CC BY
92УДК 615.281:579 (075.8)
А.Э. Габидова1, О.В. Гунар2, А.В. Гарабаджиу3, В.А. Галынкин4
Введение
Лекарственное растительное сырье (ЛРС), составляющее основу фитопрепаратов, по своему происхождению является более контаминировано микрофлорой, чем синтетические препараты и является наиболее вероятным переносчиком спор микроорганизмов и конидий грибов. Микробная контаминация растений зависит от окружающей среды (почва, воздух, вода). На растениях и внутри них может быть найдено широкое разнообразие бактериальных микроорганизмов, грибов, дрожжей и вирусов, а также загрязнения от грызунов и насекомых. Неизбежно, этот микробиологический фон зависит от многих экологических факторов и оказывает важное воздействие на полное качество ЛРС и препаратов на его основе. Поэтому оценка риска микробного загрязнения лекарственных растений стала важным предметом в учреждении современной системы Анализа рисков и Критического точек контроля (НАССР).
Следовательно, медицинские растения содержат широкий спектр микроорганизмов с различными отдельными свойствами и со значительными различиями относительно качественных аспектов. Микробный фон растений - результат ряда влияний, вызванных источниками живой и неживой природы, и микробными загрязнителями легко передавае-
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ОБСЕМЕНЁННОСТЬ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
Центра внедрения инновационных медицинских и фармацевтических технологий Российского научно-исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова, г. Москва, ул. Островитянова, 1
Научный центр экспертизы средств медицинского применения МЗ РФ, 127051, Москва, Петровский бульвар, д. 8
Санкт- П етербургски й государственн ый технологический институт (технический университет) 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., д. 26
ЗАО «НИИ»РОСБИО»
192019, г. Санкт-Петербург, ул. Мельничная, 12 литер А
Фармацевтические заводы могут сталкиваться с большим количеством микробных загрязнителей, которые представлены бактериями, грибами и вирусами. Микробная контаминация зависит от ряда экологических факторов и оказывает влияние на качество растительной продукции и препаратов. Степень загрязнения обычно зависит от расстояния растения до почвы. Определенные растения (например, аир, мелисса, тимьян, базилик, сладкий укроп и т.д.) содержат естественные природные вещества, которые проявляют ингибиторный эффект на рост микроорганизмов и на стабильность при хранении, что было оценено приблизительно на 1400 образцах растений и трав.
Ключевые слова: микробиологический риск, лекарственное растительное сырье
мыми через воздух и с почвой [1]. Растения имеют субстратную (корни) и надземную часть, что необходимо учитывать при анализе их микробной обсемененности. Субстратная часть находится в почве и непрерывно контактирует с почвенными микроорганизмами (грибы, актиномицеты, бактерии), вирусами и фагами, которые могут проникать в корни или колонизировать поверхность корней. Надземная часть растений постоянно контактирует с микроорганизмами и они могут оседать с пылью и водными каплями. Состав воздушной микрофлоры может периодически изменяться при изменении ветра, а так же зависит от наличия промышленных предприятий.
При производстве лекарственных средств из растительного сырья важную роль играет не только контроль исходных материалов, условий хранения и переработки, но и его происхождение (предыстория). Важными факторами, влияющими на качество растительного сырья, и соответственно, определяющими дальнейшее качество и эффективность при применении, являются агрофитопоказатели (агро-фон), выбор культуры, условия выращивания, сбора и сушки. Эти факторы могут оказать влияние и на стабильность готового продукта. Постоянство свойств и неизменности микрофлоры растений определены так же внешними факторами,
1 Габидова Альфия Эркиновна канд. фарм. наук, зав. отделом доклинических и клинических исследований Центра внедрения инновационных медицинских и фармацевтических технологий Российского научно-исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова,; e-mail: pharminnovate@gmail.com
2 Гунар Ольга Викторовна, д-р фарм. наук, нач. лаб. микробиологии Научный центр экспертизы средств медицинского применения МЗ РФ, e-mail: Gunar@expmed.ru
3 Гарабаджиу Александр Васильевич, д-р хим. наук, профессор, проректор по научной работе СПБГТИ(ТУ), e-mail: gar-54@mail.ru
4 Галынкин Валерий Абрамович д-р техн. наук, профессор, зам. генерального директора по науке ЗАО «НИИ»РОСБИО», 192019, г. Санкт-Петербург, ул. Мельничная, 12 литер А, e-mail: 7731254@mail.ru
Дата поступления - 7 ноября 2013 года
которые происходят из-за естественных, сельскохозяйственных, экологических и технологических влияний. Бактериальные эндоспоры и грибковые конидии могут быть расценены как две доминирующие группы. Предварительные исследования показали, что микрофлора растений может включать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы и этот факт особенно ограничивает использование этих растений, помимо снижения качества, вызванного порчей. Кроме того, по аналогии со специями и травами, используемыми в пище, не может быть исключен факт присутствия в некоторых препаратах загрязнений от грызунов, насекомых и неорганических источников (например, камни).
В связи с вышеприведенным необходимо проводить оценку микробиологических рисков лекарственных средств растительного происхождения.
Согласно Государственной Фармакопеи XII изд. (ГФ XII изд.) лекарственные растительные средства в зависимости от способа применения разделены на категории 4А и 4Б. Для них установлены пределы допустимых микробиологических норм для определенных групп микроорганизмов общее число бактерий (ОЧБ) и общее число грибов (ОЧГ), Escherichia coli, Salmonella, энтеробактерии) [2].
В данном исследовании представлены результаты микробиологической обсемененности различных лекарственных растений и готовых фитопрепаратов, что послужило основой анализа микробиологического риска фитосырья и фитопрепаратов.
Материалы и методы
Объектом изучения являлось отечественное лекарственное растительное сырье (ЛРС) в пачках, брикетах, фильтр-пакетах, а также в виде настоев, отваров (приготовленных по приложенной рецептуре).
Исследование микробиологической чистоты проб ЛРС осуществлялось чашечным агаровым двухслойным методом, регламентированным ГФ XII изд., путем параллельного культивирования посевов в аэробных и анаэробных условиях с использованием регламентируемой среды № 1 [2]. По результатам культивирования определяли численные значения - ОЧБ, выросших в аэробных и в анаэробных условиях, а о пригодности сырья судили по большему значению ОЧБ и превышению максимально допустимых уровней [2, 3].
Определение возможности присутствия Clostridium perfringens в ЛРС проводили путем культивирования проб в анаэробных условиях с использованием селективной среды для роста клостридий, в соответствии с методом, рекомендуемым Европейской фармакопеей [4].
Микологический анализ нестерильных лекарственных средств (НЛС) на наличие дрожжей и грибов проводили при подготовке проб способами, описанными в ФК XII.
Результаты и обсуждение
Исследование микробиологической чистоты жидких лекарственных средств, содержащих этиловый спирт. Жидкие лекарственные средства, изготовленные на основе ЛРС в виде спиртовых извлечений экстрактов, занимают особое место среди лекарственных препаратов.
В 1 мл ГЛС (готовое лекарственное средство) допускается не более 5000 аэробных бактерий и 100 грибов при отсутствии Pseudomonas aeruginosa, Staphilococus aureus Escherichia coli, Salmonella, других кишечных бактерий - не более 100 в 1 г (мл) приведено в ФК XII изд.
В таблице 1 представлены результаты исследований по количественному составу микрофлоры - числу аэробных спорообразующих бактерий и грибов в 1 мл образца.
Таблица 1. Микробиологическая чистота исследованных жидких ^препаратов (в 1 мл)
№ п/п Наименование препарата Содержание этилового спирта, % Количество исследованных серий Среднее число бактерий* Среднее число грибов*
1 Бальзам «Московия» 40 5 37000 менее 10
2 Настойка Аралии 61 5 менее 10 менее 10
3 Настойка Боярышника 65 23 50 50
4 Настойка Валерианы 28 17 700 менее 10
5 Настойка Женьшеня 67 37 11000 менее 10
6 Настойка Зверобоя 36 5 менее 10 менее 10
7 Настойка Календулы 65 29 15000 менее 10
8 Настойка Лимонника 95 11 менее 10 менее 10
9 Настойка Овса 40 5 5000 менее 10
10 Настойка Пиона 35 18 700 50
11 Настойка Перца стручкового 86 3 менее 10 менее 10
12 Настойка Пустырника 64 30 100 менее 10
13 Настойка Чаги 65 8 1400 менее 10
14 Экстракт водяного перца жидкий 64 6 менее10 менее 10
15 Экстракт Левзеи жидкий 62 11 менее 10 менее 10
16 Экстракт Родиолы розовой жидкий 34 6 менее 10 менее 10
17 Экстракт Элеутерококка 33 24 500 1000
18 Эликсир грудной 14 6 500 менее 10
19 Эликсир «Демидовский» 40 10 менее 10 менее 10
20 Настойка Полыни 70 5 менее 10 менее 10
Примечание: *Погрешность не превышает 10%. Бактерии сем. Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, S. aureus не были обнаружены ни в одном из исследованных образцов.
НЛС не оказывали ингибирующего действия на рост кишечных бактерий, синегнойной палочки, патогенного стафилококка и грибов. Только 4 препарата - Эликсир грудной, Настойка календулы, Настойка валерианы и Экстракт водяного перца (жидкий) обладали антимикробным действием в отношении грамположительных спорообразующих палочек в разведении 1:10. В связи с этим для испытания на микробиологическую чистоту использовали разведения 1:50 и 1:100.
Представленные материалы свидетельствуют о достаточно высоком качестве исследованных образцов по показателю «Микробиологическая чистота». Из 20 наименований в 8-ми микроорганизмы выделены не были. Уровень
микробной загрязненности бальзама «Московия», Настойки Женьшеня, Настойки Календулы, Экстракта Элеутерококка превышал допустимые требования. Микробная обсеменен-ность остальных образцов не превышало допустимые показатели.
Следует отметить, что даже наличие 70 %-ного этилового спирта не ингибирует рост спорообразующих бактерий, что подтверждено высевами на чашки Петри. Качество жидких лекарственных средств, содержащих этиловый спирт, в первую очередь, зависит от качества растительного сырья, на основе которого готовят препараты, а также от технологического процесса и условий производства и в меньшей степени от концентрации этилового спирта.
Исследование микробиологической чистоты лекарственного растительного сырья. ЛРС представляют собой особую фармакологическую группу. Всего было исследовано 200 образцов лекарственного растительного сырья и лекарственных средств на его основе, 118 серий 76 наименований, полученных от 18 отечественных производителей. Было исследовано качество 50 лекарственных растительных препаратов и 20 жидких лекарственных средств от разных производителей, содержащих этиловый спирт в концентрации от 14 % до 95 % (настоек, жидких экстрактов, эликсиров, бальзамов и др.)
Известно, что некоторые факультативные анаэробные микроорганизмы, а также микроаэрофилы проявляют рост в анаэробных условиях и медленнее растут в аэробных (в частности, кишечная палочка, протей, группа микроаэрофильных стрептококков). При первичной инициации культур они дают лучший рост в анаэробных условиях.
В таблице 2 представлены данные о качестве лекарственных растительных препаратов, причем доля выявленного брака составляет 0,8 %, в других препаратах содержание микроорганизмов находится на верхнем пределе допустимых норм, что подтверждает необходимость строжайшего соблюдения условий хранения подобных препаратов во избежание развития бактерий и грибов.
Спорообразующие микроорганизмы, способны начать активно развиваться в лекарственных средствах при их хранении, или в организме пациента, причем этот процесс может протекать как в аэробных, так и в анаэробных условиях. В ряде исследований показано, что анаэробные микроорганизмы широко распространены в окружающей среде следовательно, опасность попадания их в лекарственные средства довольно высока. Спорооб-разующие анаэробы отличаются высокой степенью выживаемости. Актуальность представляет более глубокое изучение анаэробной микробиоты лекарственных средств в связи с тем, что:
- они представляют большую опасность для здоровья человека из-за наличия у них токсигенных и аллергенных свойств;
- значительная жизнеспособность споро-образующих анаэробных микроорганизмов;
- широкое распространение в окружающей среде отдельных представителей анаэробных микроорганизмов и опасность попадания их в лекарственные средства.
Анаэробные микроорганизмы в лекарственных средствах (ЛС) в настоящее время не идентифицируются. Только в Европейской и Британской фармакопеях представлен метод количественного определения Clostridium perfringens, как одного из наиболее патогенных и распространенных анаэробов-контаминантов. Данный метод подтверждает отсутствие патогенных клостридий в тех случаях, когда этого достаточно [4].
Clostridium perfringens широко распространена во внешней среде (вода, почва), где она по преимуществу является сапротрофом, но может вызывать различные заболевания. В почве, пыли помещений Clostridium perfringens встречается почти в 100 % исследованных проб, в воздухе предприятий обнаруживается в 10-12 % случаев, на оборудовании - почти в 30 % случаев, на санитарной одежде работников - 11-19 % случаев [5]. Clostridium perfringens условно-патогенная, энтеротокси-генная бактерия, является наиболее частой причиной возникновения токсикоинфекций при употреблении пищевых продуктов. В пищевой промышленности для нее установлены нормы по содержанию и обязателен ее контроль. Разработан ряд ГОСТов по выявлению и определе-
нию количества анаэробных микроорганизмов. Clostridium perfringens отнесена в IV группу патогенности микроорганизмов-возбудителей заболеваний человека [6].
Таблица 2. Микробиологическая чистота лекарственных растительных препаратов.
Общее Общее число бакте-
число рии в 1 г
Виды лекарственного растительного сырья бактерий аэробное куль-тиви-рова-ние в 1 г Общее число грибов в 1 г Наличие Е.соН в 1 г Анаэробное культи-вирова-ние Clostridium perfring ens
Цветки (6 наименований) 114 103 -107 103 -106 менее 100 103 - 108 101 -102
серий
Плоды (9 102 -107 102 -104
наименова-ний)124 менее 100 102 - 108 -
серии
Травы (16наимено ваний) 264 104 -107 103 -108 менее 100 102 - 108 101 -102
серии
Листья (10 104 -107 102 -105
наименований) 171 менее 100 102 - 107 101
серий
Корни и
корневища (7 наименований) 103 -107 102 -104 менее 100 102 - 108 102
76 серий
Кора (2 наименования) 44 104 -107 103 -104 менее 100 102 - 105 -
серий
Фитопре-
параты
промыш-
ленного
производ-
ства
Из данных таблицы 2 видно, что уровень микробиологической чистоты плодов, коры, корней и корневищ, как правило, не превышал допустимых пределов. Микробиологическая чистота листьев, травы, цветов превышала допустимые нормативы менее, чем в 1 % случаев. Количественное содержание аэробных мезофильных бактерий находилось в пределах 102 - 107 КОЕ/г, что не превышало допустимого предела. С другой стороны, количество аэробных бактерий на верхнем допустимом пределе (107 кОе/г ) находится в цветках в 36 % исследованных образцов, в плодах - в 20 %, в травах - в 31 %, в листьях - в 22 %, в корнях, корневищах и коре - в 7 %, в коре - в 7 %.
E. coli и Salmonella sp. не были обнаружены, количество других кишечных бактерий превышало 100 КОЕ/г только в листьях шалфея, траве чистотела и эрвы шерстистой. Количественное содержание грибов находилось в пределах 102 - 108 КОЕ/г, причем нормы были превышены лишь в цветках бессмертника песчаного, траве чистотела, траве эрвы шерстистой, листьях шалфея. Следует заметить , что количество грибов находилось на верхнем допустимом пределе (104 КОЕ/г) в цветках в 61 % испытанных образцов, в плодах - в 59 %, в траве - в 78 %, в листьях - в 69 %, в корнях и корневищах - в 43 % и в коре - в 48 %.
Наибольшую опасность при контаминации лекарственного растительного сырья и трудность при определении качества лекарственных средств по показателю
«Микробиологическая чистота» представляли грибы. Нами изучался уровень контаминации грибами различных лекарственных форм (таблица 3), а также различных фармакологических групп препаратов (таблица 4). При изучении уровня контаминации грибами 174 серий жидких, 336 серий твердых, 54 серий мягких форм ЛС установлено, что наиболее контаминированными явились твердые лекарственные формы (таблетки, драже). Жидкие и мягкие препараты находились в одном диапазоне загрязнения дрожжевыми и плесневыми грибами, а именно: 13,2 % и 16,7 % соответственно. Изученный уровень контаминации грибами 568 серий 150 наименований препаратов различных фармакологических групп дает обобщенный результат - 29 % контаминированных ЛС не соответствуют требованиям.
При анализе микробиоты в окружающей среде, примерно в 80 % выявляются анаэробные микроорганизмы, в частности, Ps. aerogenes. Не исключена вероятность нахождения анаэробной бактериальной микрофлоры на лекарственных растениях.
В следующих экспериментах проводили исследования микробиологической чистоты лекарственных растительных препаратов с анализом анаэробных микроорганизмов.
Число проб, в которых общее число микроорганизмов в анаэробных условиях превышало их количество в аэробных составило 43 (28,6 % от общего количества проб).
Наибольшая разница в показателях ОЧБ в аэробных и анаэробных условиях выявлена в пробах цветков и трав, соответственно: в цветках в 12 пробах (66 % от общего количества проб), в травах в 18 пробах (45 % от общего количества проб).
В настоях и отварах, приготовленных по приложенной рецептуре, число проб, в которых в анаэробных условиях количество микроорганизмов превышало их количество в аэробных составило 10 (20 % от общего количества проб).
В некоторых случаях ОЧБ при анаэробном культивировании превосходит величину ОЧБ полученную при аэробном культивировании. В этих случаях при анаэробном культивировании обеспечивается рост аэробной и анаэробной микрофлоры. Разница между данными величинами будет соответствовать количеству анаэробных микроорганизмов.
ОЧБш = ОЧБт - ОЧБаэ ОЧБан - общее число микроорганизмов, выросших в анаэробных условиях; ОЧБ аэ - общее число микроорганизмов, выросших в аэробных условиях; ОЧБ' ан - общее число анаэробных микроорганизмов.
В образцах, в которых наблюдалось присутствие анаэробных бактерий, проводили выращивание на селективной агаризованной питательной среде (материалы и методы). Результаты экспериментов представлены в таблицах 2 и 3. Clostridium perfringens присутствуют в лекарственном растительном сырье, но отсутствуют в готовых лекарственных формах приготовленных в промышленных масштабах. Это свидетельствует о том, что промышленные технологии, связанные с тепловой обработкой сопровождаются гибелью Clostridium perfringens.
Таблица 3. Количество исследованных проб, находящихся на верхнем пределе допустимых норм по ОЧБ и превышающих допустимый предел _с учетом аэробного и анаэробного культивирования
Виды лекарственных растительных средств Кол-во пр верхнем (% от о п об с ОЧБ на пределе 5щ. кол-ва зоб) Кол-во проб с ОЧБ, превышающим допустимый предел (% от общ. кол-ва проб)
Аэробные условия Анаэробные условия Аэробные условия Анаэробные условия
ЛРС (150 проб) 1 (0,6%) 13 (8,6%) 7 (4,6%) 2 (1,3%)
Настои и отвары, приготовленные на основе ЛРС (40 проб) нет 2 (5 %) нет 4 (10 %)
Фитопрепараты промышленного производства (25 проб) нет нет нет нет
Количество проб, в которых наблюдался бактериальный рост на селективной среде клостридий, составило - 68 (из 150 проб, 45 % от общего количества проб).
При культивировании проб на селективной среде для клостридий, в основном, были обнаружены характерные для Clostridium perfringens колонии: отдельные белые (иногда желтоватые), гладкие, выпуклые или плоские колонии с ровным краем, округлые, диаметром от 0,2 до 1,0 см. При микроскопии были выявлены грамположи-тельные короткие палочки с закругленными концами, одиночные, чаще в цепочках, что также указывает на Clostridium perfringens.
Настои и отвары, приготовленные по приложенной рецептуре, относятся к категории 4А и имеют пределы допустимых норм ОЧБ не более 107 в 1 г (мл) [2]. Известно, что большинство ЛРС используется после термической обработки, в результате которой микробная загрязненность отваров и настоев снижается в среднем на 2 порядка [3]. По результатам исследования настоев и отваров на содержание Clostridium perfringens, 4 пробы из 40 (10 % от общего количества) (с учетом анаэробного культивирования), приготовленных из сырья взятого из аптеки и отвечающего стандартам ГФ XII, характеризуются небольшой вероятностью возникновения токсикоин-фекции.
Видовой состав микроорганизмов-контаминантов лекарственных средств
Другой аспект проблемы микробной загрязненности по нашему мнению - это качественный состав микро-организмов-контаминантов, выделяемых из ЛС. Вопросы наличия тех или иных микроорганизмов напрямую связаны:
- с санитарно-гигиеническим состоянием производства;
- с внедрением и постоянным соблюдением правил GMP на фармацевтических производствах;
- с системой контроля качества, как на производстве, так и в контрольных организациях.
Из НЛС, проконтролированных по показателю «Микробиологическая чистота» нами были выделены аэробные бактерии, в том числе кишечные бактерии и синегнойная палочка, а также дрожжевые и плесневые грибы.
Особенности микробного роста на плотных питательных средах оценивали по величине, форме, характеру контура края, рельефу, поверхности, цвету, структуре, консистенции. На жидких питательных средах оценивали по форме роста: равномерное помутнение, придонный
рост, пристеночныи рост, поверхностный рост в виде пленки разного цвета.
В наших исследованиях среди выделенных аэробных бактерий чаще встречались грамположительные спорообразующие палочки. Бактерии, относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, P. aeruginosa выделялись достаточно редко. Золотистый стафилококк не встречался ни разу. Из грибов в большинстве случаев обнаруживали плесневые грибы из родов Aspergillus, Penicillium, Mucor
[7].
Выделенные культуры плесневых грибов отличались большим разнообразием. Диаметр колоний колебался от 0,5 до 3,0 см и более. Цветовая гамма колоний была весьма разнообразна: бесцветные, белые, беловато-желтоватые, желтые, коричневые, розовые, оранжевые, красные, зеленоватые, фиолетовые, черные и сочетания многих оттенков. Колонии грибов то плоские и ровные, то складчатые, бугристые, в некоторых случаях кратерооб-разные или куполовыпуклые. Поверхность колоний у одних грибов гладкая, кожистая, иногда блестяще-сального оттенка, у других пушистая, бархатистая или мучнистая. Консистенция культур может быть кожистой, плотной, мягкой, тестообразной, слизисто-тягучей, крошковатой. Одни штаммы глубоко внедряются в плотную питательную среду и трудно отделяются, другие - наоборот. Разнообразие колоний определяется видовыми и возрастными особенностями выделенных грибов-контаминантов ЛС, составом питательной среды и условиями выращивания
[8].
Эксперименты демонстрируют разнообразный видовой состав грибов-контаминантов, представленный видами в основном плесневых грибов (таблица 4). Всего было идентифицировано 183 штамма, относящихся к 73 видам грибов из 16 родов, причем лишь 9 относятся к дрожжевым и дрожжеподобным грибам. Среди выделенных плесневых грибов-контаминантов более 60 % относятся к родам Aspergillus и Penicillium, многие из которых известны как потенциальные продуценты микотоксинов.
Таблица ■
Категория ЛС Виды грибов-контаминантов ЛС
Препараты из сырья природного происхождения A.flavus, A.candidus, A.lanosum, A.flavipes, A.ventii, P.capsulatum, P.fellutanum,P.tardum, P.steckii, P.raciborskii, P.gorlenkoanum, P.purpurogenum, P.chermesium, P.herqei, P. wakzmanii, P. verruсosum, Rhodotorula sp., Pichia sp., Cryptococcus laurentii, Aureobasidium pullulans, Alternaria consortiall, Mucor sp., M.strictus, M.racemosus, Rhizopus sp, Botrytis cinerea
Лекарственное растительное сырье A.orysae, A.niger, A.fumigatus, A.candidus, A.chevalieri, A.ustus, A.flavus, P.roseo-purpureum, P.verrucosum, P.meleagrinum, P.asperosporum, P.raciborskii, P.frequentans, P.steckii, P.decumbens, P.diversum, Trichoderma sp., T.hamatum, Mucor sp., M racemosus, Al.consortial, Rhizopus sp., Cladosporium transchelli
Вспомогательные материалы A.flavus, A.ochraceus, P.ochrochoron, P.verrucosum, P.frequentans, P.citrinum, P.asperosporum, P.raciborskii, Al.alternata, Al.solani, Mucor sp., M. racemosus, M.abundans, M.hiemalis, Rhizopus sp., Rh.nigricans, T.harzianum, Fusarium sp., Rhodotorula sp., Geotrichum sp.,Acremonium charticola, Cladosporium cladosporioides.
Поскольку количество НЛС из разных категорий неодинаково, как по числу наименований, так и по числу серий, было определено среднее количество видов грибов на одно наименование в зависимости от категории. Данные таблиц 4 и 5 свидетельствуют о незначительных различиях в количестве видов грибов в пересчете на одно наименование НЛС и сырья. Наиболее контаминирован-ными оказались вспомогательные вещества. Это доказывает необходимость повышенного внимания со стороны микробиологического контроля к анализу вспомогательных веществ на стадии входного контроля на фармацевтических производствах и выбору поставщиков вспомогательных материалов. На основании полученных результатов можно сделать заключение о том, что видовой состав грибов-контаминантов зависит не только от происхождения сырья и вспомогательных материалов, но и от технологического процесса и условий производства. В таблице 5 показано, что в фитопрепаратах обсемененность выше, чем в исходном растительном сырье. Среднее количество видов микроорганизмов в пересчете на одно наименование фитопрепаратов равно 2,0, а лекарственного сырья -1,5.
Таблица 5. Количество выделенных видов грибов в различных ЛС
Категория препарата Кол-во наименований Кол-во выделенных видов грибов Среднее количество видов в пересчете на одно наименование
Препараты из 13 26 2,0
сырья природ.
происхождения
Лекарственное 15 23 1,5
растительное
сырье
Вспомогательные 5 22 4,4
вещества
Кроме вышеописанных данных по обсемененно-сти фитосырья и фитопрепаратов важными параметрами качества препаратов являются данные по изменению об-семененности продукции при длительном хранении. На рисунках 1 и 2 представлены данные по изменению обсе-мененности сырья при хранении в течение 18 месяцев. На рисунке 1 на оси ординат отложен логарифм ОЧБ, а на рисунке 2 на оси ординат отложен логарифм ОЧГ. В основном, следует отметить, что графики имеют тенденцию к уменьшению количества бактерий и грибов в процессе длительного хранения растительного сырья с влажностью не более 5 %.
Рисунок 1. Динамика изменения количества бактерий при длительном хранении.
Зверобои —♦—Чистотел -»-Пустырник ——Череда —Бузина —Жел. сбор №3
10 12 14 16 18 Месяц
Рисунок 2. Динамика изменения количества грибов при длительном хранении.
Выводы:
- Проведенные исследования свидетельствуют о более высоком уровне загрязнения ЛРС, чем уровень, выявляемый регламентированным методом определения ОЧБ. Каждая третья исследуемая проба (30 % от общего количества проб) содержит большее число микроорганизмов, чем то количество, которое выявляется при культивировании только в аэробных условиях.
- Введение дополнительного культивирования в анаэробных условиях, позволяет повысить информативность анализа путем выявления большего числа микроорганизмов в лекарственном растительном сырье без дополнительных затрат на специальные среды для культивирования строгих анаэробов.
- Исследования на выявление клостридий в настоях и отварах показали, что та термическая обработка, которая рекомендуется на упаковках ЛРС не всегда позволяет исключить наличие клостридий в готовой лекарственной форме.
- Полученные данные показали, что при приеме настоев и отваров, приготовленных по приложенной рецептуре из ЛРС, отвечающего стандартам качества, согласно ГФ XII изд., имеется вероятность возникновения кишечных дисфункций микробиологического генеза, а также небольшая вероятность возникновения токсикоин-фекции.
Литература
1. Martínez-Bermúdez A, Rodríguez-de Lecea J, Soto-Esteras T, Vázquez-Estévez C, Chena-Cañete C. Types of microbial contaminants in pharmaceutical raw materials // Rev Latinoam Microbiological. 1991. Apr-Sep. 33(2-3). P. 153157.
2. Государственная Фармакопея XII изд., Т. 2. М.: НЦЭСМП, 2008. С. 193
3. Гунар О.В. Особенности испытания лекарственного растительного сырья на микробиологическую чистоту. // Фармация. 2003. № 3. С. 5-8.
4. European Pharmacopoeia. 5th Ed., 2005. Counsil of Europe, Stras В.А.
5. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. 28.01.2008.
6. ГОСТ 10444.9-88. Продукты пищевые. Метод определения Clostridium perfringens. М.: Изд-во стандартов, 1988. 12 с.
7. Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию. М.: Книжный дом «Университет», 2001. 256 с.
8. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии: уч. пособие для вузов М.: МИЦ Академия, 2005. 880 с.
