CC BY
131
Измерение оптической плотности растворов красителей показало, что в кислой среде происходит смещение максимума поглощения растворов в сторону более коротких длин волн, в щелочной же среде максимум поглощения почти не меняется. При значения pH 2 и 1 цвет растворов становится желтым. При увеличении значений pH (от 4 до 12) цвет - красный.
Таким образом, выделенные нами красители устойчивы в течение достаточного времени, цвет их стабилен в течение продолжительного кипячения, они устойчивы нейтральной и щелочной средах.
Список литературы:
1. Ходжиматов М. Дикорастущие лекарственные растения Таджикистана. - Душанбе, 1989. - С. 137-144.
2. Харламова O.A., Кафка Б.В. Натуральные пищевые красители. - М. Пищевая промышленность, 1979. - 120 с.
3. Спиричев В.Б., Шатнюк Л.Н. Обогащение пищевых продуктов мик-ронутриентами: современные медико-биологические аспекты // Пищевая промышленность. - 2002. - № 7. - С. 98-101.
4. Касьянов Г.И., Кизим И.Е., Холодцов М.А. Применение пряно-ароматических и лекарственных растений в пищевой промышленности // Пищевая промышленность. - 2000. - № 5. - С. 33-35.
5. Толкунова H.H., Чуева Е.Н., Бидюк А.Я. Влияние экстрактов лекарственных растений на развитие микроорганизмов // Пищевая промышленность. - 2002. - № 8. - С. 70-71.
МИКРОБНЫЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА КАК АНТИМИКРОБНЫЕ И АНТИАДГЕЗИВНЫЕ АГЕНТЫ © Конон А.Д.*, Скочко А.Б.*, Пирог Т.П.*
Национальный университет пищевых технологий, Украина, г. Киев
Установлено, что препараты поверхностно-активных веществ (ПАВ) Rhodococcus erythropolis ЭК-1 (0,92-1,44 мг/мл) и Acinetobacter calcoa-ceticus K-4 (0,15-0,22 мг/мл) в виде супернатанта культуральной жидкости проявляют антимикробное действие по отношению к ряду микроорганизмов (Bacillus subtilis БТ-2, Escherichia coli ИЭМ-1, Candida tropicalis ПБТ-5, Candida albicans Д-6, Candida utilis БВС-65). Не выяв-
* Ассистент кафедры Биотехнологии микробного синтеза, аспирант.
* Магистрант кафедры Биотехнологии микробного синтеза.
* Заведующий кафедрой Биотехнологии микробного синтеза, доктор биологических наук, профессор.
лено ингибирующего влияния препаратов ПАВ R. erythropolis ЭК-1 на клетки S. cerevisiae ОБ-3 и E. coli ИЭМ-1, а также антифунгального действия обоих исследуемых ПАВ на Aspergillus niger Р-3 и Fusarium culmorum Т-7. Установлено, что препараты ПАВ A. calcoaceticus K-4 (0,28 мг/мл) снижают количество прикрепленных клеток B. subtilis БТ-2 различного физиологического состояния на пластинках кафеля (на 41,3 %) и линолеума (82,4 %), E. coli ИЭМ-1 - на пластинках стали (41 %), пластика (15 %) и кафеля (14 %).
Поверхностно-активные вещества (ПАВ), или сурфактанты - это вещества, состоящие из двух функциональных частей: полярной с основной гидрофильной группой и неполярной - с гидрофобным остатком. Благодаря такому строению молекул растворы ПАВ могут снижать поверхностное и межфазное натяжение.
ПАВ микробного происхождения используются в нефтедобывающей, химической, фармацевтической, пищевой промышленности, сельском хозяйстве, а также для очистки окружающей среды от углеводородов, тяжелых металлов и других ксенобиотиков [1, 2].
В последнее время наблюдается усиление резистентности многих патогенных микроорганизмов к существующим лекарственным средствам, что обусловило поиск альтернативных препаратов. Такими потенциальными для использования в медицине могут быть микробные ПАВ, поскольку они нетоксичны, не вызывают аллергии, проявляют антимикробное действие в отношении широкого спектра микроорганизмов [3, 4]. Известно, что механизм антимикробного действия ПАВ основан на нарушении функций мембран клеток, что приводит к замедлению их роста или гибели. Кроме того, микробные ПАВ могут использоваться как антиадгезивные агенты, предотвращающие формирование биопленок на поверхностях различных материалов [5, 6], что может быть использовано в пищевой промышленности и медицине.
Цель данной работы - исследование антимикробных свойств и анти-адгезивной активности поверхностно-активных веществ Rhodococcus erythropolis ЭК-1 и Acinetobacter calcoaceticus K-4. Штаммы R. erythropolis ЭК-1 и A. calcoaceticus K-4 изолированы из загрязненных нефтью образцов почвы [7] и депонированы в Депозитарии микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии НАН Украины под номерами ИМВ Ас-5017 и ИМВ В-7241. В качестве препаратов ПАВ использовали стерильный супернатант культуральной жидкости.
Наши эксперименты показали, что количество живых клеток Candida tropicalis ПБТ-5 в присутствии препаратов ПАВ R. erythropolis ЭК-1 снижалось с повышением концентрации ПАВ и увеличением продолжительности обработки (табл. 1). Так, наиболее существенное снижение количества дрожжевых клеток наблюдалось при обработке суспензии препарата-
ми ПАВ в наиболее высокой из исследуемых концентраций (1,44 мг/мл) в течение 2 ч. (табл. 1). При таких условиях количество живых клеток C. tropicalis ПБТ-5 снижалось на 80 %.
Таблица 1
Изменение количества живых клеток C. tropicalis ПБТ-5 и C. albicans Д-6 в присутствии препаратов ПАВ R. erythropolis ЭК-1
Концентрация ПАВ в препарате, мг/мл C. tropicalis ПБТ-5 | C. albicans Д-6
Логарифм количества живых клеток через
1 ч. 2 ч. 1 ч. 2 ч.
0,61 8,2 ± 0,41 6,4 ± 0,32 5,6 ± 0,28 5,45 ± 0,29
0,92 6,3 ± 0,32 6,1 ± 0,30 5,4 ± 0,27 5,3 ± 0,25
1,44 5,9 ± 0,27 5,8 ± 0,29 5,5 ± 0,26 5,5 ± 0,26
Примечание: логарифм количества клеток в исходной суспензии составлял: C. tropicalis ПБТ-5 - 6,5 ± 0,32; C. albicans Д-6 - 5,85 ± 0,29.
На примере Candida albicans Д-6 было показано, что не всегда максимальные концентрации являются наиболее эффективными. Так, при внесении препарата ПАВ R. erythropolis ЭК-1 (0,92 мг/мл) выживание клеток составляло 26-33 %, ас увеличением концентрации ПАВ в препарате до 1,44 мг/мл увеличивалось до 44-47 % (табл. 1). Аналогично, под действием ПАВ A. calcoaceticus K-4 количество выживших дрожжевых клеток увеличивалось с 71 % до 89 % с повышением концентрации ПАВ в препаратах с 0,15 до 0,22 мг/мл (табл. 2). Полученные результаты можно объяснить взаимодействием ПАВ и клеток на молекулярном уровне и вспомнить принципы гомеопатии, согласно которым более разбавленные растворы являются более эффективными.
Таблица 2
Изменение количества живых клеток B. subtilis БТ-2 и C. albicans Д-6 в присутствии препаратов ПАВ A. calcoaceticus K-4
B. subtilis БТ-2 C. albicans Д-6
Концентрация ПАВ в препарате, мг/мл Логарифм количества живых клеток через
1 ч. 2 ч. 1 ч. 2 ч.
0,15 4,8 ± 0,24 4,4 ± 0,32 6,0 ± 0,30 5,35 ± 0,27
0,22 - - 5,6 ± 0,28 5,45 ± 0,26
Примечание: «-» - выживание 0 %; логарифм количества клеток в исходной суспензии составлял: B. subtilis БТ-2 - 6,6 ± 0,33; C. albicans Д-6 - 5,5 ± 0,28.
Отметим, что через 1 ч. после обработки суспензии клеток C. tropicalis ПБТ-5 и C. albicans Д-6 препаратами ПАВ R. erythropolis ЭК-1 (0,61 мг/мл) и A. calcoaceticus K-4 (0,15 мг/мл) соответственно наблюдали увеличение количества живых клеток (даже на порядки) с последующим резким снижением ко 2-му ч. экспозиции (табл. 1, 2). Мы считаем, что такой эффект
может быть обусловлен несколькими причинами: инерционным размножением культуры (поскольку использовали клетки с экспоненциальной фазы роста), наличием в супернатанте дополнительных питательных веществ и реакцией клеток на стрессовое воздействие.
Исследуемые препараты действовали на Candida utilis БВС-65 только через 2 ч. экспозиции. При внесении ПАВ A. calcoaceticus K-4 (0,22 мг/мл) количество дрожжевых клеток снижалось на 19 %, а препаратов R. erythro-polis ЭК-1 (1,4 мг/мл) - на 7 %.
Исследование зависимости выживания клеток B. subtilis БТ-2 от концентрации ПАВ R. erythropolis ЭК-1 и продолжительности обработки показало, что при концентрации ПАВ в препарате 0,98 мг/мл наблюдалась гибель более 90 % клеток уже через час экспозиции. При более низкой концентрации ПАВ (0,61 мг/мл) выживание клеток составляло 53-55 % независимо от длительности обработки. Более сильное антимикробное действие оказывали препараты ПАВ A. calcoaceticus K-4 (0,22 мг/мл), которые вызывали 100 % гибель клеток B. subtilis БТ-2 (табл. 2).
Последующие эксперименты показали, что препараты ПАВ R. erythropolis ЭК-1 (0,98-1,47 мг/мл) не проявляли антимикробного действия в отношении бактерий Escherichia coli ИЭМ-1, дрожжей Saccharomyces cerevisiae ОБ-3 и микромицетов (Aspergillus niger Р-3 и Fusarium culmorum Т-7). Вероятно, что для подавления роста этих микроорганизмов необходима более высокая концентрация ПАВ или более длительная обработка. ПАВ A. calcoaceticus K-4 оказались более эффективными и в концентрации 0,22 мг/мл снижали количество клеток E. coli ИЭМ-1 на 67 %, a S. cerevisiae ОБ-3 - на 48 %.
Показано, что препараты ПАВ A. calcoaceticus K-4 являются эффективными антиадгезивными агентами. Они снижали количество прикрепленных к линолеуму и кафелю клеток B. subtilis БТ-2 на 82,4 и 41,3 % соответственно (табл. 3). Также препараты ПАВ снижали адгезию E. coli ИЭМ-1 на стальные пластинки (на 41 %), пластик (15 %) и кафель (14 %). В тоже время в присутствии ПАВ увеличивалось количество прикрепленных к пластику клеток B. subtilis БТ-2 и к линолеуму - E. coli ИЭМ-1. Адгезии клеток бацилл на сталь не наблюдалось.
Таблица 3
Влияние препаратов ПАВ A. calcoaceticus K-4 на адгезию бактерий к различным материалам
Тест-культура Адгезия клеток (%), на
линолеум сталь пластик кафель
B. subtilis БТ-2 17,6 ± 0,9 - * 58,7 ± 2,9
E. coli ИЭМ-1 * 59 ± 2,9 85 ± 4,2 86 ± 4,3
Примечание: табл. 3 и 4: концентрация ПАВ в препарате - 0,28 мг/мл. «-» - адгезии на данный материал не наблюдалось; «*» - стимуляция адгезии на данный материал. Количество клеток в контрольной пробе (материал, обработанный дистиллированной водой вместо ПАВ) принимали за 100 %.
На примере B. suЫШs БТ-2 было показано, что антиадгезивная активность препаратов ПАВ A. calcoaceticus К-4 зависит от физиологического состояния тест-культур, причем споровые клетки адгезировались меньше (14,2 % на линолеуме, 54,2 % на кафеле), чем вегетативные (20,8 % на линолеуме, 61,3 % на кафеле) (табл. 4).
Таблица 4
Зависимость количества прикрепленных к некоторым материалам клеток В. 8аЫШ8 БТ-2 от их физиологического состояния
Время выращивания тест-культуры, г. Адгезия клеток (%), на
линолеум сталь пластик кафель
15 20,8 ± 1,0 - * 61,3 ± 3,1
72 14,2 ± 0,7 - * 54,2 ± 2,7
Так же, как и для суточной культуры, для спор и вегетативных клеток B. subtilis БТ-2 характерным было увеличение адгезии на пластиковую поверхность, а прикрепления на пластинки стали не происходило. Отличия в характере прикрепления клеток разного физиологического состояния, а также различных тест-культур может объясняться особенностями строения и химического состава клеточных оболочек и различными адаптационными реакциями этих микроорганизмов на стрессовые воздействия. Выяснению этих вопросов будут посвящены наши дальнейшие исследования.
Таким образом, в результате проведенной работы установлено, что поверхностно-активные вещества R. erythropolis ЭК-1 и A. calcoaceticus K-4 обладают антимикробными свойствами в отношении ряда микроорганизмов (C. tropicalis ПБТ-5, B. subtilis БТ-2, C. utilis БВС-65, S. cerevisiae ОБ-3, E. coli ИЭМ-1 и C.albicans Д-6), причем ПАВ A. calcoaceticus K-4 свойственен более широкий спектр действия, хотя в отношении некоторых культур данные препараты менее активны. Выживание клеток в присутствии препаратов ПАВ зависело от их концентрации и продолжительности экспозиции. Через 1-2 ч. обработки исследуемыми препаратами ПАВ R. erythropolis ЭК-1 (0,92-1,44 мг/мл) и A. calcoaceticus K-4 (0,15-0,22 мг/мл) наблюдалась гибель 100 % клеток B. subtilis БТ-2, 85 % - C. tropicalis ПБТ-5, 74 % - C. albicans Д-6, 67 % - E. coli ИЭМ-1, 48 % - S. cerevisiae ОБ-3 и 18 % - C. utilis БВС-65. Показано, что препараты ПАВ A. calcoaceticus K-4 (0,28 мг/мл) обладают антиадгезивной активностью и снижают количество прикрепленных к линолеуму и кафелю клеток B. subtilis БТ-2 различного физиологического состояния на 79,1-85,8 % и 38,7-45,8 % соответственно, а также E. coli ИЭМ-1 - на стали (41 %), пластике (15 %) и кафеле (14 %).
Список литературы:
1. Ron E.Z., Rosenberg E. Biosurfactants and oil bioremediation // Curr. Opin. Biotechnol. - 2002. - Vol. 13, № 3. - P. 249-252.
2. Singh A., Van Hamme J.D. Surfactants in microbiology and biotechnology. Part 2. Applications aspects // Biotechnol. Adv. - 2007. - Vol. 25. - P. 99-121.
3. Das P, Mukherjee S., Sen R. Antimicrobial potential of a lipopeptide biosurfactant derived from a marine Bacillus circulans // J. Appl. Microbiol. -2008. - Vol. 104, № 6. - P 1675-1684.
4. Rodrigues L., Banat I.M., Teixeira J., Oliveira R. Biosurfactants: potential applications in medicine // J. Antimicrob. Chemother. - 2006. - Vol. 57. -P. 609-618.
5. Nitschke M., Araujo L.V., Costa S.GV.A.O., Pires R.C. at al. Surfactin reduces the adhesion of food-borne pathogenic bacteria to solid surfaces // Let. App. Microbiol. - 2009. - Vol. 49. - P. 241-247.
6. Rivardo F., Turner R.J., Allegrone G and et. Anti-adhesion activity of two biosurfactants produced by Bacillus spp. prevents biofilm formation of human bacterial pathogens // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2009. - Vol. 83. - P. 541-553.
7. Пирог Т.П., Шевчук T.A., Волошина И.Н., Грегирчак Н.Н. Использование иммобилизированных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти // Прикладная биохимия и микробиология. - 2005. - № 1 (41). - С. 58-63.
ВЫДЕЛЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ L. INTESTINALIS © Криушинская Г.В.*
Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова, г. Ульяновск
Цепь исследования: изучение вирулентности (степени проявления патогенности) лямблий.
Определив патогенность штаммов L.intestinalis методом внутрибрю-шинного заражения лабораторных животных, далее в работе мы использовали модель кишечного лямблиоза K.T. Moe (1997) в модификации Потатур-киной-Нестеровой Н.И. Всех животных (200 крыс) разделили на 4 группы по 50 в каждой. Животных 1-й группы заражали авирулентными лямблиями, 2-й группы - со слабой выраженностью данного признака (LD50/lg 2,74 ± 0,12), 3-й группы - лямблиями умеренной патогенности LD50/lg 4,3 ± 0,15 и 4-й группы - с наиболее выраженными свойствами (LD50/lg 5,38 ± 0,14). Заражение производили во всех случаях вегетаивными формами лямблий. Животным контрольной группы (50 крыс) вводили per os только стериль-
* Соискатель кафедры Зоологии, преподаватель кафедры Гуманитарных и социально-экономических дисциплин Российского государственного гуманитарного университета.
