CC BY
14Journal of Siberian Federal University. Biology 3 (2009 2) 263-270
УДК 579.68(285.23)
Микробиологическая характеристика открытых вод Байкала
по данным общей численности микроорганизмов
В.В. Максимов*, Е.В. Щетинина
НИИ биологии при Иркутском государственном университете,
Россия 664003, г. Иркутск, ул. Ленина, 31
Received 9.09.2009, received in revised form 16.09.2009, accepted 23.09.2009
В период максимального развития экосистемы проводились сравнительные исследования по определению общей численности микроорганизмов (ОЧМ) в водах Байкала различными методами. Значения ОЧМ в слое 0-10 м варьировали в диапазоне 1032-3434 тыс. по методу Разумова и от 1535 и до 2862 тыс. кл/мл с использованием красителя ДАР.I. В слое 50-100 м колебания ОЧМ незначительные: от 230 до 506 тыс. по прямому методу и от 220 до 590 тыс. кл/мл с использованием DAPI. По данным различных методов определения ОЧМ были получены сходные результаты, характерные для летне-осеннего периода пелагических участков Байкала.
Ключевые слова: общая численность микроорганизмов, эпифлуоресцентная микроскопия, Байкал.
Определение общей численности микроорганизмов в естественных водах остается актуальным и на современном этапе исследований. Широко применяемый в настоящее время в мировой практике водной микробиологии метод учета количества клеток микроорганизмов на мембранных ультрафильтрах обладает погрешностями (Рукина, Бирюзова, 1952; Романенко 1974; 1985). Однако, используя метод прямого подсчета бактерий в олиготрофных водах Байкала, в течение 40 лет были выявлены закономерности функционирования микробных сообществ (Максимова, Максимов, 1989; Максимов и др., 2002; Максимова и др., 2005).
* Corresponding author E-mail address: peterkb@mail.ru
1 © Siberian Federal University. All rights reserved
Все существующие методы определения численности микробных сообществ имеют свои недостатки (Hobbie, Daley, Jasper, 1977). Не лишен недостатков и эпифлуоресцент-ный метод с использованием бактериального фермента (Sameya, Hanashima, 1990), а также люминесцентный метод с использованием акридин-оранжевого (Харламенко, 1984; Hobbie, Ford, 1993). В настоящее время применяют различные методы флуоресцентного окрашивания и подсчета на фильтрах (Ymaguchi Nobuyasu, Nasu Masao, 1998). Краситель DAPI используют для изучения нуклеоидсодержащих клеток микробных сообществ. Этот метод считают одним из перспективных для оценки активной части
бактериопланктона (Копылов, Косолапов, 1998).
В связи с тем, что на Байкале не проводились сравнительные исследования по определению численности микроорганизмов различными методами, целью данной работы было оценить сходимость результатов по определению общей численности микроорганизмов классическими и современными методами.
Материал и методы исследования
В течение 2005-2007 гг. в летне-осенний период в открытых участках Байкала проводились исследования по определению общей численности микроорганизмов. Пробы воды с поверхности на микробиологический анализ отбирали батометром Молчанова, глубинные пробы - батометром Сорокина. Одновременно измеряли температуру и прозрачность воды.
Общую численность микроорганизмов определяли различными методами: методом прямого счета (Разумов, 1931), методом люминесцентной микроскопии с использованием красителя диамидина-4\6-фенил-2-индолдихлоргидрата (DAPI) (Porter, Feig, 1980) и красителя акридина оранжевого. При использовании метода люминесцентной микроскопии пробы воды были использованы поликарбонатные фильтры марки «Nucleopor», которые окрашивали акридином оранжевым 0,015 % на фосфатном буфере при рН 7,0 (Харламенко, 1984).
Общую численность микроорганизмов (ОЧМ) методом прямого учета определяли на мембранных ультрафильтрах марки "Сынпор" с диаметром пор 0,23 мкм. Подсчет бактерий вели под микроскопом МББ-1А с иммерсионным объективом с увеличением в 1350 раз в 20 полях зрения.
Пробы воды для определения ОЧМ с помощью люминесцентной микроскопии
фиксировали профильтрованным безбактериальным формалином так, чтобы конечная концентрация формалина в пробе была 0,2 %. В воронку наливали 1-5 мл пробы, добавляли 50 мкл рабочего раствора DAPI и выдерживали 3-4 мин. После пробы фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Сразу после приготовления препарата производили подсчет микроорганизмов под микроскопом. Для микроскопии использовали световой фильтр с «возбуждающим» излучением 320-380 нм - в этом свете хорошо видны бактерии.
Для статистического анализа применяли метод ^критерия, вычисленный по средним данным (Смагунова, Козлов, 1990).
Результаты и обсуждение
Для характеристики статуса водоема одним из важных показателей является общая численность микроорганизмов. Для характеристики олиготрофных вод Байкала мы параллельно использовали три метода определения общей численности микроорганизмов.
Полученные в 2005 г. результаты показали, что ОЧМ по прямому методу колебалась в Среднем Байкале от 1689 ± 219 до 2914 ± 378 в поверхностном слое и от 1158 ± 150 до 2000 ± 260 тыс. кл/мл на горизонте 7,5-10 м. Численность в слое 0-10 м составляла в среднем 1829 ± 237 тыс. кл/мл. В Северном Байкале ОЧМ варьировала от 1900 ± 247 до 2774 ± 554 в поверхностном слое и от 2032 ± 335 до 2634 ± 342 тыс. кл/мл, составляя в среднем в слое 0-10 м 2385 ± 310 тыс. кл/мл (рис.1).
В осенний период в слое 0-10 м наблюдаются более резкие колебания численности. В это время характерен интенсивный вертикальный водообмен в Байкале (Вер-болов, 1996; Безруков и др., 1998), который способствует неоднородному распределению микроорганизмов в поверхностных слоях. В
3000 -1
2500 -
2000 -
1500 -
ы
¡ч
1000 -
500 -
середина разреза середина разреза б. середина разреза середина разреза
м.Б. Колокольный- Ая - м.Сухинский м.Ижимей-п.Турка Нижнее изголовье
п. Посольское С- Носа-
м. Кочериковский
3500 -| 3000 -2500 -2000 -
о
^ 1500 -
1000 -
500 -
середина разреза середина разреза м. середина разреза с. середина разреза г. п.Сосновка-б. Котельниковский- Байкальское-с. Нижнеангарск -Заворотная м. Омагачан Хакусы м.Немнянка
□ 0 м Ш0,6 S
11 S, S - прозрачность
0
0
Рис. 1. Общая численность микроорганизмов в пелагических водах Байкала, подсчитанная прямым методом (А), методом DAPI (Б)
013031313232013031313232013031313201303031313201303031313201303131310101
результате горизонтальных течений, сгонных и нагонных явлений в слое воды 0-10 м при температуре 8,8-13,1 °С количество микроорганизмов выражается значениями одного порядка.
Максимальное значение ОЧМ, до 3500 тыс. кл/мл, обнаружено на глубине 4 м в районе середины разреза с. Байкальское - Хакусы. Ранее нами было отмечено, что микробиологические показатели в северной котловине Байкала превышают таковые для средней его части (Максимов, 2002).
Небольшие глубины северной котловины служат одним из условий для создания благоприятного температурного и трофического режима в летне-осенний период. Одним из значимых факторов, определяющих более высокий уровень численности бактерий в северной котловине Байкала, является экспорт органического вещества с водами крупных рек, концентрация которых в пересчете на единицу площади значительно превышает таковую в средней и южной частях озера. Усиление роли вышеперечисленных факторов, по-видимому, обеспечивает наличие циркуляционного течения в северной котловине озера, которое формирует естественный гидрологический барьер между двумя котловинами (Шимараев, 1977; Шерстянкин, 1993). Из полученных данных следует, что общая численность микроорганизмов в 1,3 раза выше в Северном Байкале, чем в Среднем. В Среднем Байкале на станции Колокольная - Посольское заметно уменьшение микроорганизмов с глубиной (рис. 1). Определение численности микроорганизмов по DAPI показало, что средние значения численности также в 1,2 раза выше, чем в Среднем Байкале.
Таким образом, оба использованных метода определения численности микроорганизмов дают близкие результаты. Только в двух случаях численность, определенная этими
методами, расходилась в 2 раза. Все различия укладываются в пределы ошибки метода подсчета бактерий, которая экспериментально вычислена для условий Байкала и равна 13 % (Щетинина, 2003).
В 2007 г. при сравнении результатов определения численности с использованием трех различных красителей было установлено, что в 4 % случаев наибольшие показатели отмечены при окраске фильтров эритрозином (табл. 1). Данные ОЧМ, полученные с использованием DAPI и акридина оранжевого, сопоставимы и находились в диапазоне ошибки метода. Во всех трех случаях определения ОЧМ наблюдается достоверное уменьшение численности с глубиной. Увеличение численности на нижней границе эуфотического слоя отмечается при определении тремя методами, что связано, по-видимому, со скачком плотности воды, обусловленным термоклином в это время на этой глубине.
Результаты, полученные тремя методами, хорошо согласуются между собой, что свидетельствует о возможном применении их для условий Байкала.
Результаты статистической обработки данных по общей численности микроорганизмов, определенной прямым методом и методом DAPI, показали, что расхождения между двумя выборками случайны. Таким образом, обе методики дают одинаковые результаты:
t = 1,8 < tst (0,05; 62) = 2,0,
где t - критерий Стьюдента, вычисленный; tst - табличное значение критерия при уровне значимости 0,05 и числе степеней свободы 62.
Результаты исследований в 2006 г. в слое 0-100 м показали четкую картину распределения численности микроорганизмов с глубиной (табл. 2). На всех исследуемых станциях
Таблица 1. Общая численность микроорганизмов (тыс. кл/мл) на биосферной станции №1 (Большие Коты) оз.Байкал в августе 2007 г., учитываемая разными методами
Горизонт, м Красители
DAPI Эритрозин Акридин оранжевый
0 910±118* 997±129 865±112
5 734±95 1010±131 712±92
10 725±94 736±95 680±88
25 486±63 1030±133 468±60
50 874±113 1050±136 838±108
100 662±86 770±100 642±83
150 360±46 400±52 440±57
200 455±59 432±56 434±56
250 414±53 420±54 412±53
* Приведены средние значения (п=10) и стандартные ошибки.
Таблица 2. Общая численность микроорганизмов (тыс. кл/мл) в открытых участках Байкала в сентябре 2006 г.
Место отбора проб Горизонт, м ОЧМ, прямой метод ОЧМ, DAPI Прозрачность, м Т, °С
1 2 3 4 5 6
Середина разреза м. Кадильный - п. Клюевка 0 5 2315±300 1737±225 1492±193 1669±216 11,6 10,9
10 1911±248 2011±261 4,5 10,8
50 242±31 356±46 4,4
100 298±38 245±31 3,9
Середина разреза м. Б. Колокольный - п. Посольское 0 5 2122±275 1420±184 2648±344 1985±258 12,3 12,1
10 1774±230 2039±265 5 5
50 282±36 234±30 3,9
100 357±46 439±57 3,9
Середина разреза о. Кокуй -м. Крестовский 0 5 1807±239 1303±169 1820±236 1870±243 12,4 12
10 1570±204 2389±310 5 4,8
50 318±41 364±47 4
100 303±39 317±41 3,9
Середина разреза бухта Ая-м. Сухинский 0 5 900±117 835±108 951±123 1506±195 13,1 13,1
10 857±111 1009±131 6,5 12,9
50 269±34 338±43 4
100 488±63 220±28 4
Середина разреза м. Сухинский - центр створа пролива Ольхонские Ворота 0 5 10 1198±155 1355±176 1200±156 1445±187 1171±152 1103±143 8,5 12,2 12,1 10,8
50 506±65 490±63 4,6
100 340±44 292±37 4,1
Продолжение табл. 2
1 2 3 4 5 6
Середина разреза м. 0 2526±328 1524±198 9,8
Ижимей-п. Турка 5 2060±267 1063±138 9,6
10 1911±248 1268±164 4,7 8,8
50 444±57 332±43 4,6
100 290±37 385±50 4,1
Нижнее изголовье 0 2222±288 1816±236 10,7
полуострова Святой Нос - 5 2088±271 1344±174 10,1
м. Кочериковский 10 2393±311 1535±199 5,2 8,8
50 230±29 281±36 4,6
100 232±30 327±42 3,9
Середина разреза 0 1470±191 1247±162 8
р. Сосновка- 5 1278±166 1333±173 7,9
бухта Заворотная 10 466±60 663±86 7 7,6
50 417±54 591±76 4,6
100 286±37 285±37 3,8
Середина разреза 0 1700±221 1755±228 10
с. Байкальское - Хакусы 5 1260±163 1330±172 9,7
10 1386±180 1708±222 6 9,7
50 303±39 443±57 3,9
100 313±40 234±30 3,8
Середина разреза г. 0 1453±188 1747±227 9,6
Нижнеангарск - м. Немнянка 5 1652±214 1510±196 8,9
10 1223±158 1470±191 6,5 8,9
50 247±32 313±40 3,7
100 228±29 191±24 3,7
на глубине 50-100 м численность микроорганизмов уменьшается на порядок как по прямому методу, так и с использованием DAPI. Уменьшению численности микроорганизмов соответствует и резкое понижение температуры с глубиной.
По данным различных методов определения ОЧМ были получены сходные резуль-
таты, характерные для позднего периода летнего биологического сезона в пелагических участках Байкала. Метод прямого учета микроорганизмов на мембранных ультрафильтрах, со всеми его недостатками, показал хорошую сходимость результатов и может быть в дальнейшем использован для подсчета микроорганизмов в сравнительных целях.
Работа выполнена при частичной поддержке Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.)» (проект РНП № 2.1.1/2880).
Список литературы
Безруков Л.Б., Буднев Н.М., Максимов B.K, и др. (1998) Свечение водной среды оз. Байкал - инструмент исследования динамики озера. Известия A^ Физика атмосферы и океана, 34(1): 97-103.
Bерболов BÄ Течения и водообмен в Байкале (1996). Bодные ресурсы, 23(4): 413-423.
Копылов A.^, Косолапов Д.Б. (1998) Характеристика различных биотопов Рыбинского водохранилища по общей численности и количеству бактерий, содержащих нуклеоиды. Микробиология, 67(6): 859-864.
Максимова ЭА., Максимов B.K (1989) Микробиология вод Байкала. Иркутск: Изд-во Ир-кут. ун-та, 156 с.
Максимов B.B., Щетинина E.B., Крайкивская ОЗ., Максимов B.K, Максимова ЭА. (2002) Структура микробиоценозов и их активность как основа классификации и мониторинга состояния речных и приустьевых локальных экосистем Байкала. Микробиология, 71 (5): 690 - 696.
Максимова ЭА., Максимов B.K, Максимов B.B. и др. (2005) Состояние микробиально-го планктона Южного Байкала. Свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2005620059.
Разумов A.C (1931) Прямой метод учета бактерий в воде. Сравнение его с методом Коха. Микробиология, 1(2): 131-136.
Романенко B^. (1974) Новый метод определения численности живых бактерий в водоемах и сравнение его с методом Разумова A.C Биология внутренних вод: Инфор. бюл. № 22: 18-21.
Романенко BÄ (1985) Микробиологические процессы продукции и деструкции органического вещества во внутренних водоемах. Л.: Наука, 295 с.
Рукина E.A., Бирюзова BÄ (1952) Метод получения мембранных ультрафильтров для прямого счета, свободных от микробных клеток. Микробиология, 21(1): 60-65.
Смагунова A^., Козлов B.A. (1990) Примеры применения математической теории эксперимента в рентгенофлуоресцентном анализе. Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 230 с.
Харламенко BÄ (1984) Определение численности и биомассы водных бактерий эпифлуо-ресцентным методом с использованием отечественных ядерных микрофильтров. Микробиология, 53(1): 165-166.
Шерстянкин П.П. (1993) Оптические структуры и фронты океанического типа на Байкале. Aвтореф. дис. д-ра физ.-мат. наук. Институт океанологии PAH, 24 с.
Шимараев М.Н. (1977) Элементы теплового режима озера Байкал. Новосибирск: Наука, 147 с.
Щетинина E.B. (2003) Микробиологические критерии формирования и устойчивости чистоты байкальских вод. Aвтореф. дис. канд. биол. наук. Иркутск, 18 с.
Hobbie J.E., Daley R.J., Jasper S. (1977) Use of Nuclepore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. Appl. Environ. Microbiol., 33(5): 1225
Hobbie J.E, Ford T.E. (1993) A perspective on ecology of aquatic microbes. Aquatic Microbiology. An ecological approach. Eds. Ford T.E. Boston: BlackWell Sci Publ., p.1.
Porter K.G., Feig Y. S. (1980) The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnol. Oceanogr. 25: 943-947.
Sameya T., Hanashima M. (1990) Discrimination of bacteria from nonbacterial particles by a bacteriolytic enzyme treatment in fluorescent direct enumeration. 5-th Int. Symp.Microb. Ecol. (ISME 5). Kyoto. Aug. 27 Sept. 1, 1989. Abs. S.1, p 91.
Ymaguchi Nobuyasu, Nasu Masao. (1998) Analyses of aquatic bacteria at a single cell level (Re-vievo). Met. Fac. Pharum. Sce. Osaka Univ, 42, p. 5.
Microbiological Characteristic
of Pelagic Waters of Lake Baikal According to Data
of Total Number of Microorganisms
Vyacheslav V. Maximov and Elena V. Schetinina
Research Center for Biology of Irkutsk State University 3 Lenina st., Irkutsk, 664003 Russia
During the maximal development of Baikal ecosystem comparative researches by definition in water of an aggregate number of microorganisms (TNM) were carried out by various methods. Values of TNM in a layer of 0-10 m varied in a range of 1032-3434 thousand cells./ml on a direct method both from 1535 and up to 2862 thousand cells./ml with use of dye flAPI. In a layer of50-100 m fluctuations of TNM is insignificant: from 230 up to 506 thousand cells/ml on a direct method and from 220 up to 590 thousand cells./ml with use DAPI. According to various methods of definition of TNM similar results, characteristic for the pelagic sites of Baikal in summer-autumnal period have been found.
Keywords: total number of microorganisms, fluorescence microscopy, Baikal.
