CC BY
14
DOI 10.31588/2413-4201-1883-244-4-232-23 7
УДК 636.09:620.1:602,42
МИКРОБНЫЙ ФОН И КОНЦЕНТРАЦИЯ ВОДОРОДНЫХ ИОНОВ НАТИВНОГО
ЦЕОЛИТА
Чернов А.Н. - д.б.н., зав. отделом животноводства и ветеринарии, гл.н.с., Афордоаньи Д.М. - к.б.н., научный сотрудник, Халилуллина Г.Р. - м.н.с., Газизов Р.Р. - к.с.-х.н, заместитель руководителя
Татарский НИИАХП ФГБУН «Казанский научный центр Российской академии наук»
Ключевые слова: природные цеолиты, грибы продуценты микотоксинов, концентрация водородных ионов, биологическая безопасность
Keywords: natural zeolites, fungi producing mycotoxins, concentration of hydrogen ions, biological safety
Минеральные вещества, являются незаменимыми веществами и должны поступать в организм животных в определенных количествах. Объем потребления природных агроминералов у диких животных в естественных условиях колеблется, и может достигать у некоторых видов за раз до 5 % от массы тела [1].
Микробная популяция зависит от различных условий в окружающей среде. В естественных условиях микроорганизмы растут, обеспечивая питательными веществами свои потребности [2, 3].
Биологическая безопасность агро-минералов является важным звеном в кормлении животных. Грибы как сапрофи-ты участвуют в деградации органических веществ, выделяя внеклеточные ферменты для роста растений. Сапрофитные грибы составляют самую большую группу почвенных микробных сообществ, но патогенные грибы оказывают наиболее разрушительное воздействие на урожайность сельскохозяйственных культур и могут влиять на здоровье животных, и поэтому необходим контроль за ними [5, 8, 14, 15].
Фитопатогенам, по сравнению с патогенными биологическими агентами животных, уделено больше исследований по секвенированию генома. Природный цеолит, как и красная глина эффективно сорбирует металлы, поглощает РЬ, Cd и Zn [4, 6, 9]. За способности повышать рН почвы и антимикробные свойства агроминералы нашли применение в сельскохозяйственном земледелии [11, 12]. Эффект прорас-
тания растений различных видов, где применяли агроминералы, показали замечательные результаты [13].
Применение синтетического цеолита для микробной фильтрации и антимикробного действия было продемонстрировано в большинстве научных публикаций. Интересны исследования противогрибковых свойств цеолита фаужазита с серебром на бактерии и изоляты грибов [7]. Известно, что цеолит поглощает бактериальные клетки в зависимости от рН за счет поверхностной гидрофобности бактериальной клетки [10].
Экологизация, биологическая безопасность в области сельского хозяйства остается очень важным аспектом развития любого государства. Расширение сфер использования нативных агроминералов, в частности цеолита, в животноводстве требует их изучения.
Цель исследования - определить микробный фон и концентрацию водородных ионов нативного цеолита.
Материал и методы исследований. Использованные в исследованиях пробы и оборудование: пять растений с участка добычи природного цеолита, на-тивный (неактивированный) цеолит, шей-кер-инкубатор (Biosan ES-20, Орбитальный шейкер-инкубатор). Определяли КОЕ бактерий и грибов на корнях растений с использованием среды LB агар. Для определения наличий грибов и бактерий в на-тивном цеолите и на корнях растений был использован метод качественной ПЦР
Нативный цеолит и корни растений переносили в ступку с жидким азотом и перемалывали стерильным пестиком до состояния гомогенного порошка, постоянно приливая жидкий азот для охлаждения. Порцию перемолотой массы весом 100 мг переносили в пробирку эппендорф объемом 2 мл, содержащую 1 мл раствора 2 % бромида гексадекатриметиламмониума, 100 Мм Tris-HCl (рН 8.0), 1.4 М NaCl и 20 Мм EDTA, поставленные ООО «Компания Хеликон» (Москва, РФ), и инкубировали при 60 °C в течение 20 минут. К смеси приливали 500 мкл хлороформа (ЗАО «База №1 Химреактивов», Москва, РФ) и перемешивали переворачиванием в течение 1 минуты. Для разделения фаз пробирки центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 минут. Верхнюю фазу объемом 500 мкл отбирали в новую пробирку и приливали к ней 300 мкл (0,6 объема) изо-пропилового спирта. После перемешивания пробирки центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 минут. Осадки дважды промывали 70 % этанолом и высушивали. Далее осадки растворяли в 100 мкл буфера STE pH 8.0 с добавлением РНКазы (Thermo, США) в концентрации 2 мг/мл при 60 °C в течение 20 минут. Для дальнейшей очистки использовали набор Cleanup mini (ООО «Евроген», Москва, РФ) в соответствии с рекомендациями производителя. Для определения наличий грибов и бактерий в нативном цеолите и на корнях растений был использован метод качественной ПЦР В качестве мишени использовались последовательности гена ß-актина и рибозомалного гена 16S. Объем реакционной смеси составлял 20р1: 2р1 Taq буфер, 0.4 в концентрации 10мМ dNTP, 0.2р1 mix праймеров в концентрации 100 pmol/pl - к гену ß-актина, ACT 512-F (5' ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC 3') и ACT 783-R (5' TACGAGTCCTTCTGGCCCAT 3') (Carbone & Kohn, 1999); к гену Шбактерий, 27fm (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 ') and 1522R (5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3') [15], 0.4р1 Taq полемераза, 14р1 mQ H2O и 5р1 ДНК матрицы (в концентрации 1нг/мл). Условия амплификации: 1 цикл предварительной денатурации и активации полиме-
разы - 95 °C 10 мин; 40 циклов - денатурация 95 °C 15с, отжиг 55 °C 20 с, элонгация 72 °C 4 мин. Измерения флуоресценции проводились в конце каждого цикла отжига и в дополнительной точке на 80 °C (за 1 с), для детекции образовавшихся ди-меров праймеров в процессе амплификации. Анализ кривой плавления был сделан за счет повышения температуры от 65 до 95 °C ступенчато в 0.5 °C за 5 с в каждом цикле.
Изучали концентрацию водородных ионов нативного цеолита с разведением в дистиллированной воде в соотношении 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8 с периодом экспозиции 30 сек, 10 мин, 15 мин, 30 мин. Использовали: прибор Ph-метр Hanna edge (копании Hanna Instruments); дистиллированная вода рH - 6,9. Температура в ходе эксперимента не менялась и составляла 25 0С.
Результаты исследований. Пять растений были отобраны с участка добычи природного цеолита Дрожжановский район, Республика Татарстан, Россия (Рисунок 1). Далее определили колониеобразу-ющие единицы (КОЕ) бактерий и грибов. Для этого отобранные 200 мг образцы корня растений помещали в 10 мл стерильного фосфатного буферного раствора (PBS) и перемешивали в течение 10 минут в шейкер-инкубаторе. КОЕ бактерий и грибов определяли путем нанесения 100 мкл серийных разведений до 10-5 и 10-4 на чашки Петри с cредой LB агар. В чашечки с LB агаром для культивирования грибов добавляли цефтриаксонадо в концентрации до 100 мкг/мл, а для роста бактерий в концентрацию добавляли нистатин до 150 мкг/мл для предотвращения роста грибов. Контролем служила ростовая среда с LB агаром с внесением в него фосфатно-буферного раствора (Рисунок 2 а, б, в).
Нами установлено, что на всех чашках Петри грибкового роста грибов нет. С целью подтверждения полученных результатов нами проведены выделение ДНК и количественная ПЦР на присутствие бактерий и грибов в нативном цеолите.
Электрофорез фрагментов ДНК, полученных в ходе амплификации методом Box-PCR представлен на рисунке 3.
Рисунок 1 - Растения на месте добычи цеолита
Рисунок 2 - Среда с LB агаром а) контроль б) бактерии в) грибкового мицелия нет.
Рисунок 3 - Электрофорез фрагментов ДНК, полученных в ходе амплификации гена16Б (18) и гена Р-актин (9- 16). Дорожка М - маркеры молекулярной массы ДНК 100Ь (ЗАО «Евро-ген», Москва, РФ), дорожки 1, 9 - отрицательный контроль с водой, 2 -положительный контроль с бактериальной ДНК, дорожки 3, 4, 5, 11, 12,13 - ДНК из нативного цеолита, дорожки 6, 7, 8, 14, 15, 16 - ДНК из корней растений.
Электрофорез геля показывает наличие бактерий из ДНК, извлеченной из корней растений, выкорчеванных с места добычи цеолита из фрагмента 16S (1600п.н.) в положении 1500Ь.р. на рисунке 2, дорожки 6, 7, и 8, что также видно из положительного контроля с бактериальной ДНК. Бактериальные ДНК, выделенные из нативного цеолита (дорожки 3, 4, и 5), отсутствовали. Во всех образцах ДНК (до-
рожки 11, 12, 13, 14 и 16), выделенные из корней растений, так и из нативных цеолитов с места добычи, грибковая ДНК отсутствовала. Это видно по количественному ПЦР-фрагменту грибного ß-актина (дорожка 10), показанному в положении 200b.p. положительного контроля с ДНК Fusarium oxysporum. Исследования бактерий на корнях растений на КОЕ, представлены в таблице 1.
Таблица 1 - КОЕ культуры бактерий на корнях растений
Растения КОЕ
1 3,88х107
2 4,97х107
3 4,42х107
4 3,94х107
5 4,14х107
Как видно из таблицы КОЕ культуры бактерий на корнях растений колебались от минимального значения в первой отобранной пробе 3,88х107, до 4,97х107 у второй отобранной пробы, всего было вы-
делено 24 изолята бактерий. На следующем этапе провели исследования нативного цеолита, в соотношении с дистиллированной водой, с различным временем экспозиции (Таблица 2).
Таблица 2 - Концентрации водородных ионов в растворе нативного цеолита, в различных разведениях и времени экспозиции
Отношение цеолит : вода рН цеолитного раствора, в зависимости от времени
30 сек 10 мин 15 мин 30 мин
1:1 8,50 8,51 8,51 8,48
1:2 8,74 8,55 8,61 8,64
1:4 8,88 8,84 8,76 8,76
1:6 9,00 9,04 9,00 8,87
1:8 9,04 9,02 9,00 8,91
Как видно из таблицы, рН раствора из нативного цеолита, в зависимости от времени была больше на 9 через 30 сек, 10 мин и 15 мин при соотношении цеолита с дистиллированной водой 1:6, и 1:8. При этом при соотношении 1:1 максимальная концентрация водородных ионов имела значение - 8,51.
Заключение. Биологическая безопасность агроминералов является важным звеном в кормлении животных. Сапрофитные грибы составляют самую большую группу почвенных микробных сообществ, но патогенные грибы оказывают наиболее разрушительное воздействие на урожайность сельскохозяйственных культур и мо-
гут влиять на здоровье животных. По результатам проведенных бактериологических исследований установлено, что в на-тивном цеолите отсутствуют грибы продуценты микотоксинов. С целью подтверждения проведенных исследований, использован метод качественной ПЦР для определения наличий грибов и бактерий в нативном цеолите и на корнях растений, который дал также отрицательный результат. Концентрация водородных ионов у нативного цеолита, в зависимости от времени была больше на 9 через 30 сек., 10 мин. и 15 мин., при соотношении цеолита с дистиллированной водой 1:6, и 1:8. При этом при соотношении 1:1 макси-
мальноя концентрация водородных ионов имела значение - 8,51. Таким образом, на-тивный цеолит не содержит микроскопических грибов, в том числе и грибов продуцентов микотоксинов, и при добавлении дистиллированной воды концентрация водородных ионов находится в значениях -8,48-9,04. Данные исследования будут продолжены.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Макарцев, Н.Г. Кормление сельскохозяйственных животных / Н.Г. Макар-цев. - Калуга: Издательство Ноосфера, 2017 - 460 с.
2. Равилов, А.З. Микробиологические среды / А.З. Равилов, Р.Я. Гильмут-динов, М.Ш. Хусаинов. - Казань: Издательство «Фэн». - 1999. - С. 168
3. Телишевская, А.Я. Белковые гид-ролизаты: получение, состав, применение / А.Я. Телишевская. - М.: Издательство «Россельхозакадемия». - 2000. - С.128.
4. Bertocchi, A.F., Red mud and fly ash for remediation of mine sites contaminated with As, Cd, Cu, Pb and Zn / A.F. Bertocchi, M. Ghiani, R. Peretti, A. Zucca // J. Hazard. Mater. - 2006. - V. 134. - С. 112-119.
5. Carbone, I.A Method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes / I. Carbone, L. M. Kohn // Mycologia. - 1999. - Т. 91. - №. 3. - С. 553556.
6. Castaldi, P. Heavy metal immobilization by chemical amendments in a polluted soil and influence on white lupin growth / P. Castaldi , L. Santona, P. Melis // Chemo-sphere. - 2005. - V. 60. - P. 365-371.
7. Ferreira, L. Antimicrobial activity of faujasite zeolites doped with silver / L. Ferreira, A. M. Fonseca, G. Botelho, C. Almeida-Aguiar, I.C. Neves // Microporous and Meso-porous Materials. - 2012. - V. 160. - P. 126132.
8. Gladieux, P. Fungal evolutionary genomics provides insight into the mechanisms of adaptive divergence in eukaryotes / P. Gladieux, J. Ropars, H. Badouin [et al.] // Molecular ecology. - 2014. - P. 753-773.
9. Gray, C.W. Fields evaluation of in situ remediation of a heavy metalcontaminat-ed soil using lime and red-mud / C.W. Gray, S.J. Dunham, P.G. Dennis [et al.] // Environ. Pollut. - 2006. - V. 142. - P. 530-539.
10. Kubota, M. Selective adsorption of bacterial cells onto zeolites / M. Kubota, T. Nakabayashi, Y. Matsumoto [et al.] // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 2008. -V. 64 - P. 88-97.
11. Lee, Y. J. Effect of pH on micro-bial hydrogen fermentation / Y.J. Lee, T. Mi-yahara, T. Noike // Journal of Chemical Technology & Biotechnology. - 2002. - P. 694-698
12. Passaglia, E. Zucchine e meloni su zeolitite, piu resa e meno concimazione / E. Passaglia, T. Bellarmi, A. Guidetti, F. Merlotti // L'Informatore Agrario. - 2005. - № 50, - P. 55-57.
13. Prisa, D. Germination Of Vegetable and Grassland species With Micronized chabazitic-Zeolites And Endophytic Fungi / D. Prisa // IOSR Journal Of Agriculture And Veterinary Science (IOSR-JAVS). E-ISSN. -2019. - P. 2319-2380.
14. Varnai A. Carbohydrate-binding modules of fungal cellulases: occurrence in nature, function, and relevance in industrial biomass conversion (Advances in applied microbiology) / A. Varnai, M R. Mäkelä, D.T. Djajadi [et al.] // Academic Press. - 2014. -T. 88. - P.103-165.
15. Weisburg, W.G. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study / W.G. Weisburg, SM. Barns, D.A. Pelletier, D.J. Lane // Journal of bacteriology. - 1991. -T. 173. - №. 2. - P. 697-703.
МИКРОБНЫЙ ФОН И КОНЦЕНТРАЦИЯ ВОДОРОДНЫХ ИОНОВ НАТИВНОГО
ЦЕОЛИТА
Чернов А.Н., Афордоаньи Д.М., Халиллуллина Г.Р., Газизов Р.Р.
Резюме
По результатам проведенных бактериологических исследований установлено, что в нативном цеолите отсутствуют грибы продуценты микотоксинов. КОЕ культуры бактерий на корнях растений колебались от минимального значения в первой отобранной пробе 3,88*107 до 4,97*107 во второй отобранной пробе, всего было выделено 24 изолята бактерий. С целью подтверждения проведенных исследований, использован метод качественной ПЦР для определения наличий грибов и бактерий в нативном цеолите и на корнях растений, который дал также отрицательный результат. Концентрация водородных ионов у нативного цеолита, в зависимости от времени, была больше на 9 через 30 сек., 10 мин. и 15 мин. при соотношении цеолита с дистиллированной водой 1:6, и 1:8. При этом при соотношении 1:1 максимальная концентрация водородных ионов имела значение - 8,51.
MICROBIAL BACKGROUND AND CONCENTRATION OF HYDROGEN IONS IN NATIVE
ZEOLITE
Chernov A.N., Afordoanyi D.M., Khalillullina G.R., Gazizov P.P.
Summary
Based on the results of bacteriological studies, it was found that native zeolite does not contain mycotoxin-producing fungi. CFU cultures of bacteria on plant roots ranged from a minimum value of 3.88*107 in the first sample to 4.97*107 in the second sample, a total of 24 bacterial isolates were isolated. In order to confirm the research, a qualitative PCR method was used to determine the presence of fungi and bacteria in native zeolite and on plant roots, which also gave a negative result. Hydrogen ion concentration. The concentration of hydrogen ions in native zeolite, depending on the time, was greater than 9 after 30 seconds, 10 minutes and 15 minutes at a ratio of zeolite to distilled water of 1:6 and 1:8. At a ratio of 1:1, the maximum concentration of hydrogen ions was 8.51.
