CC BY
248
УДК 541.14: 612.112.91
МИЕЛОПЕРОКСИДАЗА: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МОДИФИКАЦИИ И РОЛЬ СУБЪЕДИНИЧНЫХ КОНТАКТОВ
Л.Т. Рязанцева
Изложены современные представления о структуре и функции миелопероксидазы нейтрофилов человека. Анализируются кинетические параметры процессов структурно-функциональных модификаций указанного белка
Ключевые слова: миелопероксидаза, нейтрофил, структура, кинетические параметры
Миелопероксидаза (донор: Н2О2-
оксидоредуктаза; КФ 1.11.1.7) - гемопротеино-вый фермент, восстанавливающий пероксид водорода донорами электронов различной химической природы.
С помощью цитохимических методов и электронной микроскопии, а также биохимических методов с использованием меченых предшественников было обнаружено, что миелопероксидаза (МПО) образуется на ранних стадиях формирования Нф в эндоплазматиче-ской сети, затем поступает в цистерны комплекса Гольджи, от которых отшнуровывают-ся пузырьки, где и накапливается МПО. При слиянии этих пузырьков на стадии промиелоцита формируются азурофильные гранулы. Отмечена интенсивная продукция порфирина на стадии миелобласта. Прекращение синтеза МПО совпадает с прекращением формирования азурофильных гранул и переходом клетки на следующую стадию [1].
Биохимическими методами с помощью лейцина-3Н было показано, что при воспалении функционирует только ранее накопленный фермент [1]. Таким образом, полученные до настоящего времени данные свидетельствуют
о фазовости синтеза МПО.
Молекула МПО представляет собой димер, в каждой из субъединиц которого находится по одному атому железа, хелатированно-го протопорфирином IX [2]. Молекулярная масса фермента составляет 161 кДа. Простети-ческая группа МПО связана с белковой глобулой ковалентными связями.
Спектр МПО, полученный методом ЭПР, со значениями g, равными 6,8; 5,0; 1,95 [3], характерен для высокоспинового гемового железа с окружением ромбической симметрии [1]. Для МПО лейкоцитов человека определен аминокислотный состав (таблица). Известно,
Рязанцева Лариса Тихоновна - ВГТУ, канд. биол. наук, доцент, тел. (4732) 521939
что His 261 (95) существенен для проявления каталитической активности, а Asp 260 (94), Met 409 (243) и Glu 408 (242) необходимы для сохранения правильной конформации активного центра. Все 4 остатка вносят вклад в спектральные свойства гембелка. Коэффициент молярной экстинкции МПО в максимуме поглощения видимой области спектра (430 нм) равен 95 мМ"1см"1 [4].
Аминокислотный состав миелопероксидазы лейкоцитов крови человека [1]
Амино- кислота Количество остатков Аминокис- лота Количество остатков
Лиз 33 Цис 26
Арг 112 Вал 60
Гис 13 Мет 18
Асп 116 Иле 30
Глю 80 Лей 110
Тре 42 Тир 19
Сер 42 Три -
Про 73 Фен 48
Гли 65
Ала 63 Всего 1062
Очищенный препарат МПО из лейкоцитов крови человека, разделенный электрофорезом в полиакриламидном геле, состоит из шести изоформ [133]. Каждый изофермент представляет собой димер, состоящий из субъединиц двух типов. Изоферменты I, II и III различаются по реактивности к субстратам. Отличия между спектрами ЭПР изоформ МПО незначительны и сравнимы с минорными изменениями, индуцируемыми микроокружением фермента, такими как изменения рН или ионной силы [3].
Известно также, что при обработке МПО Р-меркаптоэтанолом, фенилмеркуробензоатом происходит диссоциация фермента на субъединицы с молекулярной массой 57 и 105 кДа. Молекула фермента имеет эллипсоидную форму, об этом свидетельствует фрикционное отношение, равное 1,26 [1].
Для МПО характерен общепринятый пе-роксидазный цикл [5], где при взаимодействии нативного фермента (МПО) с Н2О2 первоначально происходит двухэлектронное окисление МПО до соединения-! (МПО-!) с периодом жизни « 0,1 с (реакция 1) [1, 5]. Затем происходит последовательное одноэлектронное восстановление обратно до нативного фермента через редокс-состояние МПО-П (реакции 2 и 3); к!= (0,9-1,1)107 М"1с"1; к2=5,0104-5,0107 М" 'с-1; к3=3,0 103-1,2 105 М-1с-1[1, 5]:
МПО + Н2О2 к1 > МПО-I + Н2О (1);
МПО-I + АН2 к2 > МПО-П + АН' (2);
МПО-П + АН2 к3 > МПО + АН- + Н2О (3);
ЛИ’ + ЛИ’ --> А + АН или НА-АН (4).
Методом быстрой сканирующей спек-трофотометрии показано, что четкий спектр соединения I фиксируется в условиях 20-кратного избытка Н2О2. Образование соединения I обратимо, значения прямой и обратной реакции составляют 1,8107 М^с-1 и соответственно, Ы=3,2 мкМ. Переход фермента в ре-докс-состояния МПО-I и МПО-П контролируется участком гембелка с рКа*4,0. Редокс-потенциалы пар МПО-I/МПОII и МПО-П/МПО составляют +1,0 В [6]. В ряде случаев (2 и 3) определена энергия активации, значение которой колеблется в пределах 3-5 ккал/моль. Таким образом, МПО относится к числу самых активных из всех известных ферментов, а скорость реакций 2 и 3 близка к диффузионному пределу.
В нативной (окисленной) форме активный центр фермента находится в ферри-состоянии (Бе ш) [1]. Редокс-состояния фермента МПО-Е и МПО-П имеют феррильную структуру (Бе ™), но соединение-I в отличие от соединения-П содержит один неспаренный электрон (п-катионный радикал) на одном из ароматических аминокислотных остатков белковой глобулы или непосредственно на пор-фириновом кольце.
При наличии в системе Н2О2 в концентрации, превышающей необходимую для каталитического цикла, основная доля фермента переходит в относительно малоактивную форму - соединение III, что резко тормозит скорость суммарного процесса. Активный центр фермента в редокс-состоянии МПО-Ш имеет ферро-структуру (Бе п) [1].
Существуют данные [1], что субъединицы, из которых состоит молекула МПО, по не-
которым критериям отличаются друг от друга. Во-первых, в различной степени связываются простетические группы каждой субъединицы с апоферментом; гем одной из субъединиц связан с белком значительно слабее и может отделяться от белковой части этилацетатом. Во-вторых, эти неэквивалентные компоненты фермента при образовании окисленной формы МПО-ІІ взаимодействуют с субстратом с различной скоростью.
Особенность фермента заключается еще в том, что при его взаимодействии с Н2О2 в эквимолярном отношении окисленные состояния МПО-І и МПО-ІІ образуются только у одного из двух активных центров, другой же центр с Н2О2 не взаимодействует.
Для МПО характерны те же ингибиторы, что и для других пероксидаз. Так, 50 %-ное ингибирование пероксидазной активности происходит в присутствии 0,4 мкМ цианида и 2,6 мМ азида. В условиях взаимодействия МПО с С№ при концентрации ионов, близкой к эквимолярной, один активный центр остается незанятым. В то же время такая концентрация ингибитора полностью подавляет ферментативную активность. Взаимодействие МПО с С№ происходит через последовательное образование двух моноцианидных состояний фермента. Сначала образуется комплекс МПО-С№
І, который затем переходит в более устойчивую форму МПО-С№д. Аналогично этому происходит и взаимодействие фермента в ре-докс-состоянии МПО-ІІІ с С№.
Методом ЭПР показано, что вблизи активного центра существует центр, ответственный за специфическое связывание с ингибиторами, в частности с N"3 [1]. При добавлении нитрита фермент превращается в низкоспиновый комплекс со значениями g, равными 2,55; 2,3 и 1,8 [3].
Кривые тепловой инактивации МПО лейкоцитов крови человека также свидетельствуют о сложном характере взаимодействия субъединиц белка, не встречающемся у ферментов, которые содержат один активный центр, или ферментов, состоящих из эквивалентных субъединиц [1].
Все изложенное выше позволяет предположить существование у МПО аллостериче-ского взаимодействия между субъединицами, с изменением которого, очевидно, связаны и особенности функционирования фермента.
МПО нейтрофилов представляет собой составную часть сложной защитной системы организма. Во-первых, в жизнеспособных лейкоцитах МПО, благодаря своим функциональ-
ным особенностям, способна защитить клетки от токсического действия внутриклеточного пероксида водорода; фермент также окисляет образующуюся в процессе обмена мочевую кислоту. Во-вторых, МПО выполняет одну из ключевых функций в антимикробной системе, опосредованной нейтрофильными лейкоцитами. Бактерицидный эффект обусловлен образованием высокореактивного соединения - гипохлорида (ОСІ-), который атакует клетку микроорганизма [7]:
Н2О2 + СІ- + Н+ ^ НОСІ + Н2О,
НОСІ ^ ОСІ- + Н+ (рК 7,5)
Непосредственным окислителем для СІ-служит редокс-состояние фермента МПО-І, именно это состояние миелопероксидазы обеспечивает образование НОСІ. При взаимодействии ОСІ- с аминокислотными остатками белков образуются хлорамины, которые затем спонтанно гидролизуются, и после декарбок-силирования и дезаминирования образуются альдегиды, N^0 и СО2, деструктивному действию ОСІ- подвержены также липиды [5].
Кроме того, МПО, как катионный белок, может подавлять рост микроорганизмов не-
ферментативно. Это обусловлено способностью катионных полиэлектролитов связываться с отрицательно заряженными компонентами оболочки микробов, в результате чего изменяется проницаемость клеточных мембран.
В условиях генерации ОСГ возможно образование синглетного кислорода (:О2):
Н2О2 + ОС1- > :О2 + Н2О + С1-.
Следовательно, миелопероксидазная система продуцирует еще один токсичный метаболит кислорода - 1О2.
Выполняя защитную роль, нейтрофиль-ные лейкоциты способны причинить и вред организму. Так, при остром воспалении, аккумулируясь в очаге, они могут вызывать повреждение той ткани, которую инфильтрируют, поскольку образующиеся в результате работы НАДФН-оксидазной и миелопероксидазной систем чрезвычайно реакционноспособные
агенты (О2, 1О2, Н2О2, ОСІ-) выбрасываются не только в фагоцитирующую вакуоль, но и в цитоплазму и во внеклеточное пространство (рисунок) [8].
Фагоцитирующие лейкоциты (нейтрофилы)
ЫЛОРН-
(пентозный цикл)
ЫЛОР •*
Пероксидаза
•4
Н2О2
СОД і О2
Плазма Ре+2 ^ Ре+3
ЦП*
Глюкоза, \ мочевая \ кислота (ловушка радикалов)
Ткани
Пероксидация сывороточных липидов
Деполимеризация биополимеров
Эритроциты
Каталаза НЬРе+2 ^
► ОН'
А
ПОЛ
Ме(п-1-:
Н2О2 Меп+-хелаты
(Трансферрин, церулоплазмин, хелатные соединения Сі++ и Ре+++'
Тельца Гейнца
Активация фосфолипазы А2
пол/ пол * і
Арахидоновая кислота А А
Циклоокси- Липоокси-генация генация
X/02 02 *
Простаглан-дины,тром-боксаны
>■
Н2О2+О2 02 *
Каталаза Гидрокси-перокси- эйкотетра-дазы еновая кислота, лейкотри-ены
4
О2
Лизис
мембран
Пути превращения активизированных метаболитов кислорода в тканях (Е. Е. Дубинина, 1992)
В этой связи несомненный интерес представляют данные об относительной способности различных соединений ингибировать накопле-
ние активизированных метаболитов кислорода, т.о. сглаживать воспалительные реакции.
В заключении хотелось бы отметить, что высокую способность данного олигомерного белка к процессам ассоциации-диссициации составляющих его субъединиц необходимо учитывать при изучении проблем самоорганизации биологических макромолекул, механизмов регулирования гомеостаза организма человека, а также при исследовании функциональных свойств нативных белковых глобул и их составных компонентов или комплексов с другими органическими и неорганическими веществами.
Литература
1. Шафран М.Г. Миелопероксидаза нейтро-фильных лейкоцитов // Успехи совр. биологии. 1981. Т. 92. № 3 (6). С. 365-378.
2. Fiedler T.J., Davey C.A., Fenna R.E. X-ray crystal structure and characterization of halide-binding sites of human myeloperoxidase at 1.8 A resolution // J. Biol. Chem. 2000. 275. V. 16. P. 11964-11971/
3. Cooper Ch.E., Odell E. EPR differences between human myeloperoxidase isoenzymes // Biochem. Soc. Trans. 1992. V. 20. № 2. P. 188.
4. Domigan N.M., Charlton T.S., Duncan M.W., Witerbourn Ch.C. et. all. Chlorination of Tyrosyl Residues in Peptides by Myeloperoxidase and Human Neutrophils // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 28. P. 16542-16548.
5. Marquez L.A., Dunford H.B. Kinetica of Oxidations of Tirosine and Ditirosine by Myeloperoxidase Compounds I and II // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 5. p. 30434-30440.
6. Marquez L.A., Huang J.T., Dunford H.B. Spectral and kinetic studies on the formation of myeloperoxidase compounds I and II: Roles of hydrogen peroxide and superoxide // Biochemistry. 1994. V. 33. № 6. P. 1447-1454.
7. Выделение и характеристика миелоперокси-дазы лейкоцитов перитонеального экссудата. Морозов В.И., Цыпленков Н.В., Кокряков В.Н., Волков К.Н. и др. // Биохимия. 1997. Т. 62. № 6. С. 729-737.
8. Дубинина Е.Е. Антиоксидантная система плазмы крови // Укр. биохим. журнал. 1992. Т. 64. № 2. С. 3-15.
Воронежский государственный технический университет
MYELOPEROXIDASA: STRUCTURE-FUNCTIONAL MODIFICATIONS AND THE ROLE OF SUBUNITAL CONTACTS
L.T. Ryazantseva
Modern ideas about structure and functions of myeloperoxidase of neutrophils. Kinetical parameters of processes of the structure-functional modifications these proteins are analysed
Key words: myeloperoxidase, neutrophil, structura, kinetical parameters
