CC BY
140
УДК 616.31:579]:001.8
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ПЕРИОДОНТИТА, ВЫЗВАННОГО БАКТЕРИЯМИ, ОБРАЗУЮЩИМИ БИОПЛЕНКУ
Колчанова Н.Э., Окулич В.К.
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», г. Витебск, Республика Беларусь
Аннотация. В современных концепциях патогенеза заболеваний периодонта, вызванных условно-патогенными бактериями, значительное внимание уделяется способностью микроорганизмов образовывать биопленку. Цель исследования - оценить способность микроорганизмов периодонтального кармана образовывать бактериальные сообщества и определить степень разрушения их экзополимерного матрикса антисептиками и ферментами. Материалы и методы. С помощью разработанных методов культивирования и исследования, микробных биоплёнок изучены свойства 83 клинических изолятов, выделенных от пациентов с хроническим периодонтитом. Результаты. Определен более высокий уровень продукции биопленки среди изолятов одонтогенного происхождения у Streptococcus mutans и эпидермального стафилококка (р>0,05). С помощью предложенной экспериментальной модели установлено, что среди антисептиков и ферментов наиболее сильно разрушает биопленку 25% диметил-сульфоксид и гиалуронидаза 1а типа.
Ключевые слова: биопленка, микрофлора, ферменты, антисептики, болезни периодонта
В настоящее время в Республике Беларусь распространенность болезней периодонта в возрастной группе 35-44 года остается высокой и колеблется по данным эпидемиологических исследовании" различных авторов от 92,5 ± 2,95 % до 100 % [1].
В последние десятилетия постепенно на смену концепции планктонных форм микробного возбудителя заболеваний периодонта пришли теории ассоциации микробных сообществ -биоплёнок (БП). Многие аспекты функционирования данной многоуровневой системы, их поразительная устойчивость к физическим и биохимическим воздействиям [2], до сих пор остаются не изученными.
Цель исследования. оценить способность микроорганизмов периодонтального кармана образовывать бактериальные сообщества и определить степень разрушения их экзополимерного матрикса антисептиками и ферментами.
Материалы и методы. С целью изучения продукции биопленки бактериями периодонтального кармана было обследовано 89 пациентов с хроническим периодонтитом и 25 практически здоровых лиц, от которых выделено и идентифицировано 83 клинических изолята.
Для определения способности изолятов к образованию БП был использован разработанный ранее метод с применением 96-луночного полистиролового пластикового планшета [3]. Для пересчета единиц оптической плотности в вес микробной БП в мкг на одну лунку 96-луночного планшета, использовалась следующая формула:
Х= 226,28* [Е оптическая плотность пробы Еоптическая плотность
] 1,2755 контроля]
Биопленки получали после культивирования в течение 3 суток, используя клинический изолят S. oralis выделенный от пациента с хроническим периодонтитом.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью пакета прикладных таблиц "Statistica" (Version 10, StatSoft Inc., США).
Результаты исследования. Установлено, что большинство возбудителей хронического периодонтита способны формировать биоплёнки (таблица 1).
Таблица 1
Качественные и количественные характеристики способности бактерий периодонтального кармана формировать биопленку
Микроорганизм n Масса БП Ме (LQ - UQ), мкг/лунку min max % бактерий не образующих БП
Streptococcus oralis 26 9,6 (6,11-12,3) 1,34 35,1 19
S. mutans 3 10,8 (9,5-16,8) 9,5 22,9 0
S. sanquis 11 8,7 (4,9-16,1) 3,3 27,9 36,4
S. mitis 10 6,9 (5,5-10,2) 2,9 15,5 10
S. anginosus 7 8,7 (5,2-11,9) 4,8 20,5 28,6
G. morbillorum 7 6,3 (3,71-4,2) 2,3 38 14,3
L. lactis 6 5,4 (4,9-5,8) 4,8 20,5 33,3
S. epidermitidis 13 10,3 (8,1-11,3) 5,3 11,8 23
С использованием разработанной модели изучено действие наиболее часто используемых антисептиков на матрикс БП S. oralis, меченый Конго красным (таблица 2).. Антисептики, у которых не было выявлено активности, в таблицу не включены: септомирин (мирамистин), хлор-гексидин биглюконат 0,05%, гипохлорит натрия 3%, фурацилин и йодиксин. Также была исследована способность аскорбиновой кислоты и аце-тилцистеина разрушать матрикс БП. Активность препаратов составила 0,13±0,02 и 0,42±0,04 мкг/мл соответственно.
Таблица 2
Способность антисептиков к разрушению экзополимерного матрикса биопленки S. oralis
Антисептик М±с, мкг/мл
Диметилсульфоксид 25% 20,47±0,84
Перекись водорода 3% 0,158±0,01
Цетилпиридиния хлорид 0,23±0,02
Хлоргексидин биглюконат 2% 0,05±0,02
ацетилгексозаминидных связей гиалуроновой кислоты в составе БП. Высокую способность к разрушению матрикса БП продемонстрировал нормальный человеческий альбумин, среди про-теолитических ферментов -протеиназа К, ее уровень активности зависит от содержания белков в матриксе биопленки.
Для оценки способности антисептиков, ферментов расщеплять экзополимерный матрикс БП использован, разработанный ранее метод [4]. Для пересчета единиц оптической плотности в мкг/мл выделенного Конго-красного использовалась формула:
Х=(0,101 + 11,04*[Е оптическая плотность пробы Ео
-'опти-
ческая плотность контроля
])
2
Среди изученных микроорганизмов имеются как продуцирующие (от 76,7% L. lactis до 90% S. mitis), так и нет биопленку, за исключением S. mutans (100% продуцирующих изолятов). Наибольшим уровнем продукции биопленки обладают Streptococcus mutans и эпидермальный стафилококк (уровень продуцируемой массы биопленки колеблется также в широких пределах от 1,34 до 178,4 мкг/лунку), однако различия по сравнению с другими видами изученных микроорганизмов недостоверны (р<0,05).
Представляется важным определить какие ферменты, особенно присутствующие в биологических жидкостях человека способны расщеплять матрикс БП (таблица 3). Наибольшую способность к разрушению матрикса БП S. oralis продемонстрировала гиалуронидаза 1а типа, эта активность, вероятно, связана с гидролизом P-N-
Таблица 3
Способность ферментов к расщеплению экзополимерного матрикса биопленки S. oralis
Фермент М±с, мкг/мл
Альбумин (0,1 мг в пробе) 3,1 ±0,41
Трипсин (bovine pancreas) 0,37 ±0,06
Пепсин (человеческий) 0,14 ±0,029
Альфа-амилаза (porcine pancreas) 0,12 ±0,08
Гиалуронидаза 1а (тестикулярного типа) 1,66 ±0,2
Гиалуронидаза Ша (стрептококковая) 0,1 ±0,04
Лизоцим (human) 0,013±0,012
Пероксидаза (horseradish) 0,054 ±0,06
Протеиназа К (tritrachium album) 2,26 ±0,07
Рибонуклеаза (bovine pancreas) 0,014±0,011
ДНКаза I типа 0,18 ±0,1
Ферменты, которые показали наибольшие значения активности при расщеплении БП S. oralis, были исследованы в комбинации для выявления их возможного сочетанного применения
(таблица 4). Из полученных данных следует, что при комбинации ферментов происходит снижение их активности.
Таблица 4
Влияние комбинации ферментов на способность расщеплять экзополимерный матрикс биопленки S. oralis
Фермент М± с, мкг/мл
ДНКаза I + Гиалуронидаза 1а типа 0,45±0,02
Протеиназа К + Гиалуронидаза 1а типа 0,31±0,01
Протеиназа К + -ДНКаза I 0,13±0,02
Протеиназа К + Гиалуронидаза 1а типа + ДНКаза 0,086±0,02
Выводы: Установлено, что среди изученных микроорганизмов имеются как продуцирующие (от 76,7% L. lactis до 90% S. mitis), так и нет биопленку, за исключением S. mutans (100% продуцирующих изолятов). Наибольшим уровнем продукции биопленки обладают Streptococcus mutans и эпидермальный стафилококк (уровень продуцируемой массы биопленки колеблется также в широких пределах от 1,34 до 178,4 мкг/лунку), однако различия по сравнению с другими видами изученных микроорганизмов недостоверны (р<0,05).
С помощью предложенной экспериментальной модели биопленки, меченой Конго красным, обнаружено, что среди антисептиков, широко распространенных в клинической практике, наиболее эффективен в отношении биопленки, образованной S.oralis, 25% диметилсульфоксид, активность которого проявляется в первые секунды взаимодействия, Среди исследованных ферментов наибольшая активность наблюдалась
у гиалуронидазы 1а типа, оптимальное время экспозиции 20 с.
ЛИТЕРАТУРА
1. Манак Т.Н. Микрофлора полости рта и ее роль в развитии заболеваний периодонта // Стоматол. журн. 2012. Т. 13. №3. С. 178-181.
2. Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Кончакова Е.Д., Лазарева А.В., Чистякова В.П. Антибиотикоре-зистентность биоплёночных бактерий // Клин. микро-биол. антимикроб. химиотер. 2012. Т. 14. № 1. С. 5158.
3. Метод лечения гнойных ран мягких тканей, вызванных возбудителями, способными формировать биоплёнку: инструкция по применению №076-0714, утв. Министерством здравоохранения Республики Беларусь от 10.09.2014 г. / Витебск. гос. мед. ун-т, авт.-сост. В.И. Петухов, В.К. Окулич, В.П. Булавкин, А.А. Кабанова, Ф.В. Плотников. - Витебск: ВГМУ 2014. -10 с.
4. Окулич В.К., Сенькович С.А., Плотников Ф.В., Кабанова А.А. Оценка способности сывороток крови, иммуноглобулинов G пациентов с гнойно-воспали-
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 28 ~
тельными процессами и ряда ферментов к разрушению экзополимерного матрикса биопленок // Хирургия. Восточная Европа. 2014. №3 (11). С. 9-17.
MICROBIOLOGICAL ASPECTS OF CHRONIC PERIODONTITIS, CAUSED BY BIOFILM-FORMING BACTERIA
Kolchanova N.E., Okulich V.K.
Vitebsk State Medical University, Vitebsk, Republic of Belarus
Annotation. The modern concepts of the pathogenesis of diseases caused by opportunistic bacteria pay considerable attention to the microbial ability to form biofilms. The objectives of the research is to evaluate the ability of opportunistic bacteria to create microbial communities, i.e. biofilms, to establish their influence on wound infections and to assess the destructive capacity of antiseptics, enzymes exopolymeric biofilm matrix. Methods. By means of the developed methods for biofilm study, 83 clinical isolates of bacteria from patients with periodontal diseases were investigated. Results. The significantly higher biofilm production was determined for Streptococcus mutans and Staphylococcus epidermidis species residing in oral cavity (р>0,05). In conditions of our experimental model, dimethylsulfoxide was found to be the most efficient in biofilm disruption amongst the all studied antiseptics; the similar effects were also demonstrated for 1а type hyaluronidase.
Keywords: biofilm, bacterial microflora, enzymes, antiseptic agents, periodontal disease.
REFERENCES
1. Manak T.N. Oral microflora and its role in the development of periodontal diseases // Stomat. journal. 2012, vol. 13, №3, pp. 178-181.
2. Chebotar I.V., Mayansky A.N., Konchakova E.D., Lazareva A.V., Chistyakova V.P. Antibiotic resistance of biofilm-forming bacteria // Clin. mikrobiol. antimikrob. himioter. 2012, vol. 14, № 1, pp. 51-58.
3. The method of treatment of purulent wounds of soft tissues caused by pathogens that can form a biofilm:
instruktsiya po primeneniyu №076-0714, utv. Ministry of Health of the Republic of Belarus from 10.09.2014. / Vitebsk state med. un-t, avt.- sost. V.I. Petuhov, V.K. Okulich, V.P. Bulavkin, A.A. Kabanova, F.V. Plotnikov. - Vitebsk: VGMU 2014. - 10 p.
4. Okulich V.K., Senkovich S.A., Plotnikov F.V., Kabanova A.A. Evaluation of blood serum immunoglobu-lin G in patients with purulent-inflammatory processes and a number of enzymes in the destruction of the biofilm matrix // Surgery. Eastern Europe. 2014, №3 (11), pp. 917.
