CC BY
70
УДК 579.64:631.46:631.445.51:504.0546665.61(470.630) МИКРОБИОТА ЗАСОЛЕННЫХ ЛУГОВО-КАШТАНОВЫХ ПОЧВ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ НЕФТЬЮ И БИОРЕКУЛЬТИВАЦИИ
© 2011 И.З. Ибатуллина1, Ю.А. Виноградова2, Ф.М. Хабибуллина2
1 МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва 2 Институт биологии КНЦ УрО РАН, г. Сыктывкар
Поступила в редакцию 07.05.2011
В статье рассматриваются пути восстановления нефтезагрязненных засоленных лугово-каштановых почв. Приведены результаты исследований влияния различных доз нефти, возраста загрязнения и способа рекультивации на структуру и численность эколого-трофических групп, биомассы микроорганизмов в засоленных лугово-каштановых почвах.
Ключевые слова: засоленная почва, нефтезагрязнение, биопрепараты, микробиота, рекультивация
Загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами до сих пор остается актуальной проблемой. Скорость процессов самоочищения почв от нефти в любой климатической зоне зависит от взаимодействия и эффективности таких природных факторов, как физический (процессы выветривания), физико-химический (процессы фотохимического и биохимического преобразования углеводородов) и биологический (микробная деструкция). В конечном итоге решающим в процессах самоочищения почв от нефти является биологический фактор, обусловленный функциональной активностью почвенной микробиоты, которая определяет скорость и глубину трансформации нефтяных соединений. Анализ результатов работ в различных почвенно-климатических зонах показал сходство реакций почвенной микробиоты на различные дозы нефтезагрязнений. Установлено, что при низких дозах загрязнения (до 1%) происходит стимулирование активности основных трофических групп микробиоты, дифференцированное ингибирование отдельных групп при концентрации нефти до 5% и практически полное отсутствие всех групп почвенных микроорганизмов при дозах нефти выше 10% [2-4]. Для этих почв в настоящее время отсутствуют универсальные способы рекультивации после нефтяного загрязнения, в том числе и биологические.
Ибатуллина Инна Зайтуновна, аспирантка. E-mail: zaitun2003@mail.ru
Виноградова Юлия Алексеевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела почвоведения. E-mail: vinogradova@ib.komisc.ru
Хабибуллина Флюза Мубараковна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник отдела почвоведения. Е- mail: fluza@ib.komisc.ru
Несмотря на имеющийся обширный мировой опыт рекультивации нефтезагрязнен-ных земель, среди исследователей нет единого мнения о преимуществах того или иного метода. В разных почвенно-климатических зонах скорость самовосстановления нефтезагряз-ненных почвенных экосистем сильно варьирует. Поэтому поиск приемов, позволяющие упростить процесс рекультивации нефтезаг-рязненных почв без потерь их качества, является актуальным, в особенности, при проведении восстановительных работ в районах распространения засоленных почв, таких как солончаки.
Остаются малоизученными вопросы деградации нефти в засоленных почвах Ставропольского края. Повышенная соленость почвенных растворов, высокие температуры воздуха и повышенное содержание парафинов в нефти приводят к формированию стрессовых условий для существования почвенной микробиоты, что обусловливает низкую скорость самоочищения почвы. В данной работе впервые проведен анализ биологической активности нефтезагрязненных засоленных лугово-каштановых почв разного возраста загрязнения и способа восстановления.
Цель исследования: изучение численности эколого-трофических групп и биомассы микроорганизмов засоленных лугово-каштано-вых почв, подвергавшихся нефтяному загрязнению в процессе их восстановления и после рекультивации биологическими приемами.
Объект и методы исследования. В модельном эксперименте исследовали биологическую активность фоновых лугово-каштано-вых почв Ставропольского края, а также их
нефтезагрязненных аналогов. Для постановки модельного эксперимента были использованы почвенные образцы с 5-ти и 18-ти месячным сроком нефтяного загрязнения (без рекульта-виции) и с предварительной рекультивацией биопрепаратом «Элита-комплекс». Для имитации свежего загрязнения в незагрязненную лугово-каштановую почву была внесена нефть Ачикулакского месторождения в концентрации 100 мл на 1 кг почвы.
В лабораторных условиях для оценки эффективности биологического метода рекультивации использовали следующие коммерческие биопрепараты:
1. Биопрепарат Института биологии Коми научного Центра УрО РАН «Биосорбент с использованием бактериально-дрожжевого и грибного консорциумов для очистки водоемов и почв от нефтепродуктов» [7]. В его состав входят Rhodococcus erythropolis РК-16, Arthrobacter sp. НК-15, Candida lipolytica КБП-3308, Candida guillirmondii КБП-3175, Pichia guillirmondii КБП-3205, Fusarium moniliforme Sheld., Gliocladium deliquescens Sopp., иммобилизованные в гидрофобный сорбент на основе торфа «Сорбонафт».
2. Биопрепарат компании «Элита-комплекс» (г. Екатеринбург), состоящий из штаммов Rhodococcus sp. Препарат получают в ферментерах на питательных средах с добавлением определенной концентрации нефти (нефть местного Ачикулакского месторождения).
3. Микромицетный комплекс на основе штаммов, выделенных из засоленных мест обитания и почв, подверженных воздействию нефтепродуктов: Fusarium solani (Mart.) Appel & Wollenw, Fusarium moniliforme Sheld., Heleococcum alkalinum Bilanenko & M. Ivanova (Acremonium alkalophilum), Acremonium ruti-lum W. Gams, Acrostalagmus luteoalbus (Link) Zare, W. Gams & Schroers (син. Verticillium tenerum Nees), Debaryomyces hanzenii (Zopf) Lodder & Kreger .
В работе были исследованы четыре варианта очистки от нефти отобранных загрязненных почвенных образцов:
1) с внесением биосорбента (биопрепарат «Сорбонафт»);
2) с внесением биопрепарата компании «Элита-Комплекс»;
3) с внесением микромицетного комплекса;
4) без внесения биопрепаратов (самоочищение).
Все варианты инкубировали при постоянной температуре 24оС и увлажнении 60% от полной влагоемкости почвы в течение 1,5 месяца. Повторность трехкратная. Совместно с биопрепаратами вносили удобрение Азофоска (0,1 г азофоски на 100 г почвы). Остаточное содержание
нефтепродуктов определяли методом экстракции нефтепродуктов с помощью четыреххлори-стого углерода [5]. Учет численности микроорганизмов азотного цикла проводили методом посева почвенной суспензии на соответствующие питательные среды: аммонификаторы - на мясо-пептонном агаре (МПА); микроорганизмы, использующие минеральные формы азота -на крахмал-аммиачном агаре (КАА); аэробные азотфиксаторы и олигонитрофилы - на среде Эшби, нитрификаторы - на среде Виноградско-го; целлюлозолитики - на среде Гетчинсона; сахаролитики - на среде Чапека-Докса. Численность микроорганизмов выражали в КОЕ на грамм воздушно-сухой почвы [6]. Общее количество микроорганизмов (бактерий, мицелий, споры грибов) определяли с помощью метода люминесцентной микроскопии [1]. Статистическую обработку данных проводили с использованием программ STATISTIC A 6.0 и Excel 2000.
Результаты и обсуждения. Перед постановкой опыта была определена остаточная концентрация нефти во всех вариантах почв, взятых для постановки опыта. Содержание нефти в варианте с внесением свежей нефти составила 85,1 г/кг в.с.п., в почвенных образцах с 5-ти и 18-ти месячным сроком нефтяного загрязнения без рекультивации - 47,8 и 25,9 г/кг, с предварительной рекультивацией биопрепаратом «Элита-комплекс» 25,6 и 23,7 г/кг в.с.п. соответственно (рис. 1). За время опыта (1,5 мес.) более значительное снижение концентрации нефти имело место в вариантах со свежим загрязнением. Достаточная влажность почвы и благоприятная температура (25оС) также способствовали разложению нефти в вариантах самоочищения. Все биопрепараты показали достаточную эффективность, но наиболее стабильные результаты были получены при использовании биосорбента «Сорбонафт», испытание которого в свежезагрязненной почве привело к снижению концентрации нефти на 65%. В почвах со старым загрязнением использование препаратов оказалось мало эффективным.
Для определения влияния биопрепаратов на процесс восстановления почвенной микробиоты в опытных вариантах была исследована ее биомасса, трофическая структура и численный состав.
Биомасса микроорганизмов. Подсчет микробной биомассы лугово-каштановых засоленных почв показал довольно высокие значения по грибной (мицелий, споры, дрожжи), с низкой долей бактериальной (не выше 0,1-2%). При воздействии свежей нефти (около 8%) за период экспозиции биомасса микроорганизмов (дрожжи, мицелий и споры
грибов) во всех вариантах резко снизилась по сравнению с исходной (фоновой) почвой.
г/кгв.с.1.
100
12 3 4 5
□ начальное содержание ЕЗсамоочищение
¡3 биосорбент "Сор бон афт" □ препарат компании "Элита-комплекс
У никромицетный комплекс
Рис. 1. Остаточное содержание нефтепродуктов в лугово-каштановых солончаковатых почвах до и после проведения модельного эксперимента (срок экспозиции - 1,5 месяца); 1 - свежее загрязнение, 2 - 5 мес. загрязнения без рекультивации, 3 - 18 мес. загрязнения без рекультивации, 4 - 5мес. с рекультивацией, 5 - 18 мес. с рекультивацией
В ходе эксперимента биомасса микроорганизмов в варианте с грибными препаратами была значительно выше показателей варианта самоочищения, но оставалась более низкой, чем в незагрязненной почве. Воздействие бактериального препарата «Элита-комплекс» на биомассу микроорганизмов было на уровне варианта самоочищения. Это объясняется тем, что этот биопрепарат бактериальный, а основную биомассу микроорганизмов составляют грибы.
\
40 - I у
33 I п Ш IV П гп
мш^м:
фон 13 3 4 13 3 4 1334 1334 1334
Рис. 2. Общая биомасса микроорганизмов в нефтезагрязненных лугово-каштановых засоленных почвах после проведения модельного эксперимента (срок экспозиции - 1,5 месяца): 1 - биопрепарат «Сорбонафт», 2 - препарат компании Элита-комплекс, 3 - микромицетный комплекс, 4 - самоочищение; I - свежее загрязнение, II - 5 мес. без рекультивации, III - 18 мес. без рекультивации, IV - 5 мес. с рекультивацией, V - 18 мес. с рекультивацией
Использование биопрепаратов для восстановления нефтезагрязненных почв 5-ти месячной давности без предварительной рекультивации на фоне самоочищения привело к дальнейшему увеличению биомассы микроорганизмов. В составе грибной биомассы доминировал спорово-дрожжевой компонент, имело место уменьшение количества мицелия в варианте с микромицетным комплексом и полное его исчезновение в вариантах с «Сорбонафт» и «Элита-комплексом». При использовании почвы аналогичного возраста загрязнения, но с предварительной рекультивацией, показатели биомассы микроорганизмов, за исключением варианта с «Элита-комплекс», были значительно выше. При возрасте загрязнения в 18 месяцев без рекультивации, наоборот, в вариантах с грибными препаратами наблюдалось снижение биомассы микроорганизмов, а предварительная рекультивация в эти сроки привела к активизации роста биомассы микроорганизмов во всех вариантах опыта с наибольшими значениями в вариантах с грибными препаратами. В данный период грибная биомасса состояла только из спорово-дрожжевого компонента, мицелий грибов отсутствовал, бактерии и актиномицеты были незначительными. По окончании модельного опыта при сравнительной оценке эффективности действия различных биопрепаратов на деградацию нефти различных возрастов загрязнения, наиболее высокие значения биомассы микроорганизмов были отмечены во все сроки в вариантах с микромицетным комплексом и
«Сорбонафтом» на фоне предварительного рекультивирования.
Эколого-трофические группы микроорганизмов (ЭКТГМ). Из почвенных образцов, взятых на фоновых и опытных участках, были выделены различные ЭКТГМ. Основное внимание было уделено группам микроорганизмов азотного цикла. Как известно, азот занимает особое место среди химических элементов, участвующих в круговороте веществ в почве, где проходят многосторонние реакции, связанные с превращением азота. Цикл превращения азотсодержащих соединений в почве тесно связан с развитием и биохимической деятельностью аммонифицирующих, нитрифицирующих и азотфиксирующих микроорганизмов. Различия в составе и численности микроорганизмов, участвующих в процессах метаболизма азота в исследуемых почвах, связаны с неоднозначным влиянием углеводородов нефти на эти группы.
Анализ фоновой почвы выявил относительно не высокое содержание аммонифика-торов (2,25 млн. КОЕ /г в.с.п.), нитрификато-ров (1,1 млн. КОЕ/ г в.с.п.) и олигонитрофилов (1,8 млн. КОЕ/г в.с.п.). В свежезагрязненных вариантах количество всех ЭКТГМ в условиях самоочищения уступали фоновым в 1.2-2 раза. При этом произошли значительные изменения в соотношении физиологических групп - увеличилось относительное количество аммонификаторов, олигонитрофилов, сократилась численность сахаролитиков, минерализаторов (рис.3). Использование биопрепаратов привело к резкому изменению состава ЭКТГМ. При использовании микромицетного комплекса и биосорбента «Сорбонафт» наблюдалась высокая активность аммонифика-торов. Численность бактерий, использующих легкодоступные сахара (среда Чапека-Докса) увеличивалась в почве со свежим загрязнением при использовании биосорбента «Сорбонафт» и препарата компании «Элита-комплекс».
1 1
.........."""
««ш«««
........................
.....
-1- -+-
0% 20% 40% «0% 80% 100%
□ аыыонификаторы Пиинерализаторы п нтрифихат оры
□ олигонтрофилы Нсахаролтики
Рис. 3. Соотношение эколого-трофических групп бактерий при действии биопрепаратов в нефтезагрязненных нерекультивируемых засоленных лугово-каштановых почвах: 1 - биопрепарат «Сорбонафт», 2 - препарат компании «Элита-Комплекс», 3 - микромицетный комплекс, 4 -самоочищение, I - свежее загрязнение, II - 5 мес. без рекультивации, III - 18 мес. без рекультивации
При применении биосорбента «Сорбо-нафт» и препарата компании «Элита-комплекс» в предварительно рекультивированных почвах с 5-ти месячным загрязнением, по сравнению с аналогичными почвами без рекультивации, происходит увеличение активности бактерий на средах МПА, КАА и Эшби. При увеличении срока загрязнения в исследуемых образцах (18 месяцев без предварительной рекультивации) происходит изменение численности в структуре
ЭКТГМ, что наиболее выражено при использовании комплекса микромицетов. Происходит рост численности аммонификаторов, сахароли-тиков. Снижение концентрации нефти в данном образце стимулирует активность бактерий на среде Эшби (олигонитрофилы, азотфиксаторы), по сравнению со свежим загрязнением (рис. 3).
При самовосстановлении старовозрастных нефтезагрязненных почв с предварительной рекультивацией в отличие от вариантов без рекультивации резко возрастает активность ам-монификаторов и минерализаторов, по сравнению с другими группами бактерий (рис. 4), что указывает на достаточное количество доступного для них органического вещества для их потребления и его активную минерализацию. В варианте с «Элита-комплекс» ЭКТГМ оставались почти на первоначальном уровне, поскольку доступные органические для бактерий биопрепарата вещества уже были использованы этой же группой бактерий во время предварительной рекультивации. В двух других вариантах процесс нефтедеструкции идет более активно, соответственно микробиологические процессы опережают аналогичные показатели вариантов самовосстановления, поэтому через 1,5 месяца отмечено снижение активности аммо-нификаторов и нитрификаторов на фоне увеличения сахаролитиков, олигонитрофилов и оли-готрофов. Соотношение количества микроорганизмов на КАА и МПА показывает степень напряженности минерализационных процессов. С увеличением срока (18 месяцев) коэффициент минерализации меньше 1 практически во всех почвах с использованием биопрепаратов, что свидетельствует о повышении доли микроорганизмов, потребляющих органические формы азота. Введение биопрепаратов в образцы со старым остаточным загрязнением с предварительным рекультивированием и без него активизировало развитие олигонитрофилов и появление на среде Эшби азотфиксаторов (рис. 3-4).
Увеличение срока загрязнения (18 месяцев) привело к уменьшению как концентрации нефти в почве, так и численности практически всех эколого-трофических групп бактерий при использовании биопрепаратов, и к появлению на питательных средах ярко окрашенных (желтых, оранжевых, красных, розовых, серых и черных) колоний, в том числе и выделяющих диффундирующие в среду пигменты. Известно [2], что присутствие пигментированных колоний говорит о высоком уровне метаболизма почвенного микробоценоза и в целом об активизации процессов очищения почвы от нефте-загрязнения.
iiiiiiiiiiiiiiiiiiii lllllllllllllll ¡es
^^^^t^^lllllllllllllllll iiiiiiiiiiiiiiiiiiii Iiiiiiiii :::.
IIIIIII H f:: ......
lllllllllllllllllll 1..............................
IIIIIIIIIIIIIIIIIIII 1111111111111111 II 1!
"^ssaiiiin В
iiiiiiiiiiiiiiiiiiiii lim №
-1-
Налшоннфнкаторы ПЫннералкзаяоры □ннтрнфнЕаторы ЕЭолнгоннтрофнлы сахар олитнкн
Рис. 4. Соотношение эколого-трофических групп бактерий при действии биопрепаратов в нефтезагрязненных рекультивируемых засоленных лугово-каштановых почвах: 1 - биопрепарат «Сорбонафт», 2 - препарат компании Элита-комплекс, 3 - микромицетный комплекс, 4 -самоочищение; I - 5 мес. с рекультивацией, II - 18 мес. с рекультивацией
Наряду с бактериальным комплексом, исследована группа целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Как известно, целлюлоза -один из самых распространенных в природе растительных полимеров. Почва содержит значительное количество целлюлозосодержа-щих растительных субстратов. Трансформация клетчатки в почве имеет большое значение и тесно связана с процессами гумусообра-зования. Этот процесс имеет глобальное значение в круговороте углерода в природе, что обусловливает особую роль разлагающих целлюлозу микроорганизмов. Разложение целлюлозы осуществляется целлюлозоразру-шающими микроорганизмами и связано с условиями их нормального функционирования [3]. Наиболее чувствительными к нефтяному загрязнению являются аэробные целлюлозо-разлагающие микроорганизмы. Они являются основными индикаторами плодородия почв. На их развитие большое влияние оказывают условия аэрации. Наши данные показывают, что нефтяное загрязнение (свежее и по истечении 5 месяцев) при использовании биопрепаратов, не стимулирует процесс развития целлюлозоразрушающих микроорганизмов, за исключением препарата компании «Элита-комплекс». Через 18 месяцев после загрязнения при рекультивации и без нее в почвах происходит увеличение целлюлозолитиков, за исключением самовосстановления (рис. 5).
Рис. 5. Численность целлюлозолитиков в нефтезагрязненных лугово-каштановых солончаковатых почвах при действии биопрепаратов: 1 - биопрепарат «Сорбонафт», 2 - препарат компании Элита-комплекс, 3 -микромицетный комплекс, 4 - самоочищение, I - свежее загрязнения, II - 5 мес. загрязнения, III - 18 мес. загрязнения
Как показывают наши опыты с достаточно высокими дозами первоначального загрязнения нефтью засоленных почв, целлюло-зоразрушающие микроорганизмы отреагировали снижением численности в десятки раз, что предполагает слабый темп разложения клетчатки - снижается целлюлозолитическая активность почв, что сказывается и на плодородие этих почв, следовательно, нарушается одно из звеньев круговорота углерода в природе [3]. При применении восстановительных мероприятий в виде аэрации, минеральных удобрений, биопрепаратов их численность увеличивалась на фоне самовосстановления, но за опытный период не восстанавливалась до исходного фонового уровня.
Выводы: свежее загрязнение нефтью засоленных лугово-каштановых почв привело к нарушению состава, численности эколого-трофических групп микроорганизмов. Использование бактериальных и грибных биопрепаратов способствует активизации нефте-деструкции в засоленных лугово-каштановых почвах. Биопрепараты оказывают избирательное стимулирование различных физиологических групп микроорганизмов. Биопрепарат «Элита-комплекс» активизирует развитие са-харолитиков и минерализаторов, биосорбент «Сорбонафт» - аммонификаторов и сахароли-тиков, а микромицетный комплекс - аммони-фикаторов и олигонитрофилов с азотфиксато-рами. На основании этих данных в дальнейшем возможно составление схемы применения, чередования, комбинирования этих биопрепаратов для более эффективной очистки засоленных нефтезагрязненных почв разных возрастов загрязнения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Головченко, А.В. Влияние нефти на численность, биомассу и жизнеспособность грибов в верховых торфяниках / А.В. Головченко, Л.М. Полянская // Микробиология. 2001. Т. 70. № 1. С. 96-102.
2. Гузев, В. С. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязненных почв / В.С. Гузев, С.В. Левин, Г.И. Селецкий и др. // Микроорганизмы и охрана почв. - М.: Изд-во МГУ, 1989. С. 121-150.
3. Киреева, Н.А. Биологическая активность нефтезагрязненных почв / Н.А. Киреева, В.В. Водопьянов, А.М. Мифтахова. - Уфа изд-во «Гилем», 2001. 376 с.
4. Кураков, А.В. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях / А.В. Кураков, В.В. Ильинский, С.В. Котелевцев, А.П. Садчиков. - М.: Из-во «Графикон», 2006. 336 с.
5. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в почвах и донных отложениях методом ИК-спектрометрии. ПНД Ф16.1:2.2.22-98. - М. 1998.
6. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под. ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1991. 304 с.
7. Тулянкин, Г.М. Экологические основы оптимизированной технологии восстановления нефтезаг-рязненных природных объектов на Севере / Г.М.
Тулянкин, И.Б. Арчегова, Ф.М. Хабибуллина и др. - Сыктывкар, 2007. 140 с.
MICROBIOTA OF SALTED MEADOW-CHESTNUT SOILS OF STAVROPOL REGION AT OIL POLLUTION AND BIORECULTIVATION
© 2011 I.Z. Ibatullina1, Yu.A. Vinogradova2, F.M. Habibullina2
1 Moscow State University named after M.V. Lomonosov, Moscow 2 Institute of Biology of KSC UrB RAS, Syktyvkar
In article ways of restoration the petropolluted salted meadow-chestnut soils are considered. Results of researches the influence of various doses of oil, age of pollution and way of recultivation on structure and number of ecological-trophic groups, biomass of microorganisms in the salted meadow-chestnut soils are resulted.
Key words: salted soil, petropollution, biological products, microbiota, recultivation
Inna Ibatulina, Post-graduate Student. E-mail: zaitun2003@mail.ru Yuliya Vinogradova, Candidate of Biology, Research Fellow at the Soil Science Department. E-mail: vinogradova@ib.komisc.ru Flyuza Khabibullina, Doctor of Biology, Senior Research Fellow at the Soil Science Department. Е- mail: fluza@ib.komisc.ru
