CC BY
196
со
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА '
Жуховицкий В. Г.
Городская клиническая больница имени С. П. Боткина, Москва
РЕЗЮМЕ:
В статье представлены основные методы микробиологической диагностики хеликобактери-оза. Показаны сроки и кратность выполнения того или иного диагностического исследования, выбор диагностического метода, тактика отбора, хранение и транспортировка диагностического материала, а также указаны направления развития перспективных методов микробиологической диагностики хеликобактериоза. Одним из таких методов является обнаружение в фекалиях антигенов и фрагментов генома Helicobacter pylori. Ключевые слова: хеликобактериоз, методы диагностики, контроль эффективности эрадика-ционной терапии.
SUMMARY
Main methods of microbiological diagnosis of helicobacteriosis are presented in this article. Time and implementation of the multiplicity of a diagnostic study, choice of diagnostic method, tactic selection, storage and transport of diagnostic material are presented. Also in this article indicated direction of development of promising methods of microbiological diagnosis of helicobacteriosis. One of such method is detecting antigens in faeces and fragments of helicobacter's pylori genome. Keywords: helicobacteriosis, diagnostic techniques, monitoring of the effectiveness of albation therapy.
Хеликобактериоз является инфекционным процессом, этиологически детерминированным бактерией Helicobacter pylori и патогенетически ассоциированным с хроническим гастритом, язвенной болезнью, MALT-лимфо-мой и дистальной (некардиальной) аденокар-циномой желудка. В настоящее время патогенез хеликобактериоза описан достаточно подробно:
изучены пути колонизации желудка пилори-ческим хеликобактером, механизмы его повреждающего действия на слизистую оболочку, характер местного и системного иммунного ответа на хеликобактерное инфицирование (рис. 1). Как всякий инфекционный процесс, хеликобактериоз в принципе может быть диагностирован микробиологически.
Иллюстрации к статье на цветной вклейке в журнал.
*
ю
со
В микробиологической диагностике хелико-бактериоза находят применение все три основных метода микробиологии: микроскопический, бактериологический, серологический. Особенности патогенеза хеликобактериоза определяют сроки и кратность выполнения того или иного диагностического исследования, выбор диагностического метода, тактику отбора, хранения и транспортировки биологического материала. Биологическое своеобразие H. pylori, анатомо-физиологические особенности колонизируемого им биотопа, требования клинической практики диктуют необходимость и обусловливают возможность применения нетрадиционных аранжировок каждого метода исследования.
МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ
Популяция H. pylori распределена по слизистой оболочке желудка неравномерно: с одной стороны, она имеет различную численность в различных отделах желудка (в первом приближении — в антральном отделе и теле), с другой — обитает как на поверхности эпителиального пласта, так и в толще покрывающей этот пласт желудочной слизи. Очевидно, достоверные результаты диагностического исследования с помощью микроскопического метода могут быть получены лишь при изучении нескольких образцов слизистой оболочки. Сиднейская классификация гастритов (1990, 1994) в полной мере учитывает эти обстоятельства, почему и рекомендует исследовать четыре образца: по два из антрального отдела и из тела желудка. Кроме того, Сиднейская классификация гастритов не рассматривает факта присутствия H. pylori в слизистой оболочке желудка в отрыве от морфологической характеристики гастрита, в связи с чем микроскопический метод диагностики хеликобактериоза выполняется одномоментно с гистологическим. При язвенной болезни и раке желудка допустимым является отбор двух образцов слизистой оболочки антрального отдела желудка.
В ряде случаев микроскопическая диагностика хеликобактериоза выполняется одномоментно с цитологической. Недостатки цитологического метода в диагностике хеликобактериоза очевидны: во-первых, он не позволяет оценить степень выраженности гастрита, во-вторых, выявляет бактериальные клетки, расположенные главным образом в толще желудочной слизи, но не на поверхности эпителиального пласта.
ОТБОР ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Образцы слизистой оболочки желудка для гистологического исследования отбираются в ходе верхней эзофагогастродуоденоскопии, выполняющейся в условиях эндоскопического кабинета (рис. 2). Для от-
бора образцов предпочтительным является использование форцепта (эндоскопических щипцов) среднего размера, позволяющего получить образцы размером около 1 х 1 х 1 мм. Образцы слизистой оболочки антрального отдела желудка отбираются с малой и большой кривизны его в точках, отстоящих на 1,5-2 см от пилорического сфинктера. Образцы слизистой оболочки тела желудка отбираются также с малой и большой кривизны в точках, отстоящих на 1,5-2 см от границы тела и антрального отдела.
Отобранные образцы немедленно помещаются в фиксирующие растворы того или иного типа в зависимости от избранной техники микроскопического исследования. Из образцов, подлежащих цитологическому исследованию и отобранных в соответствии с приведенной выше схемой, немедленно изготавливается мазок-отпечаток.
МИКРОСКОПИРОВАНИЕ
Последующая обработка образцов и изготовление препаратов выполняются в патоморфологических лабораториях в зависимости от избранной техники микроскопического исследования.
А. Световое микроскопирование.
Гистологические препараты, предназначенные для изучения в световом микроскопе, окрашиваются тем или иным способом, в выборе которого следует руководствоваться следующим соображением: микроскопическая картина должна быть оптимальной как для выявления клеток H. pylori, так и для оценки степени выраженности гастрита. Используются следующие способы окраски: толуидиновым синим, карболовым фуксином, гематоксилином и эозином, по Романовскому — Гимзе, по Граму, по Вортину — Стэрри, по Генте (рис. 3, 4).
Цитологические препараты с успехом могут быть окрашены любым из перечисленных способов, хотя на практике предпочтение отдается относительно нетрудоемким.
Сиднейская классификация гастритов предусматривает оценку степени выраженности воспаления, активности гастрита, атрофии слизистой оболочки, метаплазии ее эпителия, а также степени обсемененности H. pylori. Последняя оценивается полуколичественно как слабая, умеренная и тяжелая в зависимости от числа обнаруженных в единичном поле зрения бактериальных клеток. В отечественной диагностической практике зачастую применяется иная система количественной оценки степени обсемененности слизистой оболочки желудка H. pylori: различают четыре степени ее, соответствующие 0 - 20, 20 - 50, 50 - 100 и более чем 100 бактериальным клеткам
а
ш ■&
X
а
Ф
-о со
в поле зрения. Очевидно, что микроскопический метод исследования с применением светового микроскопирования оказывается достаточно чувствительным и специфичным лишь при относительно высокой степени обсемененности слизистой оболочки желудка. При низкой же степени обсемененности чувствительность и специфичность оставляют желать много лучшего: единичные объекты, напоминающие бактериальные клетки, обнаруживаются лишь изредка и идентифицируются лишь по морфологическому критерию с той степенью точности, которую этот критерий может гарантировать.
Сказанное в полной мере относится и к цитологическому исследованию, с тем лишь дополнением, что оценка степени обсемененности исследуемого материала H. pylori носит значительно более субъективный характер.
Б.Люминесцентное микроскопирование.
Чувствительность и специфичность микроскопического метода исследования в диагностике хели-кобактериоза могут быть существенно повышены в результате использования люминесцентного микроскопирования препаратов, окрашенных акридиновым оранжевым. Различия в окраске бактериальных клеток, эпителиальной ткани и лейкоцитов, возникающие при освещении препарата ультрафиолетовым светом, облегчают выявление и повышают достоверность идентификации H. pylori.
В. Иммуннофлуоресцентное микроскопирование. Применение реакции непрямой иммунофлуоресцен-ции еще более повышает чувствительность и специфичность микроскопического метода исследования. Решающее значение имеет качество использующихся антисывороток к H. pylori и иммуноглобулину IgG человека: лишь высококачественные антисыворотки способны обеспечить минимальный уровень перекрестных реакций с эпителиальной тканью и, следовательно, частоту возникновения ложнопо-ложительных результатов.
Г. Иммунноцитохимическое исследование.
Наиболее достоверные результаты микроскопического метода исследования могут быть получены посредством иммунноцитохимических методик, опирающихся на использование моноклональных антител к антигенам как H. pylori, так и разнообразным антигенам эпителиальной ткани. Высокая стоимость реагентов накладывает определенные ограничения на их применение в повседневной практике лечебных учреждений.
Д. Электронно-микроскопическое исследование.
Электронно-микроскопические технологии, все шире внедряющиеся в лабораторную диагностическую практику, позволяют поставить микроско-
пическую диагностику хеликобактериоза на принципиально новую методическую основу (рис. 5). Весьма высокая чувствительность и абсолютная специфичность методик электронно-микроскопического исследования делают их незаменимыми при микроскопической диагностике состояний, ассоциированных с заведомо низкой обсеменен-ностью исследуемого материала, в первую очередь при оценке эффективности эрадикационной терапии в относительно ранние сроки. Кроме того, лишь электронно-микроскопическое исследование позволяет с полной достоверностью выявлять формы H. pylori с дефектной клеточной стенкой и оценивать степень выраженности таких дефектов. Как и иммунноцитохимические, электронно-микроскопические исследования отличаются высокой стоимостью и, кроме того, для своего выполнения требуют участия немедицинского технического персонала высокой квалификации.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериологический метод исследования является основным методом микробиологической диагностики хеликобактериоза, позволяющим получить наиболее полное представление о биологических характеристиках штамма H. pylori, выделенного от того или иного пациента, и сопоставить их с особенностями клинического течения соответствующего заболевания.
ОТБОР ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Особенности распределения популяции H. pylori по слизистой оболочке желудка, рассмотренные выше, в полной мере определяют тактику отбора образцов биологического материала для бактериологического исследования. В дополнение к четырем образцам слизистой оболочки желудка, отобранным для микроскопического исследования, в ходе верхней эзофагогастродуоденоскопии отбираются два дополнительных — по одной с малой кривизны антрального отдела и тела желудка. Точки отбора следует располагать в максимальной близости (3-5 мм) от точек отбора материала для микроскопического исследования.
Бактериологический метод исследования предполагает безусловное соблюдение требований асептики при отборе биологических проб. В применении к эндоскопическому исследованию выполнение этих требований означает осуществление стери-лизационной обработки не только внешней поверхности гастроскопа, но и внутреннего его канала и форцепта непосредственно по окончании каждого единичного эндоскопического исследования. Пренебрежение требованием стерилизации эндоскопической аппаратуры неизбежно приводит
со
к сохранению на рабочих поверхностях форцепта и внутренних стенках канала эндоскопа частиц биологического материала, потенциально инфицированных H. pylori. Повторное использование нестерильной аппаратуры чревато как контаминацией неинфицированных образцов частицами биологического материала, неизбежно приводящей к возникновению ложноположительных результатов бактериологического исследования, так и ятрогенным инфицированием гастро-гастраль-ным путем неинфицированного ранее пациента. Нельзя не отметить с досадой, что технические и организационные особенности эксплуатации эндоскопической техники в реальных условиях работы лечебно-профилактических учреждений далеко не всегда способствуют неукоснительному выполнению рассмотренных выше требований асептики.
Отобранный, извлеченный из внутреннего канала эндоскопа и удерживаемый браншами форцепта биопсийный образец слизистой оболочки желудка немедленно помещается в транспортную среду того или иного состава. В случае использования полуплотных питательных сред биопсийный образец проталкивается форцептом до нижней трети столбика питательной среды, где и удерживается ею после разведения браншей и извлечения инструмента.
Хранение и транспортировка образцов
Выбор режима хранения и транспортировки отобранных образцов определяется степенью отдаленности эндоскопического кабинета от бактериологической лаборатории. При расположении их на территории одного и того же лечебного учреждения с успехом может быть использован 20%-ный стерильный раствор глюкозы, в 3 -5 мл которого образец слизистой оболочки желудка в течение 30-45 мин сохраняет изначальный уровень обсемененности H. pylori. Использование 0,9%-ного раствора хлорида натрия может быть использовано лишь в исключительных случаях и лишь при условии, что транспортировка образца в бактериологическую лабораторию осуществляется немедленно после его отбора и отнимает несколько минут. Во всех прочих случаях, когда транспортировка образца занимает от 1 до 6- 8 часов, следует использовать транспортные питательные среды, содержащие в достаточном количестве аэропротектор — легко окисляющееся вещество, защищающее H. pylori от разрушительного для него действия атмосферного кислорода. Наилучшими протекторными свойствами обладает полужидкая среда Кэри-Блэйр с 1,5%-ным тиогликолятом натрия — на ней биопсийные образцы слизистой оболочки желудка, защищенные от высыхания и окисления, сохраняются без потери своих биологических свойств при
комнатной температуре до 12 часов, при 4 °С — до 36. До 72 часов при комнатной температуре биопсийные образцы вполне успешно сохраняются на транспортной среде оригинального состава Portagerm pylori (bioMerieux, Франция). Как показывает практика, добавление к транспортной среде активированного угля не оказывает существенного влияния на выживаемость на ней H. pylori.
Классическая аранжировка бактериологического метода исследования
В соответствии с методологическими требованиями классической бактериологии чистая культура бактерии может быть выделена из изолированной колонии, выросшей на плотной питательной среде в результате посева на нее исследуемого биологического материала. Выделенная культура подлежит идентификации с видовой степенью точности, необходимой для постановки лабораторного микробиологического диагноза — названия вида микроорганизма, ассоциированного с тем или иным биологическим материалом.
А. Искусственные питательные среды
Важнейшим требованием, предъявляемым к искусственным питательным средам для выделения H. pylori из биологического материала, является требование возможно более полного восполнения питательных потребностей этой бактерии. Учитывая, что H. pylori в качестве источника энергии и азота широко использует глюкозу и аминокислоты, питательные среды, применяемые для его выделения, должны содержать их в достаточном количестве. Такие среды изготавливаются из гидролизатов мышечной ткани глубокой степени расщепления — вплоть до свободных аминокислот и олигопептидов. Иными словами, для своего выделения H. pylori требует питательные среды, характеризующиеся высокими — более 120 мг% — значениями индекса аминного азота — показателя, отражающего уровень содержания в искусственной питательной среде свободных аминокислот. Современные технологии ферментативного и кислотного гидролиза позволяют получать гидролизаты животных и растительных тканей заданной глубины расщепления, что дает возможность ведущим производителям такого рода продукции выпускать высококачественные питательные основы для выделения столь труднокультивируемого микроорганизма, коим является H. pylori. Питательные потребности H. pylori в полной мере могут быть восполнены на таких питательных основах, как Columbia Agar, Brain Heart Infusion Agar, Blood Agar Base, GC Agar Base, Brucella Agar и проч. Ведущими производителями искусственных питательных сред эти основы выпускают-
а
ш ■&
X
а
Ф
00 со
ся в виде сухих коммерческих продуктов. В то же время не теряют своего значения и некоммерческие питательные композиции, изготавливающиеся в бактериологических отделениях из коммерческих питательных основ. Примером такой композиции является среда 94, в течение многих лет использующаяся в отечественной бактериологической практике для выделения H. pylori из биопсийных образцов слизистой оболочки желудка.
Биологические добавки являются неотъемлемой составляющей искусственных питательных сред для выделения и культивирования H. pylori. Наилучшие результаты приносит добавление к искусственной питательной среде нормальной лизи-рованной лошадиной крови либо смеси нормальной лошадиной сыворотки с «шоколадной» (разрушенной прогреванием при повышенной температуре) лошадиной кровью. В обоих случаях питательная среда обогащается биологическими добавками, в изобилии содержащимися в крови, в частности в строме ее эритроцитов. Относительно приемлемым может быть расценено добавление к питательной основе цельной бараньей крови, гемоглобина, гемина, различных патентованных добавок типа IsoVitalex, Vitox и т. п., содержащих разнообразные факторы роста бактерий. Следует избегать добавления к питательной основе донорской человечьей крови, зачастую содержащей антибиотики и в подавляющем большинстве случаев — антитела к H. pylori.
Известно, что в естественных условиях обитания H. pylori населяет нестерильную экологическую нишу, уровень обсемененности которой сопутствующей бактериальной флорой возрастает прямо пропорционально росту значений ее рН. В этой связи добавление к искусственной питательной среде селективных для H. pylori добавок, подавляющих рост сопутствующей флоры, выглядит вполне методически оправданным. Многочисленные известные к сегодняшнему дню селективные добавки сконструированы по единому принципу: они содержат ингибиторы кокковой, кишечной палочковидной и грибковой микрофлоры, взятые в различных соотношениях друг с другом. В ряде случаев к искусственной питательной среде добавляется хлорид трифенилтетразолиума — вещество, легко восстанавливающееся H. pylori с образованием характерного пигмента. Добавление к искусственной питательной среде хлорида трифенилтетразолиума придает ей — в дополнение к селективным — дифференциально-диагностические качества.
Анализируя оптимальный для выделения и культивирования H. pylori состав искусственных питательных сред, легко убедиться, сколь трудоемким, с одной стороны, является процесс их лабораторного приготовления и сколь трудновыполнимым — с другой является требование стандартизации этих сред.
Б. Первичный высев и культивирование
Немедленно после извлечения бактериологической петлей из толщи транспортной среды биопсийный образец высевается на поверхность свежеприготовленной и подсушенной среды культивирования. Принимая во внимание, что слизистая оболочка желудка не является легко гомогенизирующимся материалом, способным быть без остатка растертым по поверхности плотной питательной среды, посев, по сути, выливается в прокатывание плотного материала по ее поверхности с целью возможно более полной контаминации последней. По завершении процедуры посева биопсийный образец помещается в центральную область поверхности плотной питательной среды. Хотя в большинстве случаев для выделения H. pylori используются селективные и селективно-диагностические искусственные питательные среды, иногда возникает необходимость в высеве на неселективную среду. В подобных случаях первичный высев производится в первую очередь на неселективную, во вторую — путем переноса на нее биопсийного образца — на селективную (селективно-диагностическую) искусственную питательную среду.
Немедленно после выполнения первичного высева посевы помещаются в микроанаэростат для создания здесь оптимальной по составу атмосферы и абсолютной влажности. Как упоминалось выше, H. pylori является микроаэробной и капнофильной бактерией, требующей для своего культивирования in vitro следующего объемного состава атмосферы: 5% кислорода, 10% углекислоты, 85% азота. Создание искусственной атмосферы в герметически замкнутом внутреннем пространстве микроанаэростата возможно двумя принципиально различными способами: аэромеханически либо химически. Аэромеханическая замена предполагает наличие газовой атмосферы фиксированного состава, содержащейся под избыточным давлением в газовых баллонах и подающейся во внутреннее пространство микроанаэростата по газопроводу соответствующей конструкции. Химическая замена предполагает использование газогенерирующих-газопоглоща-ющих пакетов: смеси неорганических солей, при увлажнении частично поглощающих кислород внутреннего пространства микроанаэростата и выделяющих необходимое количество углекислоты. В обоих случаях абсолютно необходимым является использование вентилируемых чашек Петри: чашек, конструкция которых не допускает герметически плотного замыкания чашки ее крышкой.
После создания тем или иным способом оптимальных для культивирования H. pylori условий микроанаэростаты помещаются в суховоздушный термостат для культивирования при 37 °С в течение 7-10 суток с просмотром посевов на третьи (четвертые), пятые (шестые), седьмые (восьмые) и десятые сутки инкубации.
о со
В. Выделение и идентификация чистых культур
Изолированные колонии, выросшие на поверхности искусственной питательной среды в результате высева на нее биопсийного образца слизистой оболочки желудка, изучаются при увеличении х16 с применением бинокулярной лупы. На искусственных питательных средах, не содержащих хлорида трифенилтетразолиума (неселективных и селективных), изолированные колонии H. pylori обладают следующими культу-ральными свойствами: округлой формы, не более 1 мм в диаметре (на третьи сутки инкубации), ровными краями, слегка возвышаются над поверхностью среды, не прорастая ее толщу, с узкой прозрачной периферической зоной и непрозрачным матовым центром, по мере удлинения срока инкубации принимающим вид «апельсиновой корки», с рефлексом, возникающим при боковом освещении, легко отделяются от поверхности плотной питательной среды. Наличие в составе искусственной питательной среды хлорида трифенилтетразолия придает изолированным колониям исключительно важный дифференциально-диагностический признак: восстановленные формы этого соединения пигментируют центральную часть изолированных колоний рубиново-красным пигментом с золотистыми вкраплениями (рис. 6); при скученном расположении изолированных колоний рубиново-красный пигмент распространяется за пределы колоний и окрашивает поверхность питательной среды узкими штрихами (рис. 7).
Из материала изолированных колоний, обладающим описанным выше набором культураль-ных признаков, в соответствии с описанной выше методикой выделяется чистая культура, подлежащая идентификации. Культура грамнегативных изогнутых палочек, выделенная из биопсийного образца слизистой оболочки желудка в микроаэробной атмосфере в присутствии селективной смеси и обладающая описанным выше набором культуральных признаков, с высокой вероятностью может быть отнесена к виду Helicobacter pylori. Наличие у такой культуры оксидазной, каталазной и уреазной активности позволяет окончательно подтвердить подобное предположение.
Помимо фенотипической идентификации, в диагностической практике находит свое применение и генотипическая: молекулярное зондирование и полимеразная цепная реакция позволяют идентифицировать выделенную культуру на основании обнаружения в ее материале фрагментов генома, свойственных исключительно виду H. pylori. Наиболее часто генотипическая идентификация опирается на обнаружение фрагментов гена, кодирующего последовательность 16S РНК, гена ureC, гена vacA, гена hpaA.
Г. Оценка чувствительности выделенных культур к антибиотикам
Хотя стартовая терапия хронического гастрита и язвенной болезни, безусловно, остается эмпирической, оценка чувствительности выделенных культур к антибиотикам сохраняет свою актуальность. Во-первых, стартовая терапия далеко не во всех случаях оказывается успешной: по самой оптимистической оценке, эрадикация популяции H. pylori достигается в 65-70% случаев, и резистентность штамма H. pylori к избранному для терапии антибиотику зачастую оказывается тому причиной. В подобных случаях результаты экспериментов по оценке чувствительности культуры к антибиотикам могут оказаться полезными для корректировки курса эрадикационной терапии. Во-вторых, эмпирическое назначение того или антибиотика базируется не в последнюю очередь на сведениях о спектре природной резистентности к антибиотикам штаммов, циркулирующих в том или ином регионе, — иными словами, адекватная оценка чувствительности к антибиотикам штаммов H. pylori, выделяющихся в том или ином регионе, позволяет планировать рациональную эмпирическую стартовую терапию хеликобактериоза в ближайшей перспективе.
Для оценки чувствительности свежевыделенных культур H. pylori к антибиотикам применяются четыре теста, перечисленные в порядке возрастания достоверности обеспечиваемых ими результатов: дискодиффузионный, эпсилометрический (Е-тест), серийных разведений в плотной питательной среде, серийных разведений в жидкой питательной среде. Постановка всех четырех тестов требует использования жестко стандартизированной по оптической плотности (мутности) взвесей материала тестируемой культуры, а также стандартных питательных сред, препаратов антибиотиков и антибиотиксодер-жащих носителей (стандартных дисков и Е-полос). Кроме того, безусловно необходимой является постановка контрольных экспериментов с использованием эталонных штаммов H. pylori.
Для постановки теста серийных разведений в жидкой питательной среде может быть с успехом использован Brucella Broth с нормальной лошадиной сывороткой, для постановки трех прочих тестов — Columbia Agar с нормальной лизированной лошадиной кровью.
Дискодиффузионный тест выполняется по обычной методике: поверхность свежеприготовленной и тщательно подсушенной плотной питательной среды инокулируется материалом взвеси испытуемой культуры, после чего на подсушенный газон укладываются стандартные диски с антибиотиками, в обязательный набор которых входят ампициллин, тетрациклин, кларитромицин, азитромицин,
а
ш ■&
X
а
Ф
о
метронидазол, пефлоксацин, ципрофлоксацин, ри-фампицин. Учет результатов производится путем измерения диаметров зон задержки роста культуры вокруг каждого диска, возникших по истечении 48 часов инкубации в описанном выше режиме. Полученные результаты сопоставляются с табличными значениями диаметров зон задержки роста, соответствующими чувствительности, промежуточному состоянию и резистентности к тому или иному антибиотику.
Дискодиффузионный тест, подкупающий своей нетрудоемкостью, позволяет получить лишь качественные результаты, тогда как три прочих теста позволяют — хотя и с различной степенью точности — выполнить количественную оценку степени чувствительности культуры к тому или иному антибиотику — иными словами, оценить минимальную подавляющую концентрацию (МПК) его по отношению к той или иной культуре.
Постановка эпсилометрического теста (Е-теста) мало отличается от постановки дискодиффузион-ного: на инокулированную поверхность по радиусу чашки укладываются полосы нитроцеллюлозы, содержащие градиент концентрации какого-либо антибиотика, промежуточные значения концентрации которого указаны на лицевой стороне носителя. Учет результатов производится визуально: расположение эллипсовидной границы зоны задержки роста однозначно соответствует концентрации антибиотика в этой точке, на что и указывает ближайшее к границе зоны численное значение.
Тест оценки чувствительности к антибиотикам на плотной питательной среде, являющийся наиболее трудоемким и дорогостоящим, предусматривает приготовление батареи чашек со средой Columbia Agar с нормальной лизированной лошадиной кровью, содержащих возрастающие концентрации того или иного антибиотика. Поверхность питательной среды инокулируется каплей взвеси испытуемой культуры — как правило, поверхность одной чашки в целях экономии средств инокулируется взвесью нескольких испытуемых культур. Учет результатов производится визуально: в качестве МПК того или иного антибиотика расценивается та его концентрация, при которой впервые в возрастающем ряду концентраций антибиотика отсутствует видимый рост испытуемой культуры.
Постановка теста оценки чувствительности к антибиотикам на жидкой питательной среде, позволяющего получить наиболее точные результаты, эквивалентна предыдущей — с той лишь разницей, что возрастающие концентрации антибиотиков вносятся в жидкую питательную среду, инокулиру-емую определенным объемом взвеси испытуемой культуры. Учет результатов теста также производится визуально: в качестве МПК того или иного антибиотика расценивается та его концентрация, при которой впервые в возрастающем ряду кон-
центраций антибиотика отсутствует видимый рост испытуемой культуры, регистрируемый в виде помутнения питательной среды.
Д. Типированиекультур
Надежных схем фенотипического типирования культур H. pylori к настоящему времени не разработано: монотонность биохимических признаков не открывает возможности создания эффективной схемы биотипирования, полное отсутствие признаков, указывающих на существование бактериофагов, делает бесперспективным конструирование схем фаготипирования. В то же время наличие ЛПС вариабельной структуры обеспечивает потенциальную возможность разработки схемы серологического типирования культур H. pylori — возможность, до сего дня не реализованную.
В то же время генотипирование культур H. pylori применяется весьма широко: здесь используются методики рестрикционного и амплификацион-ного анализа, а также сочетание их друг с другом. Так, культуры типируются по профилю продуктов рестрикции разделенных электрофорезом в пульсирующем электрическом поле, по набору продуктов амплификации палиндромных последовательностей, по профилю продуктов рестрикции ранее ам-плифицированного продукта и т. п.
Е. Музейное хранение культур
Весьма чувствительный к воздействию факторов окружающей среды, H. pylori чувствителен и к процедуре лиофильного высушивания. Подобное обстоятельство относит проблему музейного хранения его культур к категории трудноразрешимых. Оптимальным способом музейного хранения является хранение в условиях глубокого замораживания на средах с криопротектором. Так, на среде с глицерином при — 70 °С культура H. pylori сохраняет жизнеспособность около одного года, использование лизированной лошадиной крови с глицерином позволяет увеличить срок хранения культур до двух лет.
Нетрадиционные аранжировки бактериологического метода исследования
Успехи бактериологической диагностики хелико-бактериоза очевидны: в настоящее время выделение чистой культуры H. pylori является процедурой, доступной бактериологической лаборатории всякого лечебно-профилактического учреждения. Лишь оценка биологических признаков свежевы-деленной культуры H. pylori позволяет составить исчерпывающее представление о течении хели-кобактериоза у ее хозяина — пациента, страдающего тем или заболеванием гастродуоденальной области. Лишь выделение значительного числа культур обеспечивает возможность систематического изучения биологических свойств вида в целом,
оценки характера и степени распространенности приобретенной антибиотикорезистентности, эпидемиологического надзора за распространением хеликобактериоза.
Вместе с тем нельзя не отметить, что бактериологическая диагностика хеликобактериоза в классической аранжировке позволяет получить диагностически значимый результат в сроки, несопоставимые с требованиями клиники. В этой связи, безусловно, оправданными выглядят попытки разработки нетрадиционных аранжировок бактериологического метода исследования — диагностических приемов, позволяющих идентифицировать H. pylori непосредственно в исследуемом материале, причем в значительно более короткие сроки — минуя продолжительный этап выделения чистой культуры.
А. Быстрыйуреазный тест
Как отмечалось выше, уровень уреазной активности культур H. pylori столь высок, что придает им специфичность — ни один из известных биологический объектов не способен к продукции уреазы в эквивалентном количестве и в сопоставимые сроки. Иными словами, H. pylori может быть идентифицирован по уровню своей уреазной активности. Это уникальное биологическое свойство H. pylori может быть успешно выявлено простым химическим путем: гидролиз мочевины в присутствии уреазы сопровождается интенсивным защелачиванием среды, что может быть отражено изменением окраски соответствующим образом подобранного индикатора. В настоящее время существует достаточное количество коммерческих вариантов быстрого уреазного теста, сконструированных в соответствие с этим химическим принципом и позволяющих выявить уреазную активность H. pylori не только в чистых культурах его, но и непосредственно в биопсийных образцах слизистой оболочки желудка. Действительно, образец слизистой оболочки желудка, помещенный в рабочую тест-камеру (пробирку, кювету, лунку и т. п.), в случае присутствия в нем H. pylori и, следовательно, уреазы способен изменить окраску окружающей среды, причем в сравнительно короткие сроки — не превышающие 30-45 минут. Поскольку именно скорость изменения окраски придает тесту специфичность, абсолютно недопустимым является увеличение продолжительности выполнения теста. Пренебрежение этим требованием неизбежно приводит к получению ложноположительных результатов: в удлиненные сроки гидролиз мочевины способны осуществить и иные, менее проворные уреазопродуценты — например, микроорганизмы рода Proteus, в изобилии присутствующие в желудке при гипо- и анацидных состояниях.
По своему замыслу быстрый уреазный тест выполняется врачом-эндоскопистом в условиях
эндоскопического кабинета. Наилучшие результаты приносит постановка теста с образцом слизистой оболочки, отобранным с его угла желудка. Тест обладает достаточной чувствительностью и специфичностью в случае относительно высокой обсеменен-ности образцов H. pylori — при низкой об-семененности частота ложноотрицательных результатов становится непомерно высокой. Иными словами, при оценке эффективности эрадикационной противохеликобактерной терапии быстрый уреазный тест должен выполняться с осторожностью.
Б. Дыхательный тест
На способности H. pylori к быстрому гидролизу мочевины основан тест идентификации его, не требующий не только выделения чистой культуры, но и отбора образца биологического материала.
Среди продуктов гидролиза мочевины уре-азой H. pylori образуется, в частности, углекислота, немедленно всасывающаяся слизистой оболочкой желудка и в течение нескольких минут появляющаяся в выдыхаемом воздухе в виде углекислого газа. По-видимому, у лиц, чей желудок колонизирован H. pylori, выдыхаемый воздух содержит несколько большее количество углекислого газа, нежели у неинфицированных. Молекулы углекислого газа, образовавшегося вследствие гидролиза мочевины уреазой H. pylori, могут быть легко дифференцированы от аналогичных продуктов тканевого метаболизма человека, если они содержат меченный атом углерода. При приеме внутрь раствора мочевины, молекулы которой содержат радиоактивный атом углерода 14С или нерадиоактивный 13С, последние — в случае гидролиза мочевины уреазой H. pylori — могут быть обнаружены в выдыхаемом воздухе с помощью сцинтилляционного счетчика либо масс-спектрометра соответственно.
Понятно, что при хеликобактериозе различной степени выраженности степень насыщения выдыхаемого воздуха мечеными молекулами углекислого газа прямо пропорциональна степени обсе-мененности слизистой оболочки желудка H. pylori. Помимо чрезвычайно высокой чувствительности и абсолютной специфичности, практически не зависящих от степени обсемененности слизистой оболочки, дыхательный тест занимает выделенное положение среди всех прочих методик выявления H. pylori: лишь он позволяет судить о степени колонизации всей поверхности слизистой оболочки желудка, а не отдельных ее участков. Существуют, однако, ограничения на повсеместное применение дыхательного теста: изотоп углерода 14С обладает радиоактивностью, уровень которой достаточен для реальной угрозы здоровью медицинского персонала; безопасный для здоровья
Si
а
ш ■&
X
а
Ф
CN
изотоп 13С может быть обнаружен лишь с помощью масс-спектрометрии — высокоточного метода идентификации веществ, стоимость выполнения которого лежит за пределами возможностей подавляющего большинства лечебно-профилактических учреждений.
В. Полимеразная цепная реакция
Внедрение в диагностическую практику полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) существенным образом изменило представления о диагностических возможностях бактериологического метода исследования. Как было отмечено выше, посредством ПЦР может быть осуществлена не только предельно точная идентификация выделенных культур H. pylori, но и оценены степень их патогенности (рис. 8) и профиль антибиотикорезистентности. Однако при попытке обнаружить фрагменты генов H. pylori, значимых для его идентификации, непосредственно в био-псийных образцах ПЦР приносит не столь выразительные результаты. Не вдаваясь в анализ причин подобного явления, отметим, что чувствительность и специфичность ПЦР не уступает чувствительности и специфичности бактериологического метода исследования лишь при высокой степени обсемененности биопсийного образца H. pylori — при низкой же она оставляет желать много лучшего, что ставит под сомнение целесообразность применения ПЦР для оценки эффективности эрадикационной терапии.
В то же время одна из аранжировок ПЦР требует особого к себе внимания. С ее помощью фрагменты ДНК H. pylori могут быть обнаружены в фекалиях, и соответствующий неинвазивный (не требующий отбора биологической пробы в ходе верхней эзофа-гогастродуоденоскопии) тест мог бы быть обречен на клинический, лабораторный и коммерческий успех. В направлении разработки теста такого рода в настоящее время ведется интенсивная исследовательская работа, и первые результаты выглядят вполне обнадеживающе.
жание антигенов H. pylori в фекалиях отмечается в результате не вполне эффективной эрадикаци-онной терапии, и ложноотрицательный результат диагностического теста чреват здесь весьма серьезными последствиями: пациенту, считающему себя излеченным, грозит возникновение рецидива заболевания, пусть и в отдаленные сроки.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ
Серологический метод исследования оказывается весьма полезным при несовпадении отрицательных результатов микроскопического и бактериологического методов исследования с результатами клинического и эндоскопического. Кроме того, он является незаменимым методом сероэпидемиологического анализа, ставящего своей целью оценку инфициро-ванности H. pylori той или иной популяции.
Отбор образцов биологического материала
Биологическим материалом для серологического исследования в подавляющем большинстве случаев является сыворотка периферической, реже — центральной крови, отбирающаяся по общепринятой в широкой лабораторной практике методике. В ряде случаев исследуемым материалом может служить плазма крови.
Хранение и транспортировка образцов
Отобранные образцы сыворотки транспортируются в лабораторию обычным образом в строгом соответствии с требованиями эпидемического режима и правилами обращения с образцами крови и сыворотки. При 4 °С образцы подлежат хранению не более двух суток, при — 20 и — 70 °С — практически неограниченное время.
СОБСТВЕННО СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Г. Тесты антигенной диагностики
Поскольку погибшая часть популяции H. pylori постоянно поступает в нижележащие отделы желудочно-кишечного тракта, где подвергаются более или менее глубокому разрушению, вполне оправданной выглядит попытка обнаружения антигенов H. pylori в фекалиях. Описаны результаты весьма успешных экспериментов по обнаружению антигенов H. pylori в фекалиях с помощью реакции иммунноферментного анализа (ИФА) и радиоим-мунноиследования. Более того, сконструированы коммерческие тест-системы ИФА, занявшие свое место среди неинвазивных методик обнаружения H. pylori. Как и следует ожидать, чувствительность и специфичность тестов антигенной диагностики при низкой степени насыщенности фекалий антигенами H. pylori не слишком велики. Низкое содер-
А.Иммуноферментный анализ
Реакция иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет выявить наличие в образце сыворотки крови антител различных классов на антигены H. pylori. Более того, использование непрямого варианта ИФА позволяет выявить антихеликобактерные антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов — IgM, IgG, IgA, — дифференцируя тем самым различные стадии течения хеликобактериоза.
В качестве антигенов в диагностических тест-системах ИФА используются «комплексный антиген H. pylori» — смесь поверхностных антигенов бактериальных клеток, уреаза, вакуолизирующий токсин, CagA-белок. Степень очистки белкового антигена во многом определяет качество диагностической тест-системы, почему в диагностическую практику все шире внедряются тест-системы,
со
сконструированные на основе рекомбинантных антигенов H. pylori.
Поскольку хеликобактериозу свойственно хроническое течение, серологическое исследование парных сывороток с помощью ИФА не может найти применения в его первичной диагностике, однако оно может найти применение при прогнозировании наступления рецидива: положительная динамика нарастания титров антител к тому или иному антигену H. pylori может свидетельствовать о возрастании антигенной нагрузки, в свою очередь обусловленную нарастанием численности бактериальной популяции. Эквивалентным образом может быть оценена эффективность эрадикационной терапии в отдаленные сроки, а также реинфицирование пациентов, прошедших успешный курс эрадика-ционной терапии. При оценке эффективности эра-дикационной терапии вскоре после ее завершения ИФА может найти лишь ограниченное применение и играть вспомогательную роль: достоверное падение титров антител в результате эрадикации H. pylori со слизистой оболочки желудка отмечается далеко не во всех случаях успешно выполненного курса лечения.
Тип антигена и его качество в значительной степени определяют чувствительность и специфичность диагностической тест-системы ИФА того или иного типа. Как правило, достаточно высокая чувствительность ИФА сочетается с не столь высокой специфичностью — наилучшие показатели здесь демонстрируют тест-системы на основе «комплексного антигена H. pylori», наихудшие — на основе CagA-белка.
Б. Иммунный блоттинг
Высокочувствительные и практически абсолютно специфичные результаты могут быть получены с помощью реакции иммунного блоттинга — выявления в сыворотке крови антител на различные антигены H. pylori, выделенные из бактериальной клетки, очищенные, нанесенные на поверхность нитроцеллюлозы и разделенные на ней с помощью электрофореза. Антихеликобактерные антитела сыворотки, связавшиеся с гомологичными им антигенами, могут быть выявлены непрямым путем и дифференцированы по классам. Наиболее значимые результаты иммунный блоттинг приносит при выявлении антител к CagA-белку H. pylori — здесь он является методикой выбора, позволяющей косвенным образом оценить cagA-статус инфицирующего штамма H. pylori. Чрезвычайно высокая стоимость тест-полос для иммунного блоттинга ограничивает его применение в рутинных целях.
В. Тесты ускоренной серологической диагностики
Сведения об инфицированности пациента H. pylori играют зачастую решающую роль при назначении верхней эзофагогастродуоденоскопии и гистологи-
ческого и бактериологического исследований. Принимая во внимание, что подобного рода решения принимаются, как правило, врачом-гастроэнтерологом в условиях поликлинического приема, тесты ускоренной серологической диагностики хеликобактери-оза оказываются незаменимыми. Такие тесты выполняются врачом-гастроэнтерологом в условиях лечебного кабинета, чем и объясняется их обозначение как «докторские тесты».
Для выполнения «докторского теста» требуется не более 5-10 мкл периферической крови, отобранных в результате перфорации кожи пальца. Образец крови вносится в тест-систему оригинального дизайна, где в течение 10-15 минут важнейшие белки крови разделяются по длине полосы нитроцеллюлозы по принципу «сухой хроматографии». Антихеликобактерные антитела связываются с антигенами H. pylori, нанесенными на полосу нитроцеллюлозы, что проявляется в виде появления на поверхности последней специфически окрашенной полосы.
Докторские тесты, как и положено скринин-говым тестам, отличаются высокой чувствительностью, но не специфичностью, что в полной мере соответствует стоящей перед ними задаче — ориентировочная оценка вероятности инфицирования пациента H. pylori.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
«Золотой стандарт» микробиологической диагностики хеликобактериоза
Исходный вариант «золотого стандарта» диагностики хеликобактериоза, логически вытекающий из положений Сиднейской классификации гастритов (1990, 1994), не утратил своего значения по настоящее время, хотя и претерпел изменения, продиктованные требованиями времени.
Согласно требованиям «золотого стандарта», факт присутствия H. pylori в слизистой оболочке желудка считается установленным, если он обнаружен с помощью микроскопического и (или) бактериологического методов исследования как минимум в одном из шести образцов слизистой оболочки желудка, отобранных в соответствии с требованиями Сиднейской классификации гастритов. При этом подразумевается, что микроскопический метод исследования выполняется одномоментно с гистологическим (но не с цитологическим), а бактериологический выполняется в классической (но не в ускоренной) аранжировке. Внедрение в лабораторную диагностическую практику разнообразных методик ускоренной бактериологической диагностики хеликобактериоза повлекло собой попытки расширения «золотого стандарта», зачастую необоснованные.
а
ш ■&
X
а
Ф
Безусловным правом на равноправное включение в «золотой стандарт» диагностики хеликобактерио-за имеет лишь дыхательный тест, чувствительность и специфичность которого приближаются к абсолютным, и электронно-микроскопическое исследование, существенно повышающее чувствительность и специфичность микроскопического метода исследования. Недостаточно высокая чувствительность и (или) специфичность прочих рассматривавшихся выше методик ускоренной диагностики хеликобак-териоза требует весьма осторожного применения их в диагностических целях — во всяком случае весьма осторожной клинической интерпретации приносимых ими результатов.
Направления развития микробиологической диагностики хеликобактериоза
Стратегической тенденцией развития микробиологической диагностики хеликобактериоза является совершенствование известных и разработка новых методик ускоренной диагностики, не требующих к тому же отбора образцов в ходе верхней эзофагогастродуоденоскопии, — так называемых «неинвазивных» методик. Дыхательный тест является замечательным примером такой методики, широкому внедрению которой в повседневную диагностическую практику препятствует лишь высокая стоимость диагностической аппаратуры. Нельзя не отметить, что в разработке методик обнаружения в фекалиях антигенов и фрагментов генома H. pylori, как и в разработке «докторских» тестов ускоренной серологической диагностики хеликобактериоза, в последние годы достигнуты впечатляющие и обнадеживающие успехи.
наравне друг с другом и в сочетании с нитроими-дазолами и (или) препаратами висмута. Рекомендации «Маастрихт 2» (2000) предлагают две линии эрадикационной терапии, первая из которых является примером трех-, вторая — че-тырехкомпонентной терапии. Первая линия эра-дикационной терапии назначается эмпирически в качестве стартовой, вторая линия — в случае неудачи первой: когда не удается достигнуть эра-дикации H. pylori.
К числу препаратов первой линии относятся: ингибитор протонной помпы (омепразол, лан-зопразол, рабепразол) либо антагонист Н2-ре-цепторов гистамина (ранитидин, фамотидин); макролид (кларитромицин); аминопенициллин (амоксициллин) или нитроимидазол (метрони-дазол, тинидазол). К числу препаратов второй линии относятся: ингибитор протонной помпы (омепразол, ланзопразол, рабепразол); препарат висмута (субцитрат, субсалицилат); тетрациклин; нитроимидазол (метронидазол, тинидазол).
Клиническая практика вносит поправки в рекомендуемые схемы лечения: так, в качестве анти-хеликобактерного средства с успехом применяется макролид азитромицин, зачастую четырехкомпо-нентная становится первой линией схема эради-кационной терапии и т. п.
Клинический, эндоскопический и лабораторный контроль эффективности эрадикационной терапии следует проводить тотчас по окончании курса ее и спустя три, шесть, двенадцать месяцев, причем соблюдение требований «золотого стандарта» при оценке результатов соответствующих лабораторных тестов является обязательным.
Принципы эрадикационной терапии хеликобактериоза
Как отмечалось выше, международные и российские инструктивно-методические документы требуют включения в схемы лечения язвенной болезни и хронического гастрита противохеликобактер-ных средств. В настоящее время в большинстве стран с успехом применяются трех- и четырех-компонентные схемы эрадикационной противо-хеликобактерной терапии, ставящие своей целью полную санацию слизистой оболочки желудка от H. pylori — эрадикацию его. Всякая схема трех- либо четырехкомпонентной терапии предусматривает комбинацию антисекреторных и антибактериальных препаратов. При этом допускается определенная свобода выбора внутри упомянутых групп лекарственных средств: среди антисекреторных препаратов антагонисты Н2-рецепторов гистамина находят применение наравне с блокаторами протоновой помпы, а среди антибактериальных препаратов макролиды аминопенициллины, тетрациклины применяются
Профилактика хеликобактериоза
Профилактика хеликобактериоза носит неспецифический характер, принципиально не отличаясь от профилактики заболеваний, передающихся фекально-оральным путем. Соблюдение правил личной и общественной гигиены играет решающую роль. В то же время возможность передачи H. pylori орально-оральным путем требует ужесточения мер личной гигиены, в первую очередь в семьях, где имеются инфицированные члены семьи. Возможность ятрогенного заражения гастро-гастрогастральным путем в условиях эндоскопического кабинета рассматривалась выше. Наконец, возможность профессионального заражения гастро-оральным путем, представляющая определенную опасность для медицинского персонала эндоскопических, стоматологических, оториноларингологических отделений, требует соблюдения особых повышенных мер безопасности, обеспечивающихся применением защитных средств: марлевых повязок, резиновых перчаток, рабочей одежды.
ю
Вакцинные препараты для активной специфической профилактики хеликобактериоза находятся в стадии разработки, и в этой области достигнуты определенные успехи. Так, сконструированы экспериментальные образцы убитых, рекомбинантных и живых векторных вакцин, использующих в качестве иммунизирующего
антигена уреазу, жгутиковый флагеллин, белки теплового шока, вакуолизирующий токсин. Целесообразность активной иммунизации против хеликобактериоза в профилактических и лечебных целях является предметом оживленных профессиональных дискуссий.
Н
а ш
■е
X
а
ЛИТЕРАТУРА
1. Warren, J.R. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis [letter]/J. R. Warren//Lancet. — 1983. — Vol.
1. — 1273.
2. Marshall, B. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis [letter]/B. Marshall//Lancet. — 1983. — Vol.
1. — 1273-1275.
3. Misiewich, J. J. The Sydney system: a new classification of gastritis. Introduction / J. J. Misiewich // J.Gastroenterol. Pathol.— 1991.— Vol. 6. — 207-208.
4. Dixon, M.F. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney system/M. F. Dixon, R. M. Genta, J. H. Yardley et al.//Am. J. Surg. Pathol. — 1996. — Vol. 20. — 1161-1181.
5. NIH Consensus Conference: Helicobacter pylori in peptic ulcer disease//JAMA. — 1994. — Vol. 272. — P. 65-69.
6. International Agency for Research in Cancer: Shistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori//IARC. — 1994. — Vol. 61. — 177-240.
Ф
