МИКРОБИОЦЕНОЗ КИШЕЧНИКА РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ В УСЛОВИЯХ САДКОВОГО ХОЗЯЙСТВА

Зайцева Ю.В.; Доколин Д.А.; Злобин И.В.

s s

и

о R О

к

и

<u н о s

VO

s «

s

и о R о s m

УДК 579.64 Код ВАК 4.2.2 DOI: 10.32417/1997-4868-2022-227-12-42-53

Микробиоценоз кишечника радужной форели в условиях садкового хозяйства

Ю. В. Зайцева1^, Д. А. Доколин1, И. В. Злобин1

1 Ярославский государственный университет имени П. Г. Демидова, Ярославль, Россия

нE-mail: [email protected]

Аннотация. Быстрый рост индустрии аквакультуры с использованием современных интенсивных методов выращивания привел к возникновению ряда проблем, связанных с распространением инфекционных болезней рыб и качеством воды. Кишечная физиологическая микробиота рыб и окружающая водная среда составляют экосистему, баланс которой является ключевым фактором для поддержания здоровья аквакультуры. Тем не менее оптимизация микробиоты по-прежнему является сложной задачей из-за недостатка знаний о доминирующих микроорганизмах и о влиянии факторов окружающей среды. Цель - исследование структуры и таксономического состава культивируемого бактериального сообщества кишечника радужной форели Oncorhynchus mykiss в условиях садкового фермерского хозяйства «Ярославская форель». Методы. Для идентификации выделенных изолятов и характеристики состава общих бактериальных сообществ использовались фенотипические и биохимические характеристики, а также амплификация и сек-венирование фрагментов гена 16S рРНК и последующий филогенетический анализ. Научная новизна. Получены данные о таксономическом разнообразии культивируемого микробиома кишечника радужной форели. Проведен сравнительный анализ микробиоценозов кишечника рыб и окружающей водной среды. Результаты и практическая значимость. В структуре изученных микробных сообществ доминировали гамма-протеобактерии. В составе микробиома как кишечника радужной форели, так и окружающей водной среды были обнаружены представители родов Pseudomonas, Stenotrophomonas и Aeromonas, которые являются условно-патогенными и в стрессовых условиях могут приводить к вспышке бактериальных инфекций. Однако исследования показали, что окружающий водный микробиом не отражает микробиом водных хозяев. Микробиота кишечника рыб отличалась большим разнообразием. Сравнительный анализ микробиомов пресноводной системы и кишечника радужной форели выявил способность организма-хозяина концентрировать полезные пробиотические микроорганизмы даже в условиях патогенной нагрузки. Полученная коллекция микроорганизмов в дальнейшем будет использована для скрининга потенциальных пробиотических культур.

Ключевые слова: аквакультура Oncorhynchus mykiss, радужная форель, микробиом, кишечник, пробиоти-<N ки.

(N

. Для цитирования: Зайцева Ю. В., Доколин Д. А., Злобин И. В. Сравнительный анализ микробиоцено-

® зов кишечника радужной форели (Oncorynchus mykiss) и водной среды в условиях садкового хозяйства //

К Аграрный вестник Урала. 2022. № 12 (227). С. 42-53. DOI: 10.32417/1997-4868-2022-227-12-42-53. №

о Дата поступления статьи: 30.09.2022, дата рецензирования: 19.10.22, дата принятия: 28.10.22.

Постановка проблемы (Introduction) белковых кормов в рационах сельскохозяйственных

^ Аквакультура является самым быстрорастущим животных [1].

я сектором производства продуктов питания во всем Интенсификация технологии разведения, как к

g мире. В течение десятилетий исследования физио- правило, направлена на увеличение производства

g логии питания и поведения животных заложили ос- товарной рыбы за счет более высокой плотности

^ новы передовой практики разведения рыбы. В на- особей и применения искусственного кормления.

pq стоящее время рыбная продукция играет большую В данных условиях увеличивается вероятность

g роль в продовольственной корзине населения, так взрывного повышения численности бактерий, что

а как она обеспечивает по меньшей мере 30 % потре- может нести негативные последствия, в том числе

бления животных белков. Кроме того, рыба состав- увеличение бактериальной обсемененности орга-

>к ляет основу для устойчивого производства высоко- нов рыбы [2]. Возникающие вспышки инфекций со

препятствуют высокотехнологичному производству товарной рыбы и устойчивому экономическому развитию предприятий, а также могут оказывать потенциальное негативное воздействие на здоровье населения [3; 4]. Для многих бактериальных заболеваний протоколы вакцинации объектов аква-культуры отсутствуют, а чрезмерное использование антибиотиков и других химических веществ вызывает серьезную озабоченность [5; 6]. Более привлекательной выглядит стратегия защиты рыбы от возникающих болезней за счет создания и поддержания «здорового» микробиома [7; 8].

Известно, что поверхности слизистых оболочек позвоночных населены невероятно плотными и сложными популяциями комменсальной микро-биоты. Микробиомы играют критически важную роль в организме хозяина, включая укрепление здоровья и обеспечение «сопротивления» условно-патогенным микроорганизмам [9]. Кишечник рыб, как и у млекопитающих, отличается разнообразной микробиотой, способствующей усвоению питательных веществ и увеличению веса, различной метаболической активности хозяев, а также помогает функционированию иммунной системы и ингибированию патогенов [10-12]. Потенциальные патогены в основном попадают в организм рыб через эпителиальные барьеры их слизистых оболочек. Баланс между членами кишечного микробного сообщества, т. е. комменсалами, симбионтами, или патогенными бактериальными штаммами, в совокупности образующими микробиом, важен для сохранения здоровья рыб. Таким образом, изучение структуры ассоциированных с рыбой микробных сообществ послужит ориентиром для изучения этиологии и патогенеза многих заболеваний.

С другой стороны, корм и вода, в которой выращивается рыба, играют жизненно важную роль в формировании микробиома кишечника [11; 13]. Большинство исследований на сегодняшний день сосредоточено на микробиомах отдельных организмов, связанных с хозяином, однако лишь в немногих исследованиях используется комплексный подход к изучению микробиомов водных позвоночных с учетом как связанной с хозяином, так и свободноживу-щей микробиоты в экосистеме. Знание микробного разнообразия и химических параметров водоемов также важно для понимания экологии водных бактерий в аквакультуре и объяснения потенциальной роли микроорганизмов в биосфере. Необходимы фундаментальные исследования разнообразия и пространственно-временной динамики микробных сообществ, связанных с рыбами, как молекулярными, так и классическими методами микробиологии.

Целью настоящей работы было исследование структуры и таксономического состава культивируемого бактериального сообщества кишечника радужной форели Опсо^уп^т mykiss в условиях

садкового фермерского хозяйства «Ярославская форель».

На сегодняшний день радужная форель представляет значительную долю рыбной продукции на мировом рынке, поэтому является удобным модельным объектом для исследования разнообразия микробных сообществ, связанных с данным видом [2].

В практическом приложении полученные результаты могут быть использованы для контроля и корректировки условий содержания и разведения радужной форели в промышленных масштабах. В теоретическом аспекте полученные данные могут расширить представления о взаимоотношениях микроорганизмов, хозяина и окружающей среды, что очень важно для создания здорового микробиома в культивируемых организмах, а также в системах аквакультуры.

Методология и методы исследования (Methods)

Объектами исследования являлись культивируемый микробиом кишечника радужной форели, а также культивируемый микробиом водной среды, в которой выращивалась аквакультура. Десять особей радужной форели (O. mykiss) были отобраны 12 апреля 2022 г. на рыбном хозяйстве в Ярославской области. Средняя длина особей составляла 38,12 см, средняя масса - 1100 г. Рыбы до отбора содержались в садке в открытом водоеме (глубина садка - 5 м). Параллельно отбирали пробы воды из садка и водоема.

Отбор проб рыбы соответствовал руководящим принципам ARRIVE2, директиве ЕС 2010/63/EU и законам Российской Федерации о защите животных. Протокол отбора проб и применяемые процедуры были рассмотрены с этической точки зрения и одобрены Ярославским государственным университетом (протокол от 01.04.2022).

После изъятия особей из водоема для каждой особи применяли анестетик бензокаин (Merck Life Science LLC, Германия) и разрушали головной мозг. Далее рыбу доставляли в лабораторию и в стерильных условиях проводили вскрытие. После вскрытия иссекали кишечник и отбирали содержимое для определения бактериальной обсемененности. В общей сложности было отобрано и проанализировано 20 проб биологического материала, полученного от особей O. mykiss.

Все образцы рыбы были гомогенизированы в 0,9-процентном растворе хлорида натрия с помощью гомогенизатора Ultra-Turrax T 10 basic (IKA, Германия) в соотношении 1/10. Из исходного го-могената выполняли десятичные разведения в 0,9-процентном растворе хлорида натрия и аликво-ты по 0,05 мл высевали на обедненный мясопептон-ный агар (МПА). Инкубацию чашек Петри проводили в аэробных условиях до 48 ч при 28 °С. Затем чашки Петри с посевами извлекали и производили подсчет колоний. Полученные данные использо-

i h-i«

l

СtQ

a

b

h-i«

О

Г+

n>

0 b ¡3

1

СtQ h-

n>

СЛ

N

P У t СЛ ft V P

u

о

о k N

3 '

О

,

N b

to о to to

s s

и

о к о к

и

<и н о S ю

s «

s

и

о R О

s т

вали для расчета значений КОЕ/мл (для образцов воды) и КОЕ/г (для образцов рыбы). Предварительное определение выделенных бактериальных изо-лятов проводили по совокупности культуральных, морфологических и биохимических признаков [14]. Основных представителей всех групп выделяли в чистую культуру. Для полученных изолятов определяли биохимические параметры (отношение к O2, наличие каталазной и оксидазной активностей, способность к расщеплению желатина и сахарозы). Также определялась грампринадлежность выделенных штаммов методом окраски по Граму, способность к образованию спор методом окраски препарата по Пешкову (для грамположительных микроорганизмов).

Филогенетическую идентификацию выделенных изолятов проводили с помощью секвенирова-ния фрагментов генов 16S рРНК.

Тотальную ДНК из суточных культур микроорганизмов выделяли с помощью набора ExtractDNA («Евроген», Москва) в соответствии с инструкциями производителя. Гены 16S рРНК были амплифицированы с использованием универсальных прокариотических праймеров 16S-9F (5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG), 16S-1512R (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT). ПЦР проводилась с помощью коммерческого набора «БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2x)», оптимизированного для ПЦР с горячим стартом согласно инструкциям производителя («Биолабмикс», Новосибирск). Условия ПЦР: предварительная денатурация 95 °C -

4 минуты; затем 30 циклов (денатурация 95 °C -1 минута, отжиг 55 °C - 1 минута, элонгация 72 °C - 1,5 минуты); финальная элонгация 72 °C -

5 минут. Детекция результатов ПЦР осуществлялась методом электрофореза в 1,5-процентном ага-розном геле. Выделение и очистка амплифициро-ванных генов 16S рРНК производились с помощью набора CleanupMini («Евроген», Москва) согласно инструкциям производителя.

Идентификацию бактерий на основании анализа первичной нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК проводили с использованием базы данных GenBank и программного обеспечения Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide (BLAST-N), расположенного на площадке NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi). Филогенетическое дерево было построено с использованием метода максимального правдоподобия и модели Tamura-Nei [15]. Эволюционный анализ проводился с использованием программы MEGA11 [16]. Визуализация филогенетических деревьев проводилась с помощью платформы Interactive Tree of Life (iTOL) [17].

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения MS Office (Excel).

Результаты (Results)

Исследования проводились в условиях фермерского хозяйства «Ярославская форель», которое занимается выращиваем аквакультуры O. mykiss. Водоем технически разделен на две области: садковая часть, занимающая 10 % от площади водоема, в которой содержится форель, и открытая часть водоема. На момент отбора проб температура воды садковой части составила 2,5 °С, pH = 7,9, концентрация растворенного в воде кислорода - 5,2 мг/дм3. Температура воды открытой части составила 2,5 °С, pH = 7,7, концентрация растворенного в воде кислорода - 5,3 мг/дм3. Гидрохимические показатели характеристик воды в пруду находились в пределах благоприятного диапазона для разведения пресноводных рыб. Температура воды и значения рН как садковой, так и открытой части водоема садкового хозяйства «Ярославская форель» соответствовали оптимальным значениям, необходимым для нормального функционального состояния организма рыб в весенний период [18].

Общее количество микроорганизмов в садковой части водоема составило 1,9 х 102 КОЕ/мл, в открытой части водоема - 5,2 х 102 КОЕ/мл. Известно, что 104 КОЕ/г является порогом содержания микроорганизмов в водоеме, при его превышении резко возрастает обсемененность внутренних органов рыбы [19]. В данном исследовании показано, что при полученных значениях гидрохимических параметров среды количество микроорганизмов в садковой части водоема не превышало данный показатель.

Обсемененность кишечника у исследованных особей радужной форели составляла 8.1 х 103 КОЕ/г. Таким образом, плотность бактериальной популяции в кишечнике была в 10 раз выше по сравнению с водной средой. Общее количество микроорганизмов в воде и кишечнике рыб сопоставимо с ранее полученными результатами для данных температурных условий [20].

Проведен анализ разнообразия культивируемого микробиома кишечника клинически здоровой рыбы. Работа была сосредоточена на доминирующей части микрофлоры, поскольку эти организмы могут играть важную роль в естественных условиях. Всего из содержимого кишечника O. mykiss было выделено 253 изолята. Проводили учет колоний бактерий разных таксономических групп. Кислая среда кишечника благоприятствует размножению грамотрицательных бактерий [13]. Среди выделенных изолятов абсолютное большинство относилось к грамотрицательным микроорганизмам.

Создана коллекция культивируемых гетеротрофных бактерий, выделенных из кишечника радужной форели. Доминирующие таксоны бактерий выделяли в чистую культуру и идентифицировали по результатам секвенирования нуклеотидных последовательностей гена 16S рДНК. Сравнение по-

следовательностей позволило определить таксономическую принадлежность и расположение штаммов кишечной микробиоты на филогенетическом древе (рис. 1). Выделенные изоляты были представлены филумами Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes.

Предыдущие исследования показали, что ми-кробиом рыб видоспецифичен с точки зрения как бактериального разнообразия, так и структуры бактериального сообщества, демонстрируя высокую изменчивость между особями разных видов. Однако в составе микробиоты кишечника рыб доминируют несколько филумов, включая Proteo-bacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria и Fusobacteria [21; 22].

Наши исследования показали, что Proteobacteria, особенно Gammaproteobacteria, были наиболее распространенным типом микробиоты кишечника радужной форели. Филум Proteobacteria представлен 5 родами бактерий: Psychrobacter, Pseudomonas, Moraxella, Aeromonas и Lysobacter (рис. 1). Доминирующим среди всего бактериального сообщества кишечника радужной форели отмечен род Psychrobacter (60 %). Psychrobacter представляет собой широко распространенный и эволюцион-но успешный род бактерий, который ранее также был обнаружен в большом количестве в кишечном микробном сообществе различных видов рыб [23]. На долю рода Aeromonas приходилось 12 % от всего микробиома, а на долю родов Pseudomonas, Moraxella - по 1 %. Род Lysobacter был представлен в незначительном количестве (0,37 %) (рис. 2).

öd i—

l

ctq

y a

CL

b i—

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

О

r+

cd

0 er

1

ctq i—

cd сл

100

85

95

99

100

92

90

100

Staphylococcus petrasii strain CCM 8418

- Staphylococcus warnen strain AW 25 Isolate 27

- Staphylococcus pasteuri strain ATCC 51129 Isolate 26

- Lysobacter firmicutimachus strain PB6250

- Lysobacter capsici strain YC5194

- Lysobacter gummosus strain KCTC 12132 Isolate 24

Pseudomonas petroseiini MAFF 311094 'Pseudomonas antarctica culture DSM 15318' Isolate 14

Pseudomonas fluorescens JCM 5963 Isolate 7

Aeromonas tecta strain CECT 7082 Isolate 19 Isolate 18

-Aeromonas encheleia strain CECT 4342 -Aeromonas rivipoiiensis strain P2G1 -Moraxella lacunata strain NBRC 102154

- Moraxella osloensis strain CCUG 350 Isolate 2

Isolate 15 Isolate 25 Isolate 32

Psychrobacter arcticus strain 2734 Psychrobacter adeliensis strain DSM 15333 Isolate 9 Isolate 8

- Psychrobacter namhaensis strain SW242 Isolate 23

Firmicutes

Proteobacteria

Chryseobacterium piscium strain LMG 23089 Chryseobacterium balustinum strain NBRC 15053 Isolate 6

Kaistella jeonii strain AT 1047 Kaistella earn is strain G81 Isolate 16 Isolate 28 Isolate 21

Rhodococcus qingshengii JCM 15477 strain djl6 Rhodococcus erythropolis strain DSM 43066 Rhodococcus globerulus strain DSM 43954 Isolate 11 Isolate 22

Microbacterium phyllosphaerae strain DSM 13468 Isolate 5 Isolate 13

Microbacterium maritypicum strain DSM 12512

Microbacterium algeriense strain G1

Isolate 4

Isolate 12

Isolate 1

Isolate 20

Isolate 10

Isolate 30

Micrococcus aloeverae strain AE6 Micrococcus luteus strain NCTC 2665 Micrococcus yunnanensis strain YIM 65004

Bacterioidetes

Actinobacteria

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное по результатам сравнения последовательностей фрагментов гена 16S рРНК штаммов, изолированных из кишечника O. mykiss Fig. 1. Phylogenetic tree constructed based on the results of comparing the sequences of fragments of the 16S rRNA gene of

strains isolated from the intestine of O. mykiss

s s

(-4

о к о к

и

<и н о S

VO

s «

s

U

о к о s

IQ

В

0.38%

3.79%

0.38%

3.03 %

0.38% 1.52 %

1.14 % 1.14 %

Proteobacteria 1 Bacteroidetes

Firmicutes ' Actinobacteria

*Aeromonas I Chryseobacterium

Kai Stella I Lysobacter Microbacterium Micrococcus I Moraxella ' Pseudomonas Psyckrobacter ' Rhodococcus

I Staphylococcus

Рис. 2. Состав микробного сообщества кишечника О. mykiss: А - сравнительное обилие доминирующих филумов прокариот;

B - разнообразие микробных сообществ на уровне родов Fig. 2. Composition of the intestinal microbial community of O. mykiss: A - comparative abundance of dominant phylum of prokaryotes; B - diversity of microbial communities at the level of genera

Примечательно, что актинобактерии также занимали значительную долю микробного сообщества кишечника радужной форели, около 18 %. Возможно, это обусловлено составом используемых кормов. Ранее были обнаружены модулирующие эффекты муки из насекомых и растительных компонентов на микробиом кишечника выращиваемой рыбы [24; 25]. Основные сдвиги в сообществах характеризовались увеличением относительного обилия Actinobacteria и Firmicutes. В нашем исследовании филум Actinobacteria был представлен родами Micrococcus (16 %), Microbacterium (2 %) и Rhodococcus (0,37 %) (рис. 2). Бактерии типаActinobacteria включают таксоны, которые считаются полезными для здоровья рыб и могут продуцировать широкий спектр экзоферментов и вторичных метаболитов. В частности, сообщалось об использовании бактерий родов Micrococcus и Rhodococcus в качестве проби-отиков в аквакультуре [26; 27].

Филумы Firmicutes (4 %) и Bacteroidetes (3 %) составляли небольшую часть бактериальных сообществ кишечника радужной форели (рис. 2). Филум Firmicutes был представлен единственным родом Staphylococcus, доля которого в микробиоме состав-

ляла 4 % (рис. 1, 2) Представителей данного рода относят к аллохтонным видам в составе микробио-ты кишечника рыб [28], имеются предположения о возможной роли бактерий рода Staphylococcus в развитии различных кишечных инфекций [29].

Филум Bacteroidetes был представлен родами Kaistella (3 %) и Chryseobacterium (0,37 %), относящимися к семейству Flavobacteriaceae. Представители этого семейства являются типичными микроорганизмами, колонизирующими рыб, часто их признают опасными патогенами животных [8].

Живые организмы невозможно рассматривать в отрыве от окружающей их среды, поэтому логично было бы предположить, что микробиом среды способен оказывать влияние на состав микробиома организма. Кроме того, хорошо известно, что такие факторы, как диета, качество воды, сезонность, физиология хозяина, инфекции и стресс, могут формировать состав микробиомов рыб и влиять на баланс микробных экосистем [30]. Однако окружающий водный микробиом не всегда отражает микробиом водных хозяев. В предыдущих исследованиях мы продемонстрировали, что микробиом кожи форели отличался от микробиома водной среды [31].

99

96

100

87

100

90

100

89

100

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

100

Isolate 81 Isolate 82

- Pseudomonas gessardii strain CIP105469

- Isolate 66 Isolate 68

- Pseudomonas fluorescens JCM 5963

- Isolate 67

- Isolate 84

- Pseudomonas paraversuta strain V4/DAB/S4/2a

- Isolate 76

- Rahnella aceris strain SAP19

- Rahnella contaminans strain LacM11

- Rahnella inusitata strain DSM 30078

- Isolate 71 Isolate 74 Isolate 70

- Aeromonas encheleia strain NCTC12917

- Aeromonas salmonicida strain NBRC 13784 -Aeromonas bestiarum strain CIP 74.30

- Stenotrophomonas daejeonensis strain MJ03

- Stenotrophomonas acidaminiphila strain AMX19

- Stenotrophomonas terrae strain R32768

- Isolate 72

- Kaistella chaponensis strain Sa 1147-06

- Kaistella jeonii strain AT1047

- Kaistella carnis strain G81

- Isolate 73

- Flavobacterium cupreum strain P2683

- Flavobacterium aquidurense strain WB 1.156

- Isolate 77

- Flavobacterium collinsii strain 98308

Proteobacteria

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное по результатам сравнения последовательностей фрагментов гена 16S рРНК штаммов, изолированных из садковой воды Fig. 3. A phylogenetic tree constructed based on the results of comparing sequences of fragments of the 16S rRNA gene of strains isolated from cage water

i I—

l

CTQ

a

b

h-i«

О

Г+

n>

0 b

1

ctq h-

n>

сл

Bacterioidetes

В данном исследовании мы провели анализ взаимосвязи бактериологического профиля кишечника рыб с бактериальным составом водной среды. В нашем случае кишечный микробиом был значительно более разнообразным, чем в образцах воды.

Культивируемое микробное сообщество воды в садке было представлено всего двумя филумами -Proteobacteria и Bacteroidetes (рис. 3).

Протеобактерии были наиболее многочисленным типом как в кишечнике радужной форели, так и в пробах воды. Подавляющее большинство водных бактериальных изолятов (90 %) относилось к фи-луму Proteobacteria, классу Gammaproteobacteria, который был представлен родами Aeromonas, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Rahnella. Доминирующими были аэробные бактерии рода Pseudomonas (52 % от всего бактериального сообщества) и факультативно-анаэробные бактерии рода Aeromonas (35 %) (рис. 4). Бактерии аэромо-надно-псевдомонадного комплекса являются условно-патогенными и в стрессовых условиях могут приводить к вспышке бактериальных инфекций. Кроме того, некоторые из них являются зоонозны-ми патогенами и могут вызывать инфицирование человека [3; 4].

Представители филума Bacteroidetes составляли лишь 10 % бактериальной популяции водной среды. Филум Bacteroidetes был представлен единственным семейством Flavobacteriaceae, родами бактерий Flavobacterium (3 %) и Kaistella (6 %) (рис. 4). Известно, что некоторые представители

этого семейства вызывают болезни у пресноводных рыб [8]. Например, Flavobacterium psychrophilum является распространенным патогеном лососевых.

Таким образом, водная среда может являться источником патогенных и условно-патогенных комменсальных микроорганизмов. В дополнение к этому используются интенсивные методы выращивания рыбы, часто водоем зарыбляется с высокой плотностью, что способствует развитию инфекций.

Микробные сообщества кишечника тесно связаны с иммунитетом, разнообразный микробиом кишечника рыб в аквакультуре важен для предотвращения неблагоприятной микробной колонизации, и, хотя механизмы полностью не изучены, некоторые ключевые процессы были идентифицированы. Например, некоторые обитатели кишечника рыб могут проявлять ингибирующую активность в отношении патогенов [13]. Сообщалось, что бактерии рода Psychrobacter, доминирующего в бактериальном сообществе кишечника радужной форели, могут улучшать автохтонное микробное разнообразие вдоль желудочно-кишечного тракта, пищеварение и врожденный иммунитет рыб [23]. Некоторые представители рода Psychrobacter демонстрировали антагонистическую активность против патогенных видов Vibrio anguillarum, Tenacibaculum maritimum и Aeromonas salmonicida, что свидетельствует о дальнейших перспективах использования этих бактерий в качестве пробиотиков, способных оказывать положительное влияние на общее состояние здоровья рыб, тем самым повышая их устойчивость

s s

и

о к о к

и

<и н о S ю

s «

s

и

о R О

s т

к патогенам [32-34]. Пробиотические бактерии, используемые в аквакультуре, также способны стимулировать экспрессию воспалительных цитокинов в кишечнике рыб, увеличивать количество слизистого слоя и повышать фагоцитарную активность. Кроме того, в некоторых исследованиях было продемонстрировано, что колонизирующие микробы также могут модулировать экспрессию генов-хозяев для создания благоприятной среды в кишечнике, тем самым ограничивая инвазию патогенов, одновременно способствуя экспрессии генов противовоспалительных и противовирусных медиаторов [5]. Понимание и управление взаимодействием микробов, хозяина и окружающей среды и связанные с этим функциональные возможности в этих областях могут внести существенный вклад в создание более устойчивой отрасли аквакультуры. Использование пробиотиков в аквакультуре является привлекательным биологически безопасным методом снижения воздействия инфекционных заболеваний, но до сих пор не является широко распространенной практикой [7; 13; 32].

Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)

Микроорганизмы играют важную роль в круговороте питательных веществ, поддержании качества воды и здоровье сельскохозяйственных живот-

ных. Все больше фактов указывает на тесную связь между нестабильной микробной средой и возникновением болезней в аквакультуре.

В данной работе было исследовано состояние водоема, определен уровень бактериальной нагрузки, а также проведен анализ структуры и таксономического состава культивируемых микробных сообществ воды и кишечника радужной форели в условиях садкового хозяйства Ярославской области.

На микробиомы обитающих в воде животных оказывает влияние состав микробиома окружающей среды. В микрофлоре Oncorynchus mykiss и воды были обнаружены условно-патогенные виды бактерий, которые могут представлять потенциальную опасность для рыб. Необходим дальнейший мониторинг изменений экологической ситуации и санитарно-эпизоотического состояния водоема, что позволит своевременно принять меры по снижению микробного загрязнения тканей рыб и окружающей среды.

Однако микробиомы водных животных не являются прямым отражением микробиома окружающей воды. Сравнительный анализ микробиомов пресноводной системы и кишечника радужной форели выявил способность организма-хозяина концентрировать полезные микроорганизмы даже в

А

В

3.13% 3-13%

Proteobacteria Bacteroidetes

жАеготопаз

■ Flavobacterium. Kai Stella

■ Pseudomonas

■ Rahnella Stenotrophomonas

13 %

6.25 %

Рис. 4. Состав микробного сообщества садковой воды: А - сравнительное обилие доминирующих филумов прокариот; B - разнообразие микробных сообществ на уровне родов Fig. 4. Composition of microbial community of cage water: A - comparative abundance of dominant phylum of prokaryotes; B - Diversity of microbial communities at the level of genera

условиях патогенной нагрузки. Полученная коллек- туры имеют большой потенциал не только в под-

ция микроорганизмов в дальнейшем может быть держании качества воды, но и в борьбе с инфек-

использована для скрининга потенциальных про- ционными микробными патогенами. Это поможет

биотических культур. Пробиотики из автохтонного сократить использование химикатов и антибио-

источника имеют больше шансов конкурировать с тиков в системе аквакультуры. Однако успешное

резидентными микроорганизмами, способны ак- управление аквакультурой путем манипулирования

тивно размножаться и быстро становятся преобла- микробиомом в настоящее время затруднено из-за

дающими в составе микрофлоры, что может значи- недостатка знаний о соответствующих микробных

тельно улучшить устойчивость к болезням, рост и взаимодействиях и общей экологии этих систем. выживаемость рыбы. Благодарности (Akcnowledgements)

Таким образом, мониторинг и манипулирование Исследование выполнено за счет гранта Россий-

микробными сообществами в системе аквакуль- ского научного фонда № 22-26-20123.

Библиографический список

1. Лагуткина Л. Ю., Пономарев С. В. Органическая аквакультура как перспективное направление развития рыбохозяйственной отрасли (обзор) // Сельскохозяйственная биология. 2018. № 53 (2). С. 326-336.

2. Тыщенко В. И., Терлецкий В. П. Oncorhynchus mykiss в аквакультуре: биотехнологические и генетические основы разведения и селекции // Международный научно-исследовательский журнал. 2021. № 7 (109). С. 141-144.

3. Ziarati M., Zorriehzahra M. J., Hassantabar F., Mehrabi Z., Dhawan M., Sharun K., Emran T. B., Dhama K., Chaicumpa W., Shamsi S. Zoonotic diseases of fish and their prevention and control // Veterinary Quarterly. 2022. Vol. 42. Iss. 1. Pp. 95-118. DOI: 10.1080/01652176.2022.2080298.

4. Авдеева Е. В. Условно-патогенные бактерии рыб в естественных и искусственных водоемах Калининградской области // Труды ВНИРО. 2017. № 167. С. 104-109.

5. Perry W. B., Lindsay E., Payne C. J., Brodie C., Kazlauskaite R. The role of the gut microbiome in sustainable teleost aquaculture // Proceedings of the Royal Society B. 2020. No. 287 (1926). Article number 20200184. DOI: 10.1098/rspb.2020.0184.

6. Santos L., Ramos F. Antimicrobial resistance in aquaculture: current knowledge and alternatives to tackle the problem // International Journal of Antimicrobial Agents. 2018. No. 52 (2). Pp. 135-143. DOI: 10.1016/j.ijantimi-cag.2018.03.010.

7. Pérez-Pascual D., Vendrell-Fernández S., Audrain B., Bernal-Bayard J., Patiño-Navarrete R., Petit V, Rigaud-eau D., Ghigo J. M. Gnotobiotic rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) model reveals endogenous bacteria that protect against Flavobacterium columnare infection // PLoS pathogens. 2021. No. 17 (1). Article number e1009302. DOI: 10.1371/journal.ppat.1009302.

8. Ikeda-Ohtsubo W., Brugman S., Warden C. H., Rebel J. M. J., Folkerts G., Pieterse C. M. J. How can we define "optimal microbiota?": A comparative review of structure and functions of microbiota of animals, fish, and plants in agriculture // Frontiers in nutrition. 2018. No. 5 (90). DOI: 10.3389/fnut.2018.00090.

9. Vasemagi A., Visse M., Kisand V. Effect of environmental factors and an emerging parasitic disease on gut microbiome of wild salmonid fish // MSphere. 2017. No. 2 (6). Article number e00418-17. DOI: 10.1128/ mSphere.00418-17.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

10. Xiong J. B., Nie L., Chen J. Current understanding on the roles of gut microbiota in fish disease and immunity // Zoological research. 2019. No. 40 (2). Pp. 70-76. DOI: 10.24272/j.issn.2095-8137.2018.069.

11. Butt R. L., Volkoff H. Gut microbiota and energy homeostasis in fish // Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 2019. No. 10. Pp. 6-8. DOI: 10.3389/fendo.2019.00009.

12. Pérez-Pascual D., Pérez-Cobas A. E., Rigaudeau D., Rochat T., Bernardet J. F., Skiba-Cassy S., Marchand Y., Duchaud E., Ghigo J. M. Sustainable plant-based diets promote rainbow trout gut microbiota richness and do not alter resistance to bacterial infection // Animal microbiome. 2021. No. 3 (1). Pp. 1-13. DOI: 10.1186/s42523-021-00107-2.

13. Sehnal L., Brammer-Robbins E., Wormington A. M., Blaha L., Bisesi J., Larkin I., Martyniuk C. J., Simonin M., Adamovsky O. Microbiome composition and function in aquatic vertebrates: small organisms making big impacts on aquatic animal health // Frontiers in microbiology. 2021. No. 12. Article number 567408. DOI: 10.3389/fmicb.2021.567408.

14. Хоулт Дж., Криг Н. Определитель бактерий Берджи: в 2-х томах. Том 1 / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига; пер. с англ. под ред. акад. РАН Г. А. Заварзина. Изд. 9-е. Москва: Мир, 1997. 429 с.

15. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Molecular Biology and Evolution. 1993. No. 10 (3). Pp. 512-526.

i h-i«

l

ctq

a

b

h-i«

О

Г+

n>

0 b ¡3

1

ctq h-

n>

СЛ

s s

и

о R О

к

и

<u н о s

VO

s «

s

и

о R о s

IQ

16. Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets // Molecular Biology and Evolution. 2016. No. 33 (7). Pp. 1870-1874.

17. Letunic I., Bork P. Interactive Tree Of Life (iTOL): an online tool for phylogenetic tree display and annotation // Bioinformatics. 2007. No. 23 (1). Pp. 127-128. DOI: 10.1093/nar/gkab301.

18. Кушникова Л. Б., Ануарбеков С. М., Евсеева А. А. Лимитирующие факторы при садковом выращивании рыбы в горных водоемах Восточного Казахстана // Вестник НГАУ 2018. № 1 (46). С. 127-135.

19. Морозова М. А., Дьяченко М. А., Абросимова Н. А., Чемисова О. С., Степанова Ю. В., Пархоменко Ю. О. Микрофлора паренхиматозных органов у молоди карповых рыб в товарных рыбоводных хозяйствах // Комплексные исследования в рыбохозяйственной отрасли: материалы IV Международной научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. Владивосток, 2018. С. 80-85.

20. Bisht A., Singh U. P., Pandey N. N. Comparative study of seasonal variation in bacterial flora concomitant with farm raised fingerlings of Cyprinus carpio at tarai region of Uttarakhand // Journal of Environmental Biology. 2014. No. 35 (2). Pp. 363-367.

21. Gomez J. A., Primm T. P. A Slimy Business: the Future of Fish Skin Microbiome Studies // Microbial Ecology.

2021. No. 82. Pp. 275-287. DOI: 10.1007/s00248-020-01648-w.

22. Tyagi A., Singh B., Billekallu Thammegowda N. K., Singh N. K. Shotgun metagenomics offers novel insights into taxonomic compositions, metabolic pathways and antibiotic resistance genes in fish gut microbiome // Archives of microbiology. 2019. No. 201 (3). Pp. 295-303. DOI: 10.1007/s00203-018-1615-y.

23. Gao Y. M., Zou K. S., Zhou L., Huang X. D., Li Y. Y., Gao X. Y., Chen X., Zhang X. Y. Deep insights into gut microbiota in four carnivorous coral reef fishes from the South China Sea // Microorganisms. 2020. No. 8 (3). Article number 426. DOI: 10.3390/microorganisms8030426.

24. Rangel F., Enes P., Gasco L., Gai F., Hausmann B., Berry D., Oliva-Teles A., Serra C. R., Pereira F. C. Differential Modulation of the European Sea Bass Gut Microbiota by Distinct Insect Meals // Frontiers in microbiology.

2022. No. 13. Article number 831034. DOI: 10.3389/fmicb.2022.831034.

25. Wu F., Chen B., Liu S., Xia X., Gao L., Zhang X., Pan Q. Effects of woody forages on biodiversity and bioac-tivity of aerobic culturable gut bacteria of tilapia (Oreochromis niloticus) // PLoS ONE. 2020. No. 15 (7). Article number e0235560. DOI: 10.1371/journal.pone.0235560.

26. Abd El-Rhman A. M., Khattab Y. A., Shalaby A. M. Micrococcus luteus and Pseudomonas species as probiot-ics for promoting the growth performance and health of Nile tilapia, Oreochromis niloticus // Fish and Shellfish Immunology. 2009. No. 27 (2). Pp. 175-180. DOI: 10.1016/j.fsi.2009.03.020.

27. Sharifuzzaman S. M., Rahman H., Austin D. A., Austin B. Properties of probiotics Kocuria SM1 and Rho-dococcus SM2 isolated from fish guts // Probiotics and Antimicrobial Proteins. 2018. No. 10 (3). Pp. 534-542. DOI: 10.1007/s12602-017-9290-x.

28. Poteshkina V. A., Uskova I. V Enzymatic potential of the indigenous microbiota of the intestine of rainbow trout Parasalmo mykiss (= Oncorhynchus) // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 2020. No. 539 (1). Article number 012200. DOI: 10.1088/1755-1315/539/1/012200.

29. Kononova S. V., Zinchenko D. V., Muranova T. A., Belova N. A., Miroshnikov A. I. Intestinal microbiota of salmonids and its changes upon introduction of soy proteins to fish feed // Aquaculture International. 2019. No. 27 (2). Pp. 475-496. DOI: 10.1007/s10499-019-00341-1.

30. Terova G., Gini E., Gasco L., Moroni F., Antonini M., Rimoldi S. Effects of full replacement of dietary fish-meal with insect meal from Tenebrio molitor on rainbow trout gut and skin microbiota // Journal of Animal Science and Biotechnology. 2021. No. 12 (30). DOI: 10.1186/s40104-021-00551-9.

31. Evdokimov E. G., Zaitseva Yu. V., Flerova E. A., Dokolin D. A., Zlobin I. V. Influence of conditions of the aquatic environment on the immuno-physiological status of the organism and the microbiome of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in cage farming // Veterinaria i kormlenie. 2022. No. 6. Pp. 28-32.

32. Simón R., Docando F., Nuñez-Ortiz N., Tafalla C., Díaz-Rosales P. Mechanisms used by probiotics to confer pathogen resistance to teleost fish // Frontiers in Immunology. 2021. No. 12. Article number 653025. DOI: 10.3390/microorganisms8030426.

33. Lazado C. C., Caipang C. M., Rajan B., Brinchmann M. F., Kiron V. Characterization of GP21 and GP12: Two Potential Probiotic Bacteria Isolated from the Gastrointestinal Tract of Atlantic Cod // Probiotics and Antimicrobial Proteins. 2010. No. 2 (2). Pp. 126-34. DOI: 10.1007/s12602-010-9041-8.

34. Wanka K. M., Damerau T., Costas B., Krueger A., Schulz C., Wuertz S. Isolation and characterization of native probiotics for fish farming // BMC Microbiology. 2018. No. 18 (1). Pp. 1-13. DOI: 10.1186/s12866-018-1260-2.

Об авторах:

Юлия Владимировна Зайцева1, кандидат биологических наук, старший научный сотурдник лаборатории экобиомониторинга и контроля качества, доцент кафедры микробиологии и ботаники, ORCID 0000-0001-9522-010X, AuthorlD 226090; +7 980 703-53-01, [email protected]

Дмитрий Андреевич Доколин1, стажер-исследователь лаборатории биотехнологии и прикладной биоэле-ментологии, ORCID 0000-0003-3064-5945, AuthorlD 1167275; + 7 960 530-27-62, [email protected] Илья Васильевич Злобин1, младший научный сотрудник лаборатории экобиомониторинга и контроля качества, ORCID 0000-0001-7348-222, AuthorlD 1167612; +7 910 810-40-45, [email protected] 1 Ярославский государственный университет имени П. Г. Демидова, Ярославль, Россия

Intestinal microbiocenos of rainbow trout in the conditions of a cage farm

Yu. V. Zaytseva1^, D. A. Dokolin1, I. V. Zlobin1 1 P. G. Demidov Yaroslavl State University, Yaroslavl, Russia

M E-mail: [email protected]

Abstract. The rapid growth of the aquaculture industry using modern intensive farming methods has led to a number of problems related to water quality and the spread of infectious diseases in fish. The intestinal physiological microbiota of fish and the surrounding aquatic environment forming an ecosystem, the balance of which is a key factor in maintaining the health of aquaculture. However, optimizing the microbiota is still a challenging task due to a lack of studies about the dominant microorganisms in aquacultures and the influence of environmental factors on it. The aim of this work was to study the structure and taxonomic composition of the cultivatable bacterial gut community of the rainbow trout Oncorhynchus mykiss under the conditions of the "Yaroslavskaya Trout" cage farm. Methods. To identify the isolated strains and characterize the composition of common bacterial communities were used phenotypic and biochemical characteristics, as well as amplification and sequencing of 16S rRNA gene fragments and subsequent phylogenetic analysis. Scientific novelty. Data on the taxonomic diversity of the cultivated rainbow trout gut microbiome have been obtained. A comparative analysis of fish intestinal microbio-cenoses and the surrounding aquatic environment was carried out. Results and practical significance. Gamma-proteobacteria was the most abundant bacteria in the structure of the studied microbial communities. Bacteria of the genera Pseudomonas, Stenotrophomonas, and Aeromonas were found in the microbiome of both the rainbow trout intestines and the surrounding aquatic environment, which are opportunistic pathogens and can lead to an outbreak of bacterial infections under stressful conditions. However, studies have shown that the surrounding aquatic microbiome does not always reflect the microbiome of aquatic organisms. A comparative analysis of the freshwater microbiomes and the gut microbiome of rainbow trout revealed the ability of the host organism to concentrate beneficial probiotic microorganisms even under conditions of pathogenic presure. The resulting collection of microorganisms can be further used for screening potential probiotic cultures. Keywords: aquaculture Oncorhynchus mykiss, rainbow trout, microbiome, intestines, probiotics.

For citation: Zaytseva Yu. V., Dokolin D. A., Zlobin I. V Mikrobiotsenoz kishechnika raduzhnoy foreli v us-loviyakh sadkovogo khozyaystva [Intestinal microbiocenos of rainbow trout in the conditions of a cage farm] // Agrarian Bulletin of the Urals. 2022. No. 12 (227). Pp. 42-53. DOI: 10.32417/1997-4868-2022-227-12-42-53. (In Russian.)

Date of paper submission: 30.09.2022, date of review: 19.10.22, date of acceptance: 28.10.22.

References

1. Lagutkina L. Yu., Ponomarev S. V Organicheskaya akvakul'tura kak perspektivnoe napravlenie razvitiya ry-bokhozyaystvennoy otrasli (obzor) [Organic aquaculture as a promising direction for the development of the fisheries industry (review)] // Agricultural biology. 2018. No. 53 (2). Pp. 326-336. (In Russian.)

2. Tyshchenko V. I., Terletskiy V. P. Oncorhynchus mykiss v akvakul'ture: biotekhnologicheskie i geneticheskie osnovy razvedeniya i selektsii [Oncorhynchus mykiss in aquaculture: biotechnological and genetic foundations of breeding and breeding] // International Research Journal. 2021. No. 7 (109). Pp. 141-144. (In Russian.)

s

s ^

о R О

к

и

<u н о s ю

s

R

s ^

о R о s m

3. Ziarati M., Zorriehzahra M. J., Hassantabar F., Mehrabi Z., Dhawan M., Sharun K., Emran T. B., Dhama K., Chaicumpa W., Shamsi S. Zoonotic diseases of fish and their prevention and control // Veterinary Quarterly. 2022. Vol. 42. Iss. 1. Pp. 95-118. DOI: 10.1080/01652176.2022.2080298.

4. Avdeeva E. V. Uslovno-patogennye bakterii ryb v estestvennykh i iskusstvennykh vodoemakh Kaliningrads-koy oblasti [Conditionally pathogenic fish bacteria in natural and artificial reservoirs of the Kaliningrad region] // Trudy VNIRO. 2017. No. 167. Pp. 104-109. (In Russian.)