CC BY
80
УДК 615.838.7
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И БИОМЕДИЦИНСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ПЕЛОИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ
АКТИВИРОВАННОЙ ЛЕЧЕБНОЙ ГРЯЗИ
С.В. МУРАДОВ
Научно-исследовательский геотехнологический центр ДВО РАН,
Северо-восточное шоссе, 30, Петропавловск-Камчатский, Россия, 683002, e-mail: [email protected]
Аннотация. Приводятся данные о возможности извлечения грязевых экстрактов, пелоидных препаратов, обладающих преимуществами в медицинском применении. Грязевые препараты являются аналогами грязевого раствора как по химическому составу, так и по биологической активности, связанной с потенциальным лечебным действием. Описаны методы получения пелоидного препарата. До отделения грязевого экстракта осуществляется активирование лечебной грязи на основе ее обводнения, перемешивания, нагрева. Разработка препаратов контролирует их физико-химическое состояние, микробиологические свойства и тестологические свойства по раздражающему и ранозаживляющему действию. Водный экстракт лечебной грязи по своим физико-химическим свойствам близок к грязевому раствору нативной грязи: по составу сульфатный, натриевокальциевый, слабоминерализованный со слабокислой или нейтральной реакцией среды. Дается микробиологическая характеристика грязевого препарата. Исследование всех серий препарата, показало, что их общая микробная обсемененность оказывалась не выше 300 колониеобразующих единиц на миллилитр препарата. Установлено, что водный экстракт лечебной грязи не обладает раздражающим на кожные покровы лабораторных животных действием, в системе in vitro оказывает угнетающее действие на S. aureus, K. pneumoniae. Препарат обладает более выраженным антибактериальным воздействием на кишечную палочку.
Ключевые слова: лечебная грязь, пелоид, экстрагирование, раствор, прогрев, минерализация, активация, микроэлементы, бактериостатичность, антибактериальность, ранозаживление, раздражение.
MICROBIOLOGICAL PROPERTIES AND BIOLOGICAL TESTING OF PELOID DRUGS FROM ACTIVATED MUD
S.V. MURADOV
Scientific Research Geotechnological Center FEB RAS, 683002, Russia, Petropavlovsk-Kamchatskiy, Severo-vostochnoe s., 30,
e-mail: [email protected]
Abstract. This paper provides the data about the capability of recovery of the mud extracts, peloid products which have advantages in medical application. Mud preparations are analogues of mud solution as the chemical composition and biological activity associated with a potential therapeutic agent. The methods used in producing of peloid preparation are described. The activation of medical mud based on it watering, mixing, heating realizes before separate of mud extract. Development of drugs control of their physicochemical, microbiological properties and test properties irritating and wound healing action. The water extract of medical mud is similar to mud solution of native mud by its physiochemical properties: sulphate, sodium-calcium composition, weakly mineralizated with weakly acid or neutral pH. The microbiological feature of mud preparation is VELG. A study of all the series of the drugs showed that their total microbial colonization was not above 300 colony-forming units per milliliter of the drug. It was established that water extract of medical mud has not irritate activity to laboratory animals skin, has an influence upon S. aureus, K. pneumonia oppress activity in the system of in vitro. Preparation has more expressed antimicrobial activity to E.coli.
Key words: therapeutic mud, peloid, extraction, solution, heating, mineralization, activation, trace elements, bacteria statics, antibacteria, wound healing, stimulation.
Экстрагируемые из лечебной грязи жидкие грязевые препараты представляют собой, частично извлеченное содержимое отдельных элементов грязевого раствора [3]. За счет сохранения факторов биологической активности лечебной грязи, пелоидные препараты могут успешно использоваться во внекурортном грязелечении, расширяя показания к лечению [2,4,5].
Цель исследования - описание методики получения пелоидного препарата, его физико-химические, микробиологические и биомедицинские свойства.
Методика получения препарата включает контроль качества лечебной грязи по кондициям свойств, утвержденным для месторождения озеро Утиное Камчатского края Российским научно-исследовательским центром реабилитации и физиотерапии (№ 14/776 от 16.12.91 г.). Непосредственно перед началом работ определяется рН и влажность грязи. Содержание патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов контролировалось периодическими ис-
следованиями пелоида в грязехранилище. Химическое и микробиологическое загрязнение в процессе приготовления препарата предотвращалось: УФ-облучением помещения (воздуха), мытьем и обработкой посуды и емкостей 70% этиловым спиртом.
Микробиологические свойства препарата водного экстракта лечебной грязи (ВЭЛГ) исследовались по содержанию микроорганизмов в самом препарате, а также по его воздействию на развитие культур патогенных и условнопатогенных бактерий различных систематических, морфологических, физиологических, биохимических групп - кокки, бациллы (палочки), капсулообразующие, спороносные, грамположительные, грамотрицательные: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli.
Биомедицинское тестирование пелоидного препарата ВЭЛГ, осуществлялось по следующим параметрам:
1. раздражающее действие препарата на кожные покровы;
2. ранозаживляющее действие препарата при механическом повреждении и ожоге.
Основополагающим принципом получения пелоид-ного препарата из лечебной грязи оз. Утиное является водное экстрагирование грязе-иловой массы. Грязе-иловая масса с влажностью 69-79% смешивается с дистиллированной водой в соотношении 1:2 при непрерывной механической активации и подогреве до 25°С. Длительность экстрагирования составляет 15 часов. Описанная методика, до отделения жидкой фазы грязи, обозначается нами как активация, в связи с усилением механизмов самоочищения, повышением биохимической и микробиологической активности грязевого раствора [1]. Полученная смесь подвергается центрифугированию в течение 20 минут при режиме работы центрифуги - 5 тыс. оборотов в минуту. К твердой фазе, после отделения жидкой фазы грязи, добавляется такое же количество дистиллированной воды и проводится вторичная экстракция в течение 6 часов, при той же температуре (25°С). Первый и второй экстракты объединяют и после проведения через бактериальный фильтр составляют выход готового продукта - ВЭЛГ.
Получаемый нами препарат в макрохимической основе является аналогом активированного грязевого раствора, то есть представляет собой тот же лечебный субстрат при его контакте с поверхностью тела пациента, во время грязелечебных процедур. Такой подход к получению пело-идного препарата соответствует рекомендациям, предложенным В.Т. Олефиренко [3].
Важно отметить, что этап технологии переработки грязи до отделения жидкой фазы - грязевого экстракта, представляет собой ускоренный процесс регенерации и самоочищения грязи, повышение уровня ее биологической активности в связи с обогащением грязевого раствора в процессе экстракции за счет прогрева, механической активации и участия автохтонного микробного сообщества.
С физической точки зрения препарат ВЭЛГ представляет собой прозрачную, слегка опалесцирующую жидкость с незначительной минерализацией, слабокислой или нейтральной реакцией рН. В процессе хранения препарата ВЭЛГ формируется желто-коричневый осадок, происходит сдвиг рН в кислую сторону.
Минеральный состав водного экстракта представлен семью макрокомпонентами: по катионам - натрий, калий, кальций, магний; по анионам - сульфат, гидрокарбонат, хлорид. Их среднее соотношение в различных сериях получения препаратов выражается формулой:
Ыа6\СаЪ6
Из всего вышеизложенного можно заключить, что полученный нами водный экстракт лечебной грязи по своим физико-химическим свойствам близок к грязевому раствору нативной грязи: по составу сульфатный, натриевокальциевый, слабоминерализованный со слабокислой или нейтральной реакцией среды.
Учитывая санитарно-бактериологическое неблагополучие лечебной грязи месторождения озеро Утиное, восстанавливающего оптимум микробиологических кондиций после мер, стимулирующих самоочищение и регенерацию, представляется актуальной микробиологическая характеристика препарата ВЭЛГ. Исследование всех препаратов, полученных нами на основе водного экстрагирования, прогрева и механической активации, показало, что их общая микробная обсемененность оказывалась не выше 300 колониеобразующих единиц на миллилитр препарата.
Исследование коли-титра показало, что препараты,
полученные по стандартной технологии, без бактериальной фильтрации, стабильно имеют величину титра более 300 мл. Титр-перфрингенс составляет более 0,1 мл. В связи с достаточной чистотой препарата по содержанию микробов большие объемы не рассматривались.
Антимикробные свойства исследуемого препарата определяли методом серийных разведений в жидкой питательной среде (МПБ). Готовили ряд пробирок, в которые разливали по 1 мл МПБ. В первую пробирку вносили раствор препарата без МПБ. Во вторую, в которой содержался 1 мл МПБ, вносили 1 мл исследуемого препарата, из второй пробирки 1 мл переносили в третью, из третьей в четвертую и т.д. до 6 пробирки, т.е. получали разведение (от 1/2 до 1/64). Последняя пробирка не содержала препарат, служила контролем. В бульоне готовили суточную взвесь агаровой культуры исследуемых микроорганизмов (1 млрд. микробных кл./мл). Взвесь микроорганизмов добавляли таким образом, чтобы в каждой пробирке содержалось 108 микр. кл./мл. Пробирки инкубировали в термостате в течение 30, 60 и 150 минут. Из каждого разведения делали посевы на МПА. В качестве тест-микробов использовали музейные культуры S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, B. cereus.
Проведенные исследования позволили установить следующее. Согласно полученным данным, препарат ВЭЛГ не оказывал бактерицидного действия на B. cereus. В исходной концентрации препарат подавляет рост S. aureus и K. pneumoniae. Так, через 30-150 минут отмечались единичные колонии этих микроорганизмов на МПА. Препарат оказывал наиболее существенное действие на E. coli. Так, через 30 минут наблюдался рост единичных колоний E. coli на МПА из исходной концентрации препарата и при разведении 1/2. Спустя 60 минут количество колоний, выросших на МПА, также резко снижалось до единичных колоний, выросших в исходной концентрации и разведениях 1/2 и У препарата. Вместе с тем, через 150 минут после посева, наблюдалось отсутствие роста E. coli на МПА из исходного раствора изучаемого препарата. Уменьшение числа выросших колоний кишечной палочки отмечалось и при меньшей концентрации исследуемого препарата - 1/2, 1/4. Однако, начиная с разведения 1/8 и более, уменьшение количества колоний кишечной палочки, выросших на МПА, не происходило.
Таким образом, изученное вещество водного экстракта лечебной грязи (препарата ВЭЛГ) в системе in vitro оказывает угнетающее действие на S. aureus, K. pneumoniae. Кроме того, полученные данные по изучению препарата показали, что исследуемое вещество обладает более выраженным антибактериальным воздействием на кишечную палочку.
В экспериментах по биомедицинскому тестированию использовались белые беспородные крысы весом 100-150 г с равным соотношением особей по полу, а также взрослые кролики 2-2,5 кг. Численность животных в каждой наблюдаемой группе составляла 10 крыс и 10 кроликов.
При изучении раздражающего действия водного экстракта лечебной грязи, препарат ВЭЛГ наносился на латеральную часть тела животных путем наложения марлевых тампонов размером 3*5 см, смоченных изучаемой субстанцией. Время воздействия было определено в 30 минут. В контрольных группах животных для нанесения использовалась дистиллированная вода. Наблюдение осуществлялось в течение трех недель. Критерием оценки изменений являлось покраснение (гиперемия), отек, сыпь - другие проявления реакции раздражения.
Ранозаживляющее действие препарата ВЭЛГ изуча-
лось путем удаления кожного лоскута с подлежащими тканями до мышцы размером для крыс - 1*1 см, для кроликов - 2*2 см. Операции проводились под наркозом, введение в который достигалось сомбревином и эфиром. Животные были разбиты на 3 группы наблюдения, в первой группе к ране прикладывался марлевый тампон, смоченный пело-идным препаратом, во второй группе - тампон, смоченный облепиховым маслом, в третьей группе раны накрывались сухим тампоном.
При изучении действия препарата ВЭЛГ на ожоговое повреждение кожных покровов, ожог площадью 1-3 см2 вызывался металлическим предметом, нагретым до температуры 150°С, с выдерживанием на поверхности тела животных - 50 секунд. Аналогично предыдущему тесту, были сформированы 3 группы наблюдаемых животных (крыс и кроликов). В первой группе на ожоговую рану накладывался тампон, смоченный пелоидным препаратом, во второй группе на раны животных воздействовали тампоном, смоченным облепиховым маслом, в третьей группе - прикладывался сухой тампон.
Наблюдения осуществлялись до полного заживления ран. Эффективность действующих факторов оценивалась по времени уменьшения раневого дефекта, качеству заживания, цитологическим исследованиям экссудата.
Тестирование биомедицинских свойств препарата ВЭЛГ осуществлялось по раздражающему действию на кожные покровы, ранозаживляющему действию на механические и ожоговые повреждения кожи лабораторных животных. Сосредоточенность тестов по воздействию на наружные покровы объясняется соответствующей формой применения препарата в виде компрессов, примочек, промываний.
При изучении раздражающего действия препарата, смоченные марлевые тампоны наносились на латеральную часть тела крыс (10) и кроликов (10), такой же численности контрольной группе животных прикладывались сухие тампоны (или тампоны, смоченные дистиллированной водой). Длительность воздействия в опыте и контроле составляла 30 минут. Наблюдения в течение трех недель не выявили никаких изменений кожных покровов. Таким образом, было установлено отсутствие раздражающего действия препарата.
Многолетнее применение препарата в физиотерапевтической практике подтвердило результаты этого теста. В единичных случаях кожная реакция отмечалась при повышенной величине силы тока электрофоретического применения препарата. Такой артефакт избегается соблюдением инструкции при проведении электрофоретических процедур, а также снижением величины тока при повышенной чувствительности пациентов.
Ранозаживляющее действие препарата изучалось воздействием на механическое повреждение кожи 10 крыс и 10 кроликов. При этом производилось удаление кожного лоскута с прилежащими тканями до мышцы, размером для крыс 1*1 см, для кроликов 2*2 см. Операции проводились под наркозом, введение в который достигалось сомбреви-ном и эфиром. По этой методике были сформированы три группы. В первой группе на рану прикладывался марлевый тампон, смоченный изучаемой субстанцией, во второй группе - смоченный облепиховым маслом, в третьей группе раны накрывались сухим тампоном. Наблюдение осуществлялось до полного заживления ран. Эффективность оценивалась по времени уменьшения раневого дефекта, качеству заживления, а также цитологически по анализу экссудата (мазков). Цитологические препараты окрашивались по стандартной гематологической методике азур-эозином.
Существенных отличий в 1 и 2 группах в закрытии раневого дефекта не отмечено. По мере формирования эпителия происходило оттеснение струпа. Полное закрытие раневого дефекта в 1 и 2 группах по длительности заживления практически происходило с одинаковой интенсивностью в течение 5-7 дней. Причем у кроликов процесс заживления опережал аналогичные изменения у крыс на 1-2 дня.
Цитологические исследования мазков экссудатов раневой поверхности выявляли нейтрофильные лейкоциты, макрофаги. Единичные гистиоциты обнаруживались на 23 день заживления.
При исследовании мазков экссудатов ран 1 и 2 групп животных кокковые микроорганизмы (возбудители гнойных инфекционных процессов) не наблюдались.
В контрольной группе животных в первую неделю развивался гнойно-воспалительный процесс. Раны неравномерно покрывались кровянисто-фибринозным струпом отдельными островками, чередующимися с гнойнонекротическими массами. У всех животных наблюдалась серозная экссудация. Цитологические исследования экссудата выявляли кокковую флору на 2-3 день заживления, большое количество нейтрофилов, макрофагов, эритроцитов. Единичные гистиоциты обнаруживались на 5-6 день заживления. Сухим струпом у основной группы животных (75%) рана закрылась через две недели. 25% животных (2 кролика, 3 крысы) имело осложнения, затянувшие заживление еще на 5-7 дней.
Тест ранозаживляющего действия препарата ВЭЛГ при его сравнительном изучении с облепиховым маслом показали его одинаковую эффективность с признанной ранозаживляющей субстанцией - облепиховым маслом. Существенных различий в проявлении реакции заживления у крыс и кроликов не было выявлено. Различие в длительности заживления опытных 1 и 2 групп опережали контрольную группу на 1,5 недели с достижением лучших результатов - эпителизации в опыте, в отличие от сухого струпа в контроле.
При исследовании препарата по его воздействию на ожоговую рану были сформированы 3 группы, аналогично предыдущему эксперименту, с включением в каждую группу 10 крыс и 10 кроликов. Животным опытных групп наносилось ожоговое повреждение приложением металлической поверхности площадью 1 см2 для крыс и 3 см2 для кроликов, нагретой до температуры 150°С. Длительность воздействия устанавливалась в 50 секунд. Процедура экспериментального ожога осуществлялась под наркозом с применением сомбревина и эфира.
В первой группе животных ожоговая поверхность покрывалась тампоном, смоченным препаратом ВЭЛГ, во второй группе тампоны смачивались облепиховым маслом, а в третьей прикладывались сухие тампоны. Длительность наблюдений во всех группах составляла 2 недели. Критерием оценки процесса восстановления поврежденного участка кожи явилось полное заживление. Цитологические наблюдения ран оказались не информативны, т.к. не содержали клеточных элементов, за исключением единичной кокковой флоры, наблюдаемой в экссудатах 3 (контрольной) группы животных.
Заживление в 1 и 2 группах животных было завершено к концу первой недели. В контрольной группе не полное заживление с сухим струпом наблюдалось через 2 недели. Существенных осложнений в этой группе не наблюдалось. Ожоговый тест ранозаживляющего действия препарата ВЭЛГ обнаруживает уровень его активности, соответствую-
щий облепиховому маслу - эффективному средству при лечении ожогов.
Разработка пелоидных препаратов на основе лечебной грязи озера Утиного определила оптимальную технологию получения препарата ВЭЛГ, включающую длительный прогрев, перемешивание, разжижение грязи, заимствованные как факторы, стимулирующие регенерационные способности грязи. По физико-химической характеристике препарат ВЭЛГ - это жидкость кислой или нейтральной реакции, слабоминерализованная, по составу соответствующая грязевому раствору. Важнейшими биомедицинскими свойствами препарата ВЭЛГ является его антибактериальное действие по отношению к гноеродным коккам и бактериям кишечно-тифозной группы, ранозаживляющее действие при ожогах и механических повреждениях кожи. Таким образом, препаративная форма грязи не только лишена загрязняющего параметра, но и обладает выраженным антибактериальным действием, обусловленным экстрактивными веществами активированной лечебной грязи.
Литература
1. Мурадов, С.В. Экологическое решение проблем современного грязелечения / С.В. Мурадов.- Петропав-ловск-Камчатский: КамГУ им. В. Беринга, 2007.- 266 с.
2. Мурадов, С.В. Пути решения экологического неблагополучия лечебной грязи / С.В. Мурадов, В.Д. Чертова // Научное обозрение.- № 4.- 2006.- С. 15-18.
3. Олефиренко, В.Т. Водотеплолечение / В.Т. Олифе-ренко.- М.: Медгиз, 1986.- 287 с.
4. Холопов, А.П. Грязелечение / А.П. Холопов, В.А. Шашель, Ю.М. Перов, В.П. Настенко.- Краснодар: Периодика Кубани, 2002.- 284 с.
5. Щегольков, А.М. Применение гряземинеральных ванн в комплексной медицинской реабилитации раненых на санаторном этапе / А.М. Щегольков, В.П. Ярошенко,
Э.А. Копылов, А.М. Амиров // Физиотерапия, бальнеология и реабилитация.- № 3.- 2009.- С. 3-5.
References
1. Murado, SV. Ekologicheskoe reshenie problem sovre-mennogo gryazelecheniya. Petropavlovsk-Kamchatskiy: Kam-GU im. V. Beringa; 2007. Russian.
2. Muradov SV, Chertova VD. Puti resheniya ekologi-cheskogo neblagopoluchiya lechebnoy gryazi. Nauchnoe obo-zrenie. 2006;4:15-8. Russian.
3. Olefirenko VT. Vodoteplolechenie. Mosocw: Medgiz; 1986. Russian.
4. Kholopov AP, Shashel' VA, Perov YuM, Nastenko VP. Gryazelechenie. Krasnodar: Periodika Kubani; 2002. Russian.
5. Shchegol'kov AM, Yaroshenko VP, Kopylov EA, Amirov AM. Primenenie gryazemineral'nykh vann v kompleksnoy meditsinskoy reabilitatsii ranenykh na sanatornom etape. Fizi-oterapiya, bal'neologiya i reabilitatsiya. 2009;3:3-5. Russian.
УДК: 547.857: 547.79: 615.31] : 615.252.349.2 : 599.323.4
ВЛИЯНИЕ НОВЫХ СОЛЕЙ 2-((5-((1,3-ДИМЕТИЛ-2,6-ДИОКСО-2,3-ДИШДРО-1Н-ПУРИН-7(6Н)-ИЛ)МЕТИЛ)-4-ФЕНИЛ-4Н-1,2,4-ТРИАЗОЛ-3-ИЛ)ТИО)АЦЕТАТНОЙ КИХОТЫ НА УРОВЕНЬ САХАРА В КРОВИ КРЫС В ТЕСТЕ ТОЛЕРАНТНОСТИ К
ГЛЮКОЗЕ
Е.С. ПРУГЛО, А.С. ГОЦУЛЯ, А.И. ПАНАСЕНКО, Е.Г. КНЫШ
Запорожский государственный медицинский университет, пл. Маяковского, 26, Запорожье, Украина, 69035,
e-mail: andrey [email protected]
Аннотация. Одним из наиболее распространенных эндокринных заболеваний в мире и в частности в Украине является сахарный диабет. Определенную проблему в лечении этого заболевания составляют осложнения, и не всегда лекарственная терапия обеспечивает снижение риска развития микро- и макроангиопатии, что служит основной причиной высокой летальности.
Целью нашего исследования был фармакологический скрининг гипогликемической активности впервые синтезированных солей 2-((5-((1,3-диметил-2,6-диоксо-2,3-дигидро-1Н-пурин-7(6Н)-ил)метил)-4-фенил-4Н-1,2,4-триазол-3-ил)тио)ацетатной кивоты.
Экспериментальные исследования проведены на белых нелинейных крысах. Гипогликемическое действие солей 2-((5-((1,3-диметил-2,6-диоксо-2,3-дигидро-1Н-пурин-7(6Н)-ил)метил)-4-фенил-4Н-1,2,4-триазол-3-ил)тио)ацетатной кивоты оценивали с помощью внутрибрюшинного теста толерантности к глюкозе который воспроизводили путем нагрузки животных глюкозой в дозе 2 г/кг от массы тела крысы. Содержание глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом с использованием глюкометра «Accu Chek Active». Препарат сравнения с гипогликемическим действием избран глибенкламид в дозе 5 мг / кг. Установлено что соединения, которые изучаются и препарат сравнения по-разному изменяли уровень глюкозы в крови крыс. Значительным гипогликемическим действием обладала кальциевая соль 2-((5-((1,3-диметил-2,6-диоксо-2,3-дигидро-1Н-пурин-7(6Н)-ил)метил)-4-фенил-4Н-1,2,4-триазол-3-ил)тио)ацетатной кислоты (ГКП-240) на 36,22% (р =0,004), что на 18,72% менее активно, чем референт- глибенкламид (снижение уровня глюкозы на 54,94%, р =6,640'5).
Ключевые слова: производные 1,2,4-триазола, ксантин, гипогликемическое действие, диабет.
