CC BY
63
УДК 579.61
У.М. Немченко 1, C.M. Попкова 1, Е.л. Горбунова 2, И.В. Петрова 2 , Е.Б. Ракова 1, Е.И. Иванова 1,
Н.М. Шабанова 1, м.В. Савелькаева 2
МикроэкологичЕский пейзаж кишечного биоценоза у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта
1 Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр проблем здоровья семьи
и репродукции человека Сибирского отделения РАМН (Иркутск)
2 Клиника Учреждения Российской академии медицинских наук Научного центра проблем здоровья
семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН (Иркутск)
В работе проводилось изучение видовой структуры энтеробактерий в кишечном биоценозе детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта на фоне анализа плотности бифидобактерий и. их антагонистической активности. При. функциональных нарушениях желудочнокишечного тракта отмечена высокая, частота индикации УПМ семейства Enterobacteriacea на фоне дефицита бифидобактерий и. лактобацилл.
Ключевые слова: функциональные нарушения желудочно-кишечного тракта, бифидобактерии, лактобациллы, энтеробактерии
MicRoEcoLoGicAL picture of intestinal BiocENosis iN children wiTH functional disorders of gastrointestinal tract
U.M. Nemchenko 1, S.M. Popkova 1, E.L. Gorbunova 2, I.V. Petrova 2, E.B. Rakova 1,
E.I. Ivanova 1, N.M. Shabanova 1, M.V. Savelkaeva 2
Scientific Center of Family Health Problems and Human Reproduction SB RAMS, Irkutsk Clinics of Scientific Center of Family Health Problems and Human Reproduction SB RAMS, Irkutsk
The article was conducted, to study the species structure of enterobacteria in the intestinal ecosystem, of children with functional disorders of gastrointestinal tract on the background, of analysis of the bacterial density and their antagonistic activity. High frequency of display of conditionally pathogenic enterobacteria of the family Enterobacteriacea at the background, of deficiency of bifidobacteria and. lactobacilli in children, with gastrointestinal functional disorders is detected.
Key words: functional disorders of gastrointestinal tract, bifidobacteria, lactobacilli, enterobacteria
К функциональным относятся состояния желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), заключающиеся в несовершенстве моторной функции (физиологический гастро-эзофагальный рефлюкс, нарушение аккомодации желудка и антропилорической моторики, дискинезии тонкой и толстой кишки) [16]. Функциональные нарушения моторики (дискинезии) могут быть единственным проявлением патологии, но чаще сопровождаются нарушением других функций ЖКТ: нарушениями секреции, переваривания (мальдигестия), всасывания (ма-льабсорбция), состояния микрофлоры (дисбиоз), активности иммунной системы. Прогрессирование одного функционального расстройства неизбежно приводит к нарушению всех остальных функций ЖКТ. Значительное местное влияние на состояние моторики ЖКТ оказывает микрофлора. Деятельность микроорганизмов, населяющих кишечник, приводит к увеличению объема каловых масс, газообразованию, снижению порога чувствительности миоцитов, стимуляции выработки холецистокинина и др. Помимо этого, бактерии вырабатывают огромное количество различных веществ, так или иначе воздействующих на моторику. Это такие медиаторы, как гистамин, серотонин, ГАМК, циклические АМФ и ГМФ, токсины и пептиды, бактериальные метаболиты желчных кислот, короткоцепочечные жирные кислоты и др.
[15]. Нарушение состава кишечной микрофлоры, т.е. дисбиоз, приводит к изменению спектра продуцируемых ею метаболитов, в том числе и КЦЖК [1]. Это оказывает негативное влияние на работу кишечника, особенно, на его моторику. Однако существует и обратная связь. Нарушения моторики ЖКТ приводят к изменению внутренней среды кишки, нарушению переваривания и всасывания, что отрицательно сказывается на состоянии микрофлоры. Дисбиоз и дискинезии ЖКТ поддерживают развитие друг друга, при этом нарушения моторики ЖКТ могут быть как следствием, так и причиной развития дисбиоза.
Нормальная же микрофлора кишечника играет важнейшую роль в обеспечении здоровья людей различных возрастных групп. Дисбиоз кишечника в настоящее время определяют как «клинико-лабораторный синдром, связанный с изменением качественного и/или количественного состава нор-мофлоры определенного биотопа, транслокацией различных ее представителей в несвойственные ей биотопы, метаболическими и иммунными нарушениями, сопровождающимися у части пациентов клиническими симптомами» [3, 6, 13]. По современным представлениям, дисбиоз кишечника самостоятельной нозологической формой не является из-за отсутствия специфического возбудителя и типичной периодичности процесса и представляет
собой совокупность синдромов, объединенных причинно-следственной связью [2, 7, 11].
До 90 — 95 % микробов в толстой кишке составляют анаэробы (бифидобактерии и бактероиды), и только 5 — 10 % всех бактерий приходится на строгую аэробную и факультативно анаэробную флору (молочнокислые и кишечные палочки, энтерококки, стафилококки, грибы, протей). Основные симбионты кишечника обладают выраженными антагонистическими свойствами и в условиях нормально функционирующего кишечника способны подавлять рост оппортунистических микроорганизмов [4, 8, 9, 10].
Цель работы — изучить видовую структуру энтеробактерий в кишечном биоценозе детей с функциональными нарушениями ЖКТ на фоне анализа плотности бифидобактерий и их антагонистической активности.
материалы и методы
Объектом исследования явилась группа детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта (моторной и секреторной), состоящая из 60 человек, проживающих в г. Иркутске. Обследованные дети были разделены на три возрастные группы: 1-я группа — дети до 1 года; 2-я группа — от 1 года до 7 лет; 3-я группа — от 7 до 16 лет.
Исследование микробиоценоза толстой кишки осуществляли в лаборатории микроэкологии Института эпидемиологии и микробиологии в 2008 — 2009 гг. в соответствии с рекомендациями Министерства здравоохранения РФ и методических пособий с использованием актуальных справочных материалов [5, 11, 14].
Бактериологическое исследование качественного и количественного состава содержимого кишечника проводили по методикам Р.В. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанского в модификации Б.А. Ефимова, В.М. Коршунова и др. (1991, 2002). Для выявления и подсчета бифидобактерий, лактобацилл, эшерихий, стафилококков, грибов рода Candida, клостридий использовали селективные питательные среды (тиогликолевую, Эндо, ЖСА, Сабуро, Вильсон — Блер). Грамположительные анаэробные стрептококки и бифидобактерии изучали бактериоскопическим методом после культивирования на тиогликолевой среде. Для выделения условно-патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae использовали среды Симмонса,
Левина, Плоскирева, висмут-сульфитный агар. Все посевы инкубировали в термостате при 37 °С в течение 24 часов. Через указанные сроки инкубирования проводили подсчет выросших колоний, выделение чистых культур и идентификацию. Видовую диагностику условно-патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, родов Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Morganella проводили с помощью коммерческих идентификационных тест-систем («PLIVA-Lachema Diagnostika»,Чехия), а также классическим методом биохимического тестирования.
результаты исследования
При анализе микрофлоры кишечника 60 детей (с рождения до 16 лет), имеющих функциональные нарушения ЖКТ, установлено, что практически у всех выявлялись отклонения в составе микроорганизмов кишечной микробиоты относительно общефизиологических нормативов. Представители условно-патогенной микрофлоры выделялись во всех возрастных группах практически в равных процентных соотношениях (табл. 1; рис. 1, 2) .
В группе детей до 1 года изменение состава облигатной микрофлоры проявлялось снижением количества бифидобактерий — у 70 ± 10,2 % обследованных, кишечной палочки с типичными свойствами — у 60 ± 10,9 %, регистрацией эшерихий со сниженными ферментативными свойствами — у 65 ± 10,7 %, гемолизирующей E. coli — у 5,0 ± 4,9 %. Плотность лактобацилл находилась в пределах нормы. У 65 ± 10,7 % обследованных обнаруживалась K. pneumonia, у 45 ± 11,1 % — C. freundii. Кроме этого, в 15 ± 5,8 % регистрировались ассоциации клебсиелл и цитробактер.
Анализ облигатной микрофлоры в группе детей от 1 года до 7 лет показал снижение количества бифидобактерий у 100 % обследованных, лактобацилл — у 85 ± 7,9 %, кишечной палочки с типичными свойствами — у 85 ± 7,9 % случаев, наличие слабоферментативной E. coli — у 35 ± 10,7 % обследованных детей. Кроме того, в данной группе отмечались случаи выделения кишечной палочки с гемолитической активностью (5 ± 4,9 %). УПМ семейства Enterobacteriaceae были представлены K. pneumoniae — в 15 ± 5,8 % случаев, C. freundii — в 55 ± 11,1 %, E. cloacae — в 20 ± 8,9 %. Ассоциации клебсиелл и цитробактер, равно как и цитробактер
Таблица 1
Содержание бифидобактерий и лактобацилл в разных возрастных группах у детей с функциональными нарушениями ЖКТ
Группы 1 группа 2 группа 3 группа
(до 1 года) (> 1-7 лет) (> 7-16 лет)
3 1 1 2 О п = 20 п = 20
Диапазон % лиц с Диапазон % лиц с Диапазон % лиц с
Наименование^ колич-х значении дефицитным колич-х значений дефицитным колич-х значений дефицитным
микроорганизма^^ 10 n содержанием 10 n содержанием 10 n содержанием
Бифидобактерии 106-1010 70 ± 10,2 106-108 100 106-108 100
Лактобациллы 106-108 0 106-108 85 ± 7,9 0 О) 1 0 СО 80 ± 8,9
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
rW
/w
/w
/w
/XX
/XX
/XX
- /XX -/XX /XX /XX /XX /XX
- ЛЛ '. 7
/XX J /XX J /XX J /XX J /XX J /XX J
“ 'ЇХХ і /XX J /XX J /XX J /XX J /XX J /XX J
" 'ЇХХ і /XX J /XX J /XX J /XX J /XX J /XX J
" 'ЇХХ і /XX J /XX J /XX J /XX J /XX J
Группа 1
Группа 2
Группа 3
UE. coli с нормальной ферментативной активностью HE. coli слабо-ферментативная
ME. coli лактозонегативная
BE. ^liгемолитическая
Рис. 1. Характеристика E. coli у детей разных возрастных групп.
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
□ Citrobacter freundii
□ Klebsiella pneumoniae
■ Enterobacter cloacae
Ш Klebsiella pn. + Citrobacter fr.
□ Klebsiella pn. + Enterobacter cl.
■ Citrobacter fr. + Enterobacter cl.
Группа 1
Группа 2
Группа 3
рис. 2. Частота встречаемости видов УПМ в разных возрастных группах.
и энтеробактер, во 2-й группе регистрировались редко — у 5 ± 4,9 % обследованных.
У всех детей 7—16 лет наблюдали снижение титров бифидобактерий в 100 % случаев, лактобацилл
— в 80 ± 8,9 %. Ситуация по кишечной палочке в 3-й группе была практически такая же, как в 1-й и 2-й группах: нормальная кишечная палочка выделялась в 65 ± 10,7 %, слабоферментативная — в 40 ± 10,9 % случаев. Наличия гемолитической кишечной палочки в 3-й группе не наблюдалось. В данной группе были изолированы: C. freundii (25 ± 9,9 %), K. pneumoniae (50 ± 11,2 %). Ассоциация клебсиелл и цитробактер в 3-й группе регистрировалась в 10 ± 6,7 % случаев (табл. 1; рис. 1, 2).
Анализ данных по выделяемости условно-патогенной микрофлоры в зависимости от содержания бифидобактерий показал, что УПМ регистрируют-
ся чаще на фоне дефицитного содержании бифидобактерий (рис. 3). Так как во второй и третьей группе дефицит бифидобактерий наблюдался в 100 % случаев, для анализа данных они были объединены в одну группу (n = 40). K. pneumoniae в 1-й группе выделялась в 30 ± 10,2 % случаев, а у детей от 1 года до 16 лет (2-я, 3-я группы) — в 22,5 ± 6,6 %; C. freundii у детей до 1 года встречался в 25 ± 9,9 % случаев, у детей от 1 года до 16 лет процент выделения составил 30 ± 7,2 %. E. cloacae выделялся только у детей от 1 года до 16 лет (7,5 ± 4,2 %).
При дефиците бифидобактерий выявлены ассоциации энтеробактерий: клебсиелл и цитробактер в 1-й группе у 15 ± 5,8 % лиц, во 2-й и 3-й группах — у 7,5 ± 4,2 %; цитробактер и энтеробактер
— только у детей от 1 года до 16 лет — в 2,5 ± 2,5 % случаев (2-я, 3-я группы).
рис. 3. Выделение УПМ на фоне дефицитного содержания бифидобактерий.
Однако обращают на себя внимание случаи выделения УПМ в диагностических титрах у детей первой группы при физиологичном содержании бифидобактерий (K. pneumoniae у 25 ± 9,9 %, C. freundii — у 5 ± 4,9 %). Во 2-й и 3-й группе условно-патогенная флора при нормальном содержании бифидобактерий не выделялась.
заключение
Анализ полученных данных показал, что у обследованных детей всех трех возрастных групп с функциональными нарушениями ЖКТ выявлены дисбиотические изменения в кишечной микробиоте. Уменьшение плотности бифидобактерий и лактобацилл чаще наблюдалось у детей от года до 16 лет. Снижение количества типичной E. coli и регистрация её слабоферментативных вариантов в равной мере характерны для всех возрастных групп. Из представителей УПМ семейства Enterobacteriaceae в первых рейтинговых рядах регистрировались K. pneumoniae и C. freundii. Кроме того, при дефицитном содержании бифидобактерий отмечено увеличение частоты выделения УПМ (K. pneumoniae — 30 % случаев в 1-й группе; 22,5 %
— во 2-й, 3-й группах; C. freundii — в 1-й группе у 25 %, во 2-й, 3-й группах — у 30 % обследованных) и появление видовых ассоциаций энтеробактерий, что свидетельствует о снижении колонизационной резистентности.
При физиологичном содержании бифидобактерий представители условно-патогенной микрофлоры выделялись у части обследованных детей в диагностически значимых количествах (K. pneumonia — 25 ± 9,9 %, C. freundii — 5 ± 4,9 % случаев у детей 1-й группы). Таким образом, результаты исследования, во-первых, подтверждают ключевую роль бифидобактерий в системе колонизационной резистентности, во-вторых, свидетельствуют об
увеличении дефицита индигенной микрофлоры с возрастом детей: снижение плотности бифидобактерий в 100 %, лактобацилл — в 80 % случаев во 2-й и 3-й возрастных группах.
Выделяемость условно-патогенной микрофлоры при физиологичном содержании бифидобактерий свидетельствует о низкой антагонистической активности аутоштаммов бифидобактерий (рис. 4).
Ранее в исследованиях in vitro мы показали, что до 70 % аутоштаммов бифидобактерий, выделенных из копрологических проб детей, проживающих в г. Иркутске, имеют низкую антагонистической активностью к эталонному штамму S. aureus. Еще большее их количество обладает пониженной антагонистической активностью по отношению к аутоштаммам
S. aureus [12]. Был сделан вывод о том, что данное обстоятельство является особенностью микробной экологии детей, проживающих в экологически неблагоприятных условиях Восточной Сибири (рис. 4).
□ 1 02 ш3
□ 9%,
Ш 71%
20%
1 - высокая а.а. (> 10 мм)
2 - пониженная а.а. (< 10 мм)
3 - низкая а.а. (< 5 мм)
рис. 4. Антагонистическая активность аутоштаммов бифидобактерий (182 шт.) к S. Aureus: а.а. - антагонистическая активность.
Высокий процент лиц с низкой, относительно общефизиологических стандартов, плотностью бифидобактерий и лактобацилл в кишечном биотопе, возможно, свидетельствует о наличии региональных микроэкологических особенностей населения г. Иркутска, которые должны быть выражены в виде региональных ориентиров.
литература
1. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Иконников Н.С. «Дисбактериоз» кишечника: понятие, диагностические подходы и пути коррекции. Возможности и преимущества биохимического исследования кала. — М., 2004. — 57 с.
2. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 145 с.
3. Воробьева А.А. Дисбактериозы у детей. — М.: КМК Лтд, 1998. — 129 с.
4. Голубева И.В. Энтеробактерии. — М.: Медицина, 1985. — 138 с.
5. Диагностика, профилактика и лечение дисбактериозов кишечника: Метод. рек. — М., 1991. — 15 с.
6. Копанев Ю.А., Соколов А.Л. Дисбактериоз кишечника: микробиологические, иммунологические и клинические аспекты микроэкологических нарушений у детей. — М., 2002. — 148 с.
7. Леванова Л.А. Состояние нормальной микрофлоры кишечника у детей дошкольного возраста, проживающих в экологически неблагополучном районе // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2002. — № 1. — С. 64 — 68.
8. Мавзютов А.Р. Факторы патогенности оппортунистических энтеробактерий и их роль в
развитии диареи // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2007. — № 1. — С. 89 — 97.
9. Медицинская микробиология: учеб. для студ. вузов / под ред. А.М. Королюка. — СПб., 1999. —
Ч. 1. - 272 с.
10. Медицинская микробиология: учебное пособие / под ред. В.И. Покровского; 4-е изд. испр. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 786 с.
11. Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие. клиническая микробиология. Бактериологические исследования. Микологические исследования. Паразитологические исследования. Инфекционная иммунодиагностика. Молекулярные исследования в диагностике инфекционных заболеваний / под ред. В.В. Меньшикова. — М.: Лабора, 2009. — Т. 3. — С. 71 — 141.
12. Микробная экология человека в промышленных городах Восточной Сибири / С.М. Попкова, С.И. Лещук, У.М. Немченко [и др.] // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. — 2004. — № 1, Т. 3. — С. 143—146.
13. Минушкин О.Н. Дисбактериоз кишечника // Рос. мед. журнал. — 1999. — № 3. — С. 40 — 45.
14. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» // ОСТ 91500.11.0004-2003. Приказ МЗ РФ № 231 от 09.06.2003.
15. Эволюционные и сравнительно-физиологические аспекты микрофлоры // В кн.: Микрофлора пищеварительного тракта (под редакцией А.И. Хавкина) — М.: Фонд социальной педиатрии. — 2006. — С. 18 — 28.
16. Leung A.K., Lemau J.F. Infantile colik: A review / J. R. Soc. Health. — 2004. — Vol. 124 (4). — P. 162.
сведения об авторах
Немченко Ульяна Михайловна - младший научный сотрудник лаборатории микроэкологии УРАМН НЦ проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
Попкова София Марковна - доктор биологических наук, руководитель лаборатории микроэкологии УРАМН НЦ проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН (664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16; тел.: 8 (3952) 33-34-41; e-mail: smpopkova@gmail.com)
Горбунова Елена Леонидовна - врач-педиатр высшей категории, гастроэнтеролог клиники УРАМН НЦ проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
Петрова Ирина Викторовна - врач аллерголог-иммунолог высшей категории клиники УРАМН НЦ проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
Ракова Елена Борисовна - научный сотрудник лаборатории микроэкологии УРАМН НЦ проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
Иванова Елена Иннокентьевна - младший научный сотрудник лаборатории микроэкологии УРАМН НЦ проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
Шабанова Наталья Михайловна - младший научный сотрудник лаборатории микроэкологии УРАМН НЦ проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
Савелькаева Марина Владимировна - врач-педиатр высшей категории, заведующая гастроэнтерологическим отделением клиники УРАМН НЦ проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
