CC BY
82
БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 541.64
Г. В. Надеева, Г. Ю. Яковлева, Р. Э. Хабибуллин, Д. М. Усманова
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АРАБОГРАФИЧЕСКОЙ РУКОПИСИ ИЗ АРХЕОГРАФИЧЕСКОЙ КОЛЛЕКЦИИ ОТДЕЛА РЕДКИХ РУКОПИСЕЙ БИБЛИОТЕКИ КАЗАНСКОГО ФЕДЕРАЛЬНОГО УНИВЕРСИТЕТА
Ключевые слова: арабографическая рукопись, биоповреждение, микроорганизмы, бактерии, микроскопические грибы.
Используя классические методы микробиологии, была проанализирована араборгафическая рукопись второй половины XIX века. 82% из выделенных микроорганизмов составляли бактерии. Наиболее часто встречаемыми микромицетами являлись представители родов Penicillium, Aspergillus и Alternaria, обладающие целлюлазной активностью.
Keywords: arabographic manuscript, biodegradation, microorganisms, bacteria, microscopic fungi.
The arabographic manuscript of the second half of the XIX century was analyzed by using classical methods of microbiology. 82% of the isolated microorganisms were bacteria. The most common microscopic fungi were species of the genera Penicillium, Aspergillus and Alternaria, which have cellulase activity.
Введение
На протяжении второй половины ХХ столетия археографические экспедиции выступали одним из важнейших каналов, по которым происходило пополнение рукописных коллекций научных библиотек страны. Традиция археографических экспедиций была заложена еще в 1920-е годы (С. Вахиди), однако была прервана в 1930-40-е годы. Очевидно, что в условиях массовых репрессий и воинствующей антирелигиозной кампании не могло быть и речи о сохранении рукописного наследия путем его собирания в государственных книгохранилищах. Война и послевоенная разруха также не способствовали подобной работе. Только в период оттепели происходит обращение ученых к духовному наследию народа, предпринимаются попытки путем собирания спасти древние книги и рукописи от гибели. Археографическая экспедиция Казанского университета была инициирована Ф.Ш. Мухамедьяровым и М.А. Усмановым и впервые проведена в 1963 году. М.А. Усманов выступал ее фактическим организатором и руководителем с середины 1960-х гг. и вплоть до конца 1980-х гг., пройдя за эти годы путь научного взросления от аспиранта до проректора Казанского университета. На рубеже 1980-1990-х гг. он передал экспедиционные дела своему ученику, доценту З.С. Миннуллину. За эти годы благодаря археографическим поискам рукописное собрание Отдела редких рукописей и книг Научной библиотеки КФУ (ОРРК НБЛ КФУ) пополнилась почти на десять тысяч рукописей и несколько тысяч старопечатных книг.
Одна из экспедиций 1987 года была организована в Горьковскую область (Сергачский район, 6.-27.07.1987), во время которой были обследованы такие крупные татарские села, как
Сергач, Сабачай (Красная горка), Петряксы, Чембелей, Медяны и пр. Всего в ходе экспедиции было собрано не менее 70 рукописей и некоторое количество актовых документов, а также старопечатных книг и газет. Из числа находок особенно выделялись 26 рукописей, подаренных Каримовым Зугди Каримовичем (с. Чембелей) (из личного архива М.А. Усманова). Среди них были арабоязычные рукописи по шариату и исламской философии, а также 3-4 тюркоязычных рукописи, т.н. «шакирдских тетрадей». «Тетради шакирдов» -особый тип рукописей, которые составлялись учениками медресе. Несмотря на внешне «непрезентабельный» вид, они многожанровые и чрезвычайно богаты содержанием. Здесь и молитвы по разным случаям, образцы и черновики писем, шуточные песни, баиты и манаджаты, любовные стихотворения и исторические предания и пр. [1]. В числе подаренных Зугди Каримовым рукописей (практически все они датируются началом и серединой XIX века) в одной встречаются списки стихотворного цикла «Егет жырлары», а также неизвестные ранее стихотворения Габдул джаббара Кандалый (1797 - 1860).
Найденные во время экспедиций рукописи хранились в крайне неблагоприятных условиях: на чердаках, в подвалах и сараях, что, конечно, пагубно сказалось на их состоянии. Рукописи, подвергавшиеся длительному воздействию влаги, перепадам температур, хранящиеся в закрытых помещениях сильно пострадали. Влажность, запыленность, отсутствие проветривания - все это способствовало активному развитию
микроорганизмов. Микробиологические
исследования древних книг и в том числе и рукописных памятников проводятся в самых разнообразных архивах и книгохранилищах всего мира [2, 3, 4, 5]. Целью данной работы является
микробиологический анализ арабографической рукописи половины XIX века.
Экспериментальная часть
Объектом исследования является арабографическая рукопись второй половины XIX века, подаренная З. Каримовым и хранящаяся в фонде ОРРК НБЛ КФУ (рис. 1). Книга написана на арабском языке, русской бумаге, в картонно-кожаном переплете с использованием цветной бумаги.
Рис. 1 - Арабографическая рукописная книга второй половины XIX века
Методы отбора и анализа проб. Пробы отбирали с поверхности переплетов и бумаги с помощью стерильных ватных тампонов. Посев осуществляли в чашки Петри на поверхность агаризованных питательных сред и в жидкую среду. Так же анализировали небольшие кусочки переплета и бумаги. При анализе бактериального загрязнения использовали мясо-пептонный агар (МПА), микроскопических грибов - подкисленную среду Чапека. Высев производили в не менее чем в трех повторностях. Посевы инкубировали при 280С в течение 2 суток (бактерии) и 5-7 суток (микромицеты). Данные выражали в виде средних величин с расчетом среднеквадратичных отклонений.
Состав среды Чапека (г/л): дист. вода - 1 л; NaNO3 - 2.0; KH2PO4- 1.0; MgSO4 • 7H2O - 0.5; KCl - 0.5; FeSO4 - 0.01; сахароза - 30.0; агар - 20.0.
Идентификацию микроскопических грибов и бактерий проводили на основании их морфолого-культуральных свойств, используя определители «Определитель токсинобразующих микромицетов» [6], «Определитель патогенных и условно патогенных грибов: справочное издание» [7], «Определитель бактерий Берджи» [8].
Световую микроскопию проводили на микроскопах PrimoStar, CarlZeiss.
Определение целлюлазной активности. Наличие целлюлазной активности у выделенных изолятов определяли качественным методом. Накопительные культуры выращивали в пробирках с селективной средой Гетчинсона. После посева на дно пробирки опускали полоску стерильной фильтровальной бумаги, не содержащей крахмал. Полоска бумаги на 3-5 см выступала над средой. О целлюлазной активности судили по степени гидролиза фильтровальной бумаги.
Визуально оценивали изменение субстрата при росте на целлюлозе по 5-бальной системе: 1 балл (+) - обнаружено прорастание отдельных спор; 2 балла (++) - слабый рост мицелия, отсутствие разрушенных участков целлюлозы; 3 балла (+++) -обильный рост мицелия в виде ветвящихся гиф; 4 балла (++++) - рост грибов виден отчетливо, хорошо развитый мицелий обволакивает целлюлозный субстрат; 5 баллов (+++++) -визуально отмечается деградация субстрата.
Результаты и их обсуждения
При визуальном осмотре исследуемой нами рукописи были отмечены повреждения насекомыми и микроорганизмами. На поверхности рукописи обнаружены небольшие точечные черные колонии, а так же белый плотный налет на корешках книг.
Количественный анализ колонеобразуещих единиц показал, что 82±3 % из всех выделенных микроорганизмов составляли бактерии. Они образовывали колонии как на МПА, так и на среде Чапека. При микроскопировании они, как правило, имели палочковидную форму, часто объединенные в цепочки по 2-3 клетки, некоторые клетки содержали эндоспоры (рис. 2). Основная масса бактерий имела грамположительный тип строения клеточной стенки. 96 % изолятов выделенных бактерий были отнесены нами к роду Bacillus. Анализ их гидролитической активности показал, что 65±4 % изолятов обладали целлюлазной активностью.
При микроскопировании жидкости с фрагментами поврежденной бумаги рукописей в некоторых пробах наблюдалось большое количество спор микромицетов (рис. 3). Однако при последующем посеве не все эти споры оказались способными к прорастанию на агаризованных средах.
Используя классические методы микробиологии, нам удалось выделить изоляты различных микромицетов, которые по морфологическим признакам были
идентифицированы вплоть до родовой принадлежности. Результаты анализа и соотношение различных родов микромицетов на переплете и бумаге представлены на рисунке 4. Наиболее часто встречаемыми являлись представители класса Deuteromycetes родов Pénicillium, Aspergillus и Alternaria.
Рис. 2 - Морфология бактериальных клеток из колонии культуры, высеваемой с поврежденных участков бумаги рукописи. Световая микроскопия
Рис. 3 - Споры микроскопических грибов в поле зрения светового микроскопа
Следует отметить, что не все микромицеты на поверхности рукописей сохраняют свою жизнеспособность. Известно, что культивируемые микроорганизмы составляют не более 0.5-3.9% от общей микрофлоры [9]. Показано, что применение только классических микробиологических методов, основанных на стратегии выращивании микроорганизмов на питательных средах, не дают полной картины о микробном разнообразии объектов [10]. Использование молекулярно-биологических методов, и в первую очередь полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволили выделить новые таксоны микромицетов, участвующие в биодеградации старинных картин и других документов [11]. Использование ПЦР, гель-электрофореза в денатурирующих условиях, получение библиотеки клонов позволили итальянским ученым исследовать микробные консорциумы, населявшие древнюю рукопись, датируемую 1293 г. [12]. Анализ последовательностей ДНК подтвердил наличие микромицетов и бактерий, которые не могли быть выделены и идентифицированы классическими микробиологическими методами. Анализ выделенных видов микроорганизмов показал наличие высокого содержания среди них осмофильных и тонофильных видов, то есть способных расти при высокой концентрации соли в среде и условиях низкой влажности соответственно.
а
12 3 4
микромицеты
Рис. 4 - Соотношение разновидностей микроскопических грибов, выделенных с поверхности бумаги (а) и переплета (б) арабографических рукописных книг. Рода: 1 -Pénicillium; 2 - Aspergillus; 3 - Alternaria; 4 -остальные микромицеты
Грибковые и бактериальные сообщества могут развиваться на книгах аналогично сообществу деструкторов в природных условиях. Колонизация и биодеградация книг предполагает обязательное участие целлюлозолитических организмов, поскольку только эти виды могут использовать целлюлозу как питательный субстрат и переводить его в низкомолекулярные и неорганические формы, доступные для других микроорганизмов. Предполагается, что ключевую роль в биодеградации целлюлозы играют различные микроскопические грибы [13, 14, 15].
При ненадлежащем хранении и использовании старинные рукописи подвергаются естественному биологическому воздействию. Причем серьезное повреждение бумаги икожи происходит не только за счет механического разрастания мицелия микроскопических грибов, а в значительной степени обусловлено воздействием ферментов [16].
Оценку целлюлазной активности выделенных нами микромицетов проводили по интенсивности их роста на фильтровальной бумаге (табл.). Для большинства микроскопических грибов первоначально отмечался рост в жидкой, а в дальнейшем - в воздушной фазе. Многие виды активно росли в виде тяжей мицелия, активно обволакивая волокна фильтровальной бумаги (Penicilliumsp.I и II; Mucorsp., Aspergillussp.I и II, Alternaría sp.). Для микромицетов рода Penicillium отмечалось дезагрегация волокон фильтровальной бумаги, Mucorsp. приводил к ее распаду. Cladosporumsp. проявлял средний рост мицелия с активны спороношением в водной фазе. Известно. что многие виды Aspergillus^ РетсШштобладают высокой целлюлозолитической активностью [17, 18]. Кроме того, целлюлазная активность присуща и многим видам бацилл, что делает их основным источником новых целлюлозолитических ферментов для промышленного применения [19].
Таблица 1 - Оценка целлюлазной активности выделенных изолятов по интенсивности роста на фильтровальной бумаге
№ Микромицет Рост в баллах
1. Penicillium sp. I +++++
2. Penicillium sp. II ++++
3. Aspergillus sp. I ++++
4. Aspergillus sp. II ++++
5. Alternaria sp. +++++
6. Mucor sp. +++++
7. Cladosporum sp. +++
Примечание: I - микромицеты, выделенные с поверхности бумаги; II - микромицеты, выделенные с поверхности кожаного переплета.
Следовательно, все выделенные нами микромицеты обладают целлюлазной активностью, что в свою очередь может привести к дальнейшему разрушению рукописной книги.
Таким образом, применение классических микробиологических методов, основанных на выделении культур микробных изолятов с
поверхности поврежденных рукописей, позволило нам выявить микробное сообщество, состоящее главным образом из спорообразующих бактерий и микромицетов. Выделенные виды микромицетов относятся к рр. Penicillium, Aspergillus, Alternaria и др. Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество выявляемых колониеобразующих единиц и разнообразие видов, населяющее исследуемую рукопись, невелико. Это может быть обусловлено тем, что в настоящее время данная рукопись хранится в условиях низкой влажности и температуры, подавляющих рост микроорганизмов, и многие виды потеряли жизнеспособность и представлены некультивируемыми формами. Однако ухудшение условий хранения (перепады температуры, увеличение влажности,
дополнительное загрязнение) могут вызвать активацию этих форм и быть причиной дальнейшей деградации бумаги и переплета писменного памятника. Анализ литературных данных и результаты собственных исследований позволяют сделать заключение о необходимости использования дополнительного набора питательных сред для выделения более широкого спектра культивируемых форм микробных сообществ. Кроме того, необходимо применение молекулярных методов индикации микроорганизмов, населяющих древние рукописи.
Работа выполнена в рамках проекта РФФИ № 13-06-97069-р.
Литература
1. М.А.Усманов По следам рукописей (записки археографа). Казань, 1984. С. 113-140.
2. A.Michaelsen, G.Pinar, F.Pinzari. Microb. ecol., 60, 69-80 (2010).
3. S. Roussel, G. Reboux, L. Millon, M.D. Parchas, S. Boudih, F. Skana, M. Delaforge, M.S. Rakotonirainy, Indoor Air.,22, 6, 514-522 (2012).
4. K.Zielinska-Jankiewicz, A.Kozajda, M.Piotrowska, I.Szadkowska-Stanczyk, Ann. Agric. Environ. Med, 15, 1, 71-78 (2008).
5. Zotti M, Ferroni A., Int.Biodeterior.Biodegrad., 62, 2, 186-194 (2008).
6. В.И.Билай, З.А. Курбацкая Определитель токсинобразующих микромицетов. Наукова Думка, Киев, 1990, 236 с.
7. Д.Саттон Определитель патогенных и условно патогенных грибов: справочное издание Пер. с англ. Мир, Москва, 2001, 486 с.
8. Дж.Хоулт, Н.Криг Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Мир, Москва, 1997.
9. A.Harkawy, R.L.Gorny, L.Ogierman, A.Wlazlo, A. Lawniczek-Walczyk, A. Niesler,Ann Agric Environ Med., 18, 2, 323-329 (2011).
10. N.S.Lord, C.W.Kaplan, P.Shank, C.L.Kitts, S.L.Elrod. FEMS Microbiol Ecol, 42, 327--337 (2002).
11. A.Michaelsen, G.Pinar, F.Pinzari. Microb. ecol., 60, 69-80 (2010).
12. C.Schabereiter-Gurtner, G.Pinar, W.Lubitz, S.Rolleke, J Microbiol Methods, 45, 77-87 (2001).
13. M.Zotti, A.Ferroni, Int.Biodeterior. Biodegrad., 62, 2, 186-194 (2008).
14. B.Zyska, Int. Biodeterior. Biodegrad., 40, 43-51 (1997).
15. Е.Л.Пехташева, А.Н.Неверов, Г.Е.Заиков,
0.В.Стоянов. Вестник Казанского технологического университета, 15, 8, 222-233 (2012).
16. Е.Л.Пехташева, А.Н.Неверов, Г.Е.Заиков, С.А.Шевцова, Н.Е.Темникова. Вестник Казанского технологического университета. Т. 15,8,192-199 (2012).
17. A. Das, T. Paul, S. Halder, K. Maity, C. Das, P.K. Mohapatra, B.R. Pati, K.C. Mondal, Pol. J. Microbiol, 62,
1, 31-43 (2013).
18. M.Camassola, A.J.Dillon, J Appl.Microbiol., 103, 6, 2196204 (2007).
19. A.Amore, O.Pepe, V.Ventorino, L.Birolo, C.Giangrande, V. Faraco, FEMSMicrobiolLett, 339, 2, 93-101 (2013).
© Г. В. Надеева - инж. каф. биотехнологии К(П)ФУ, galinadeeva@yandex.ru; Г. Ю. Яковлева - к.б.н., доц. каф. микробиологии К(П)ФУ, yakovleva_galina@mail.ru; Р. Э. Хабибуллин - к.т.н., доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, hrustik@yandex.ru; Д. М. Усманова - д.и.н., проф. каф. истории России и стран ближнего зарубежья К(П)ФУ, dusmanova2000@mail.ru.
