarenes 2001, Dordrecht: Kluwer Academic Press, 2001, 683 p.
13. Stoikova E.E., Evtugyn G.A., Beljakova S.V. e. a. J. Inclusion Phenomena, 2001, v. 39, p. 339-346.
