CC BY
231
ОБЗОРЫ
УДК 616.155.194-07
МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКИЙ СИНДРОМ: ТРУДНОСТИ И УСПЕХИ ДИАГНОСТИКИ
Зельцер А.Н.1, Морданов С.В.1, Снежко И.В.1, Шатохин Ю.В.1, Шатохина О.Н.2
Ростовский государственный медицинский университет Россия, 344022, Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29 2Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Россия, 344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63 azelcer@yandex.ru
Реферат
Миелодиспластический синдром представляет собой клональное заболевание кроветворной системы, характеризующееся цитопенией в периферической крови при достаточной клеточности костного мозга и морфологическими признаками дисгемопоэза в одной или нескольких гемопоэтических линиях. Стандартное метафазное цитогенетическое исследование костного мозга в сочетании с методом флуоресцентной in situ гибридизации, цитохимическая оценка обменных процессов в зрелых и незрелых клетках костного мозга играют важную роль в оптимизации диагностики и верификации формы миелодиспластического синдрома. Использование современных молекулярно-генетических исследований с целью выявления в кроветворных клетках больных миелодиспластическим синдромом дополнительных генетических и эпигенетических аберраций позволяет прогнозировать течение заболевания. Сочетание морфологичеких и генетических методов исследований кроветворной системы позволяет подобрать оптимальную патогенетическую терапию и тем самым повлиять на долгосрочный прогноз у больных миелодиспластическим синдромом.
MYELODYSPLASTIC SYNDROMES: DIFFICULTIES AND SUCCESSES OF DIAGNOSTICS
Zeltser A.N.1, Mordanov S.V.1, Snezhko I.V.1, Shatokhin Yu.V.1, Shatokhina O.N.2
Rostov state medical University 29 Nakhichevanskiy str., Rostov-on-Don, 344022, Russia 2Rostov Research Institute of Oncology 63 14 Line str., Rostov-on-Don, 344037, Russia azelcer@yandex.ru
Abstract
The myelodysplastic syndromes are clonal hematopoietic stem cell disorders of ineffective hematopoiesis that characteristically demonstrate peripheral blood cytopenia, bone marrow hypercellularity, and morphologically defined dysplasia of one or more hematopoietic lineages. Classical metaphase cytogenetics and judicious use of fluorescence in situ hybridization play central roles in the contemporary diagnosis and classification of myelodysplastic syndromes. An abundance of recent molecular studies are beginning to delineate additional genetic and epigenetic aberrations associated with these disorders. These alterations affect diagnosis, prognosis, and therapy, and with this understanding classification systems are evolving from a primarily hematological and morphological basis toward a multifactorial appreciation that includes histomorphology, metaphase cytogenetics, and directed molecular studies.
Миелодиспластический синдром — это гетерогенная группа заболеваний, характеризующаяся клональными поражениями кроветворной ткани и сопровождающаяся цитопенией в периферической крови на фоне высокой клеточности костного мозга. В 20-30% случаев миелодиспластический синдром со временем трансформируется в острый ми-елоидный лейкоз [1].
Миелодиспластический синдром практически не встречается у детей, риск заболеть этой патологией прогрессивно увеличивается с возрастом, достигая максимума у лиц старше 70 лет. Это обусловлено тем, что возраст-индуцированные генетические, эпигенетические и иммунные изменения гемопоэтических стволовых, полипотентных клеток-предшественниц увеличивают риск формирования клонов опухолевых клеток в костном мозге и формирования про-апоптотических, дисгемопо-этических нарушений. Стволовые клетки костного мозга при миелодиспластическом синдроме менее чувствительны к регулирующим гемопоэз цито-кинам, включая интерлейкин-3 и интерлейкин-6, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и гранулоцитарно-макрофагальный колониестиму-лирующий фактор [2, 3].
Врожденные поражения костного мозга, как анемия Фанкони, нейрофиброматоз, врожденный дискератоз, синдром Дауна и семейная тромбо-цитопения (связанная с мутацией гена ЯиКХ1 или СЕВРа) предрасполагают к развитию миелоди-спластического синдрома [4].
Этиология миелодиспластического синдрома неизвестна, предполагают возможную роль воздействия химических и физических мутагенов, включая цитостатическое и лучевое воздействия (особенно у пациентов с солидными злокачественными опухолями).
Благодаря усилиям франко-американо-британской группы экспертов в 1982 году впервые была разработана ФАБ-классификация миелодиспла-стического синдрома, усовершенствованная в 2001 году комитетом экспертов ВОЗ. Современная версия классификации миелодиспластического синдрома экспертами ВОЗ была утверждена в 2016 году, согласно которой в настоящее время выделяют следующие виды миелодиспластического синдрома [5, 6]:
• миелодиспластический синдром с однолинейной дисплазией;
• миелодиспластический синдром с кольцевыми сидеробластами с однолинейной и мультили-нейной дисплазией;
• миелодиспластический синдром с мультили-нейной дисплазией;
• миелодиспластический синдром с избытком бластов;
• миелодиспластический синдром с изолированной ёе1(5ц);
• миелодиспластический синдром неклассифицированный.
В основу утвержденной классификации мие-лодиспластического синдрома положены данные морфологического определения характера цито-пении в периферической крови, она также вклю-
чает новую дополнительную информацию о цито-генетических аномалиях. В предыдущих версиях классификации миелодиспластического синдрома много внимания уделялось специфическим типам цитопении (например, рефрактерной анемии). В новой классификации наиболее важным для выделения отдельных подтипов миелодиспластического синдрома является не тот или иной специфический тип цитопении, а степень дисплазии и процент бластных клеток, выявляемых в периферической крови и костном мозге [5].
Диагностика миелодиспластического синдрома достаточно сложна и часто проводится методом исключения гемопоэтических нарушений на фоне других заболеваний кроветворной системы и злокачественных солидных опухолей. Основными лабораторными критериями, позволяющими заподозрить миелодиспластический синдром, считаются [7]:
• стойкие (регистрируемые более 6 месяцев) значительные цитопении (гемоглобин менее 100 г/л, абсолютное количество нейтро-филов менее 1,8Ч109/л, тромбоцитов менее 100Ч109/л);
• выявление признаков дисгемопоэза не менее чем в двух ростках кроветворения (количество клеток с признаками дисплазии должно составлять не менее 10%);
• обнаружение типичных цитогенетических или молекулярно-генетических аномалий.
Известными морфологическими признаками нарушения эритропоэза при миелодиспластическом синдроме являются разнообразные нарушения размеров и форм эритроцитов: макроовалоциты, ги-похромные микроциты, пойкилоакантоциты. При этом в костном мозге характерно присутствие ме-галобластоидных форм с разреженной структурой хроматина, диссоциацией созревания ядра и цитоплазмы. Цитоплазма незрелых клеток эритроидно-го ряда отличается неравномерным окрашиванием, наличием базофильной пунктации. Могут встречаться многоядерные формы нормобластов и клетки с цитоплазматической перемычкой.
Дисмегакариоцитопоэз в периферической крови характеризуется появлением гигантских и аномальных форм тромбоцитов. В костном мозге обычно снижается количество мегакариоцитов, они представлены мелкими одно- или двухядерными формами. Встречаются мегакариоциты с разъединенными ядрами [8].
Ряд исследователей отмечают в нейтрофилах периферической крови больных миелодиспласти-ческим синдромом отсутствие или уменьшение зернистости, либо, напротив, указывают на содержание в них крупных гранул или телец Деле (клетки типа Чедиака-Хигаси), выявляют гипосегментацию ядер по типу аномалии Пельгера-Хьюэта или увеличение сегметированности ядер. В костном мозге морфологические изменения клеток гранулоцитар-ного ряда обычно менее выражены и проявляются в виде увеличения числа клеток митотического пула, уменьшении первичных гранул в промиело-цитах и миелоцитах, отсутствии специфической зернистости в миелоцитах и метамиелоцитах [9].
Как видно из представленных сведений, при миелодиспластическом синдроме морфологические изменения гемопоэтических клеток костного мозга характеризуются значительным разнообразием и в ряде случаев неотличимы от таковых при мега-лобластных анемиях, гетероиммунных цитопениях и других заболеваниях системы крови, вторичных гемопоэтических нарушениях. Выявляемые изменения не являются строго специфичными для первичной миелопоэтической дисплазии и не могут отражать процессы дисгемопоэза, облигатно предшествующие опухолевой клоновой трансформации гемопоэтических клеток [9].
По нашему мнению, наиболее оптимальным является оценка обменных процессов, протекающих в кроветворных клетках для раннего обнаружения их дисфункции. С этой целью целесообразно использование цитохимических методов исследования. При этом возможно ориентировочное определение количественных изменений тех или иных веществ как в общей популяции клеток, так и в отдельных клетках.
Для ориентировочного суждения о количестве вещества в изучаемой клетке применяют специальные окраски мазков крови и костного мозга. По интенсивности окраски клеточных элементов судят о количественных изменениях. Для более объективного суждения о содержании вещества в 1955 году был предложен метод полуколичественной оценки [10], модифицированный в 1957 году [11]. Суть метода заключается в подсчете в специально окрашенном мазке не менее 100 изучаемых клеток с последующим учетом их распределения по степени окраски. При этом выделяют четыре степени:
• 0-ая степень — реакция в клетке не определяется;
• 1-ая степень — в цитоплазме определяются единичные окрашенные зерна либо цитоплазма окрашена диффузно;
• 2-ая степень — исследуемое вещество в виде гранул заполняет почти всю цитоплазму, но местами участки цитоплазмы не окрашены;
• 3-я степень — интенсивно окрашенные зерна занимают всю цитоплазму и иногда проецируются над ядром.
Количественным выражением интенсивности окраски клеток является коэффициент Каг1ош, рассчитываемый по формуле: К=0а+1б+2в+3г/100. Цифры в числителе — это степень интенсивности окраски, а буквы — число клеток определенной интенсивности окраски [11].
Учитывая противоречивость данных литературы о цитохимических характеристиках клеток грану-лоцитарного ряда костного мозга при миелоди-спластическом синдроме, нами были изучены клетки этого ростка кроветворения в мазках костного мозга у больных с различными вариантами первичной миелопоэтической дисплазии, отнесенным к рефрактерным цитопениям без увеличения бласт-ных клеток в аспиратах костного мозга.
Обследованию были подвергнуты 116 больных миелодиспластическим синдромом (57 мужчин и 59 женщин) в возрасте от 32 до 76 лет. Отдельному
анализу были подвергнуты 10 пациентов с гипо-пластическим вариантом миелодиспластического синдрома (6 мужчин и 4 женщины). В качестве контроля были взяты 59 человек в возрасте от 16 до 75 лет, не имевшие заболеваний крови, а также патологических изменений в анализах крови и в миелограммах.
В гранулоцитарных клетках костного мозга были изучены:
• содержание общих липидов;
• активность пероксидазы;
• содержание углеводов (ШИК- реакция);
• активность альфа- нафтилацетатэстеразы;
• активность кислой фосфатазы;
• активность щелочной фосфатазы.
Исследование содержания липидов в клетках
гранулоцитарного ряда проводили с использованием окраски суданом черным по методу БЬеЬап, Бшггу с докрашиванием по Лейшману. В норме клетки гранулоцитарного ряда дают положительную реакцию, усиливающуюся с увеличением зрелости клетки. Миелобласты могут быть отрицательными или содержать всего несколько гранул, локализующихся в околоядерной зоне. В проми-елоцитах реакция может быть такая же, но дающая более грубую и интенсивную окраску, а в ми-елоцитах и метамиелоцитах нейтрофильного ряда содержится очень много суданофильных гранул. Полиморфно-ядерные нейтрофилы обычно имеют интенсивную окраску на липиды в виде гранул, которые заполняют почти всю цитоплазму с максимальным распределением над ядром. Таким образом, окраска на липиды позволяет определять «степень зрелости» гранулоцитов и выявлять аномальные «незрелые» клетки. Активность перокси-даз в гранулоцитах оценивалась с использованием метода Ьо1е [12].
Пероксидазы — это гемопротеидные ферменты, катализирующие быстрое окисление различных веществ в присутствии перекиси водорода. При изучении клеток гемопоэза в световом микроскопе активность пероксидаз в норме выявляется в клетках гранулоцитарного ряда — нейтрофилах и эозино-филах, начиная с миелобласта до сегментоядерных клеток в виде гранул, заполняющих цитоплазму. Наиболее часто пероксидазная реакция используется для дифференцирования бластов миелоидно-го и лимфоидного ряда. В лимфобластах реакция на пероксидазу всегда отрицательная. Уменьшение пероксидазной активности в нейтрофильных гра-нулоцитах отмечается при инфекционных лейкоцитозах, болезни Ходжкина, некоторых метаста-зирующих опухолях, в связи с чем несомненный интерес представляет изучение этого фермента в гранулоцитах на фоне рефрактерных цитопений у больных солидными опухолями [13].
Сопоставление активности пероксидаз при различных вариантах лейкозов свидетельствует, что активность этого фермента может определять степень зрелости цитоплазмы гранулоцитарных клеток и функцию пластинчатого комплекса. Снижение активности фермента в зрелых клетках может быть следствием нарушений, возникающих изна-
чально на уровне полипотентных клеток предшественниц, и соответственно определять степень выраженности клональных нарушений гемопоэза у больных первичной миелопоэтической диспла-зией.
Для обнаружения в клетках углеводов проводилась ШИК-реакция с использованием реактива Шиффа йодной кислоты (метод Макс Мануса), которая выявляет несколько классов углеводов: моносахариды, глико- и липопротеиды, полисахариды, производные инозитола и цереброзиды, фосфорилированные сахара. При положительной ШИК-реакции углеводы локализуются только в цитоплазме. У здоровых лиц в миелобластах и промиелоцитах может отмечаться слабоположительная реакция в виде диффузного розового окрашивания цитоплазмы. По мере созревания клеток интенсивность реакции увеличивается, появляются гранулы. Нарушения функции гранулоцитов, их «омоложение» проявляется в уменьшение числа и размеров ШИК-положительных гранул [14].
Активность альфа-нафтилацетатэстеразы определяли по методу Пирса [15]. Свойства этого фермента напоминают таковые химотрипсина. Активность его наиболее высокая в нейтрофиль-ных промиелоцитах, по мере созревания клеток она снижается. Предполагается, что этот фермент обеспечивает протеолитическую активность и переваривающую функцию нейтрофилов. Цитохимическое определение активности альфа-на-
фтилацетатэстеразы позволяет дифференцировать гранулоциты, их предшественники, моноциты и монобласты [15].
Изучение активности кислой фосфатазы в клетках гранулоцитарного ряда проводили с использованием метода Бибопе и Ы [15]. Кислая фосфатаза — это фермент, который относится к группе фосфо-моноэстераз и в основном локализуется в лизосо-мах. Он участвует в процессах дифференцировки фагоцитоза, пиноцитоза и разрушения клетки. Активность этого фермента в гранулоцитарных клетках-предшественницах более высока, чем в зрелых. Содержание кислой фосфатазы изменяется при ряде патологических состояний. В нейтрофилах повышение активности этого фермента отмечается при хроническом миелолейкозе, истиной полици-темии, миелофиброзе, инфекциях.
Щелочную фосфатазу в клетках определяли методом НауЬое, Quaglino в модификации Karlow [16]. Фермент является окислительным, принимающим активное участие в обменных процессах клетки (синтез фосфорных соединений, обмен липидов, нуклеиновых кислот и др.). Фермент локализуется во вторичных гранулах. В норме положительная реакция на фермент определяется в миелоцитах и достигает максимума в зрелых нейтрофилах и ретикулярных клетках.
Полученные результаты сравнивали с данными, выявленными у лиц контрольной группы (табл. 1, 2, 3).
Таблица 1
Цитохимические коэффициенты нейтрофилов у лиц контрольной группы, М±т
Возраст (годы) Гликоген Липиды Пероксидаза Щелочная фосфатаза Кислая фосфатаза
М .Ж М .Ж М Ж М Ж М Ж
16-35 (п=18) 2,57+ 0,121 2,32+ 0,118 2,42+ 0,122 2,36+ 0,111 2,49+ 0,099 2,36+ 0,089 0,49+ 0,087 0,48+ 0,068 0,79+ 0,025 0,86+ 0,086
36-60 (п=24) 1,93+ 0,153 2,22+ 0,136 2,45+ 0,133 2,56+ 0,124 2,25+ 0,128 2,55+ 0,222 0,80+ 0,099 0,71 + 0,099 0,68+ 0,110 0,69+ 0,059
61-75 (п=17) 1,99+ 0,144 1,98+ 0,187 2,56+ 0,123 2,50+ 0,048 2,36+ 0,111 2,44+ 0,089 0,22+ 0,048 0,51 + 0,084 0,44+ 0,036 0,38+ 0,020
Таблица 2
Цитохимические коэффициенты зрелых клеток нейтрофильного ряда костного мозга у лиц контрольной группы,
М±т
Возраст (годы) Гликоген Липиды Пероксидаза Щелочная фосфатаза Кислая фосфатаза
М Ж М Ж М Ж М Ж М Ж
16-35 (п=18) 1,89+ 0,070 1,92+ 0,034 2,65+ 0,100 2,48+ 0,210 2,50+ 0,070 2,58+ 0,060 0,34+ 0,070 0,41 + 0,200 0,39+ 0,070 0,43+ 0,130
36-60 (п=24) 1,92+ 0,080 1,75+ 0,056 2,44+ 0,190 2,66+ 0,220 2,36+ 0,090 2,69+ 0,110 0,38+ 0,100 0,44+ 0,190 0,39+ 0,090 0,41 + 0,080
61-75 (п=17) 1,88+ 0,055 1,78+ 0,049 2,48+ 0,110 2,69+ 0,190 2,59+ 0,100 2,39+ 0,080 0,40+ 0,090 0,46+ 0,100 0,41 + 0,100 0,44+ -0,120
Таблица 3
Цитохимические коэффициенты незрелых клеток нейтрофильного ряда костного мозга у лиц контрольной
группы, M±m
Возраст (годы) Гликоген Липиды Пероксидаза Кислая фосфатаза
М .Ж М Ж^ М Ж М Ж
16-35 (п=18) 0,85+ 0,060 0,98+ 0,090 1,75+ 0,170 1,88+ 0,210 2,14+ 0,050 2,20+ 0,080 0,96+ 0,050 1,01 + 0,080
36-60 (п=24) 1,01 + 0,110 0,99+ 0,100 1,84+ 0,190 1,56+ 0,090 2,10+ 0,090 2,22+ 0,090 1,10+ 0,080 0,99+ 0,040
61-75 (п=17) 0,87+ 0,080 0,88+ 0,090 1,77+ 0,190 1,89+ 0,200 2,18+ 0,040 2,17+ 0,080 1,21 + 0,120 1,05+ 0,920
При сопоставлении цитохимических показателей клеток гранулоцитарного ряда костного мозга в целом в группе больных первичной миелопоэти-ческой дисплазией и у представителей контрольной группы отмечено повышение содержания ли-пидов в зрелых нейтрофилах (2,17+0,34, р <0,05) при нормальных значениях в незрелых клетках (1,72+0,35).
У пациентов с миелодиспластическим синдромом при окраске на пероксидазу среди незрелых клеток преобладали клетки с нулевой степенью активности (92,7+2,39%), что статистически значимо отличалось от показателей контрольной группы (р <0,05). В зрелых клетках гранулоцитарного ряда изменения активности фермента не были значимыми (1,76+0,59, р >0,05).
Выявленные нами изменения свидетельствуют о нарушениях процессов созревания клеток грану-лоцитарного ряда в костном мозге больных мие-лодиспластическим синдромом с рефрактерными цитопениями. Согласно данным литературы, такие нарушения чаще всего регистрируются у пациентов с тяжелыми воспалительными процессами, вызывающими мобилизацию гранулоцитарных пулов и стимулирующие их пролиферацию и дифферен-цировку. У больных миелодиспластическим синдромом фиксируемые изменения со стороны внутриклеточных липидов и активности пероксидаз определялись в отсутствие клинически значимых воспалительных и инфекционных осложнений.
При изучении содержания гликогена в таких же клетках костного мозга больных миелодиспласти-ческим синдромом зафиксировано достоверное повышение содержания этого вещества как в зрелых (2,39+0,17, р <0,05) так и в незрелых элементах (1,08+0,14, р <0,05) за счет превалирования клеток с 2-й и 3-й степенями активности (97,2+4,83%). Эти изменения противоречат предварительным выводам о незрелости гранулоцитарных клеток, так как увеличение количества и величины гранул гликогена в этих клетках свидетельствует о достаточной их зрелости. Это подтверждает высокая активность альфа-нафтилацетатэстеразы (0,21+0,16, р <0,05) и кислой фосфатазы (незрелые клетки — 1,35+0,18; зрелые клетки - 1,04+0,26, р <0,05).
Активность щелочной фосфатазы в клетках гранулоцитарного ряда костного мозга у больных миелодиспластическим синдромом не отличалась от контроля (0,51+0,17, р >0,05). Очевидно, обнаруженные цитохимические нарушения в клетках
гранулоцитарного ряда костного мозга свидетельствовали о нарушениях процессов функционального созревания с менее выраженными нарушениями в обменных и ферментативных процессах, отвечающих за фагоцитоз.
Значительный интерес представили данные, полученные в группе больных гипопластическим вариантом рефрактерной анемии. Анализ препаратов этих пациентов — мазков, окрашенных по Романовскому-Гимза, позволил выявить типичные изменения клеток нейтрофильного ряда, характерные для миелодиспластического синдрома. Так, в зрелых формах (палочкоядерных и сегментоядер-ных) некоторых нейтрофилов обнаружены: гипо-или гиперсегментация ядер, отсутствие специфических гранул. В незрелых формах нейтрофильных гранулоцитов определялось уменьшение числа азу-рофильных гранул, появление необычно крупных гранул, неравномерная базофилия цитоплазмы [17].
Исследование результатов цитохимического выявления гликогена показало, что у больных с ги-попластическим вариантом миелодиспластического синдрома доля РАБ-положительных зрелых клеток нейтрофильного ряда (99,60+2,23) соответствовала контрольным значениям (99,67+0,47). Выявлена тенденция к увеличению значения суммарного цитохимического коэффициента у больных миелоди-спластическим синдромом (2,04+0,21) по сравнению с контрольной группой (1,89+0,07), что связано с увеличением доли клеток с 2-й и 3-й степенями активности. Впрочем, анализ значений ошибки средней величины, среднего квадратичного отклонения (0,66) и коэфициента вариации суммарного цитохимического коэффициента у больных миело-диспластическим синдромом свидетельствовал, что содержание гликогена в палочкоядерных и сегмен-тоядерных нейтрофильных гранулроцитах больных с гипопалстическим вариантом рефрактерной анемии является вариабельным признаком. Во всех случаях гликоген выявлялся в гранулярной форме.
В незрелых клетках нейтрофильного ряда обнаружено достоверное снижение доли РАБ-позитивных клеток (72,0+3,94, р <0,05), снижение содержания гликогена в каждой клетке (уменьшение доли клеток с 2-й и 3-й степенью активности) и, как следствие, тенденция к снижению значений суммарного цитохимического коэффициента у больных миелодиспластическим синдромом (0,75+0,05) по сравнению с показателями контрольной группы, в которой доля положитель-
ных клеток составила 84,67+3,15%, а суммарный цитохимический коэффициент — 0,85+0,06. Эти данные предполагают снижение содержания PAS-позитивных веществ в промиелоцитах, миелоцитах и метамиелоцитах костного мозга. Эти вещества в незрелых клетках нейтрофильного ряда во всех случаях выявлялись в диффузной форме.
Цитохимическое определение липидов показало, что как при гипопластической форме первичной миелопоэтической дисплазии, так и в контрольной группе 100% зрелых нейтрофилов дали положительную реакцию. Тем не менее, содержание липидов в зрелых нейтрофилах костного мозга больных мие-лодиспластическим синдромом было снижено, о чем свидетельствовало статистически значимое уменьшение суммарного цитохимического коэффициента (1,98+0,23; p <0,05) по сравнению с контролем (2,65+0,10). Это снижение может быть объяснено преобладанием у больных миелодиспластическим синдромом клеток с 1-й и 2-й степенями активности реакции. Липиды выявлялись в виде капель различного размера и в диффузной форме.
Среди незрелых форм нейтрофильных грануло-цитов не обнаружено отрицательно реагирующих клеток. Однако, в отличие от палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, разница в содержании липидов была менее заметна и статистически не достоверна по величине суммарного цитохимического коэффициента (при миелодиспластическом синдроме 1,63+0,18, в контроле — 1,75+0,17). Липи-ды выявлялись в виде капель и в диффузной форме.
Активность щелочной фосфатазы в нейтрофи-лах костного мозга больных гипопластическим вариантом миелодиспластического синдрома была низкой. Преобладали нейтрофилы с 1-й степенью активности (щелочная фосфатаза выявлялась преимущественно в виде нескольких гранул), значительно реже встречались клетки со 2-й степенью активности. Однако обращало на себя внимание двухкратное увеличение доли положительно реагирующих клеток при миелодиспластическом синдроме (68,20+7,95%) по сравнению с контролем (32,33+7,99%). В результате суммарный цитохимический коэффициент активности щелочной фосфатазы среди нейтрофилов костного мозга при миелодиспластическом синдроме был достаточно высоким (0,81+0,11) и почти в 2,5 раза превышал контрольное значение (0,34+0,10). В незрелых формах клеток нейтрофильного ряда костного мозга щелочная фосфатаза не была обнаружена, что соответствовало норме.
Активность кислой фосфатазы в зрелых нейтро-филах больных с гипопластическим вариантом ми-елодиспластического синдрома была низкой. Все клетки характеризовались первой степенью активности (фермент выявлялся в виде 1-2, редко — 3, мелких гранул). Тем не менее, как и при оценке активности щелочной фосфатазы, отмечено значительное увеличение числа положительно реагирующих клеток (при миелодиспластическом синдроме - 56,25+24,64%, в контроле - 37,67+4,04%). Характерным в случае выявления кислой фосфатазы явилось также повышение значения суммарного цитохимического коэффициента при миелоди-спластическом синдроме (0,61+0,16) по сравнению с контролем (0,39+0,07). Однако выявленное уве-
личение активности фермента кислой фосфатазы в палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилах костного мозга больных миелодиспластическим синдромом не было статистически значимым (p >0,05). Анализ ошибки средней величины, среднего квадратичного отклонения (по доле положительных клеток — 42,62+2,14%; по суммарному цитохимическому коэффициенту — 0,28+0,02) и коэффициента вариации (по доле положительно реагирующих клеток — 76+3,71%; по суммарному цитохимическому коэффициенту — 46+0,11) свидетельствовал о значительной вариабельности выявленных признаков. Таким образом, можно отметить тенденцию к увеличению активности кислой фосфатазы зрелых нейтрофилов в группе больных миелодиспластическим синдромом.
Активность кислой фосфатазы в промиелоци-тах, миелоцитах и метамиелоцитах костного мозга как больных миелодиспластическим синдромом, так и в контрольной группе была выше, чем в зрелых нейтрофилах. Кислая фосфатаза выявлялась в виде нескольких мелких и средних гранул. В этой популяции клеток также была выявлена тенденция к увеличению числа положительно реагирующих клеток при миелодиспластическом синдроме (83,0+7,00%) по сравнению с контрольной группой (77,7+4,69%). Несмотря на относительно низкую активность кислой фосфатазы в отдельных клетках, повышение доли положительно реагирующих клеток не сопровождалось статистически значимым повышением суммарного цитохимического коэффициента (при миелодиспластическом синдроме — 1,10+0,10; в контрольной группе — 0,96+0,05). Таким образом, в незрелых клетках гранулоцитар-ного ряда больных гипопластическим вариантом миелодиспластического синдрома, как и в зрелых нейтрофилах, отмечена тенденция к увеличению активности кислой фосфатазы.
Активность альфа-нафтилацетатэстеразы в зрелых нейтрофилах костного мозга как у больных миелодиспластическим синдромом, так и у лиц контрольной группы практически не выявлялась. В незрелых клетках нейтрофильного ряда обнаружена высокая активность этого фермента при миело-диспластическом синдроме. Отмечено двухкратное увеличение суммарного цитохимического коэффициента (0,73+0,15) по сравнению с контрольной группой (0,32+0,08). Это повышение частично обусловлено увеличением положительно реагирующих клеток (при миелодиспластическом синдроме — 48,5+4,58%; в контроле — 33,7+12,20%), но в большей степени за счет преобладания в этой популяции доли клеток со 2-й и 3-й степенями активности. Продукт цитохимической реакции на альфа-нафтилацетатэстеразу во всех случаях выявлялся в диффузной форме.
При ингибировании альфа-нафтилацетатэсте-разы фтористым натрием было отмечено заметное снижение активности фермента в незрелых формах нейтрофилов как у больных гипопластическим вариантом первичной миелопоэтической дисплазии, так и в контрольной группе.
Со стороны активности пероксидазы в палочко-ядерных и сегментоядерных нейтрофилах костного мозга было обнаружено ее снижение по показателю суммарного цитохимического коэффициен-
v4
та у больных миелодиспластическим синдромом (2,32+0,06) по сравнению с контрольной группой (2,50+0,07). Так как доля положительно реагирующих клеток при гипопластическом варианте ми-елодиспластическом синдроме (99,2+0,75%) практически не отличалась от контрольных значений (99,7+0,47%), то снижение активности реакции на пероксидазу может быть объяснено уменьшением доли клеток с высокой (2-й и 3-й степени) активностью. Пероксидаза выявлялась в обычной диффуз-но-гранулярной форме. В незрелых формах клеток нейтрофильного ряда костного мозга при миело-диспластическом синдроме и доля положительно реагирующих клеток (97,2+2,75%), и суммарного цитохимического коэффициента (2,1+0,25) практически не отличались от показателей контрольной группы, где они составили 100% и 2,1+0,05 соответственно. Однако у больных гипопластическим вариантом миелодиспластического синдрома в незрелых формах клеток отмечена вариабельность содержания пероксидазы. При этом у 4-х больных со 100%-ой положительной реакцией на перокси-дазу в незрелых формах варьировала доля клеток с высокой степенью реактивности, а у 1-го больного выявлено 11% отрицательно реагирующих клеток. Форма продукта реакции во всех наблюдениях была диффузно-гранулярной [17].
Таким образом, изучение цитохимических характеристик клеток нейтрофильного ряда костного мозга у больных гипопластическим вариантом ми-елодиспластического синдрома позволяет выявить ряд особенностей, имеющих диагностическое значение, а именно:
• тенденцию к увеличению суммарного цитохимического коэффициента гликогена в зрелых формах нейтрофилов на фоне значительной вариабельности содержания гликогена в каждой клетке;
• статистически значимое снижение суммарного цитохимического коэффициента гликогена в незрелых формах нейтрофильного ряда вследствие снижения количества PAS-позитивных клеток при одинаковом содержании гликогена в каждой клетке (p < 0,05);
• снижение суммарного цитохимического коэффициента липидов в зрелых и незрелых формах нейтрофилов;
• увеличение суммарного цитохимического коэффициента щелочной и кислой фосфатаз в зрелых и незрелых формах нейтрофилов костного мозга вследствие увеличения количества положительно реагирующих клеток при 1-й (низкой) активности в каждой клетке;
• существенное увеличение суммарного цитохимического коэффициента неспецифической эстеразы в незрелых формах нейтрофилов вследствие увеличения активности фермента в каждой клетке (увеличение доли клеток с 2-й и 3-й степенями активности) и увеличения числа положительно реагирующих клеток (p < 0,05);
• снижение суммарного цитохимического коэффициента пероксидазы в зрелых формах нейтрофилов вследствие низкой активности фермента в каждой клетке (уменьшение доли клеток с 2-й и 3-й степенями активности) при
неизменном числе положительно реагирующих клеток.
В основе патогенеза миелодиспластического синдрома лежат генетические и эпигенетические (преимущественно, гиперметилирование промоторов) нарушения в стволовых и незрелых гемопоэти-ческих полипотентных клетках-предшественницах, что приводит к нарушениям созревания и диффе-ренцировки гемопоэтических клеток с интенсификацией апоптоза, результатом которых является стойкая цитопения в периферической крови. Эти же генетические и эпигенетические поломки приводят к пролиферативным преимуществам патологических — лейкозных клонов клеток в костном мозге, вызывая развитие острого гемобластоза [18].
Стандартное цитогенетическое исследование играет одну из ведущих ролей в верификации диагноза миелодиспластического синдрома. Метод цитогенетического исследования костного мозга позволяет анализировать весь хромосомный набор клетки. По данным литературы хромосомные аномалии у больных с впервые установленным диагнозом de novo миелодиспластический синдром выявляются в 50% случаев. Частота выявления хромосомных аберраций увеличивается до 80% у пациентов с миелодиспластическим синдромом, находящихся уже на лечении (вторичный миелодиспластический синдром) [19].
Наиболее частыми хромосомными аберрациями при миелодиспластическом синдроме являются: делеция длинного плеча хромосомы 5 (del(5q)), которая встречается в 15% случаев; моносомия хромосомы 7 (-7) и/или делеция длинного плеча хромосомы 7(del(7q)), встречающаяся в 10% случаев; трисомия хромосомы 8 (+8), которая выявляется в 10% случаев [20].
Цитогенетический анализ аспирата костного мозга следует проводить всем пациентам с подозрением на миелодиспластический синдром. По возможности должно быть проанализировано не менее 20-ти метафаз, которые должны быть описаны в соответствии с рекомендациями Международной системы по цитогенетической номенклатуре человека [21]. Для выявления аномального клона необходимо определить в 2-х метафазах дополнительные хромосомы или же их структурные изменения, а потерю (утрату) хромосомы не менее чем в 3-х метафазах. Под комплексными аномалиями кариотипа понимают случаи с тремя или большим числом независимых изменений хромосом, выявленных не менее чем в 2-х метафазах [5].
Некоторые хромосомные аберрации рассматриваются как доказательство диагноза миелодиспла-стического синдрома даже в отсутствии убедительных морфологических признаков, а также широко используются для диагностики прежде всего так называемых «неклассифицируемых» вариантов заболевания. К таким хромосомным аномалиям относятся: делеция хромосомы 5 (del(5q), делеция хромосомы 7 (del(7q) / моносомия хромосомы 7, делеция хромосомы 13 (del(13q) / моносомия хромосомы 13; делеция хромосомы 17 (del(17p) / моносомия хромосомы 17 / изохромосома 17 (iso(17q)), делеция хромосомы 11 (del(11q), делеция хромосомы 12 (del(12p), а также любые хромосомные
транслокации с вовлечением 12р, делеция хромосомы 9 ^е1(9ц) и/или idic(X)(q13). Наличие таких хромосомных аномалий, как трисомии хромосомы 8, делеции хромосомы 20 (de1(20q), потеря у мужчин хромосомы У при отсутствии иных хромосомных аномалий, не являются прямыми признаками в пользу диагноза миелодиспластического синдрома, так как они встречаются и при других миелоидных неоплазиях [22]. Наличие трех и более хромосомных аберраций в кариотипе (комплексные хромосомные аберрации) указывает на неблагоприятное течение заболевания. Комплексные аберрации выявляются в 10-20% случаев у пациентов с первичным миелодиспластическим синдромом и в 45% случаев у пациентов с вторичным миелодиспласти-ческим синдромом. Остальные варианты аномального кариотипа у больных миелодиспластическим
Проведение цитогенетических исследований при миелодиспластическом синдроме обычно затруднительно в связи со слабой пролиферативной активностью патологического клона клеток и небольшим числом или даже отсутствием метафаз-ных пластинок, а также вследствие недостаточно четкой морфологии хромосом. Кроме того, патологический клон может не выявляться ввиду его малочисленности. В таких случаях следует выполнять флюоресцентную гибридизацию хромосом in situ (Fluorescence In Situ Hybridization — FISH) мо-лекулярно-цитогенетический метод анализа опухолевых клеток. FISH исследование является более чувствительным и специфичным методом по сравнению со стандартным цитогенетическим исследованием и позволяет выявить 1 опухолевую клетку среди 200-500 клеток. Метод FISH основывается на реакции гибридизации специфических ДНК-зондов с известными «комплиментарными» участками хромосом по принципу комплиментарного спаривания азотистых оснований ДНК. В качестве ДНК-зондов используют любые клонированные последовательности ДНК, выделенные фрагменты ДНК, целые хромосомы или их участки, отдельные гены и их фрагменты. Перед гибридизацией
синдромом разнообразны и встречаются редко, не имея прогностической значимости [23].
Сравнительно недавно международная рабочая группа по прогнозированию миелодиспластическо-го синдрома, проанализировав отдаленные результаты большого многоцентрового исследования по первичным больным миелодиспластическим синдромом, пересмотрела систему 1Р88. В частности, была определена прогностическая значимость большого количества даже весьма редких аномалий кариотипа, что позволило классифицировать их на 5 цитогенетических групп риска. В настоящее время пересмотренная прогностическая бальная система (IPSS-R) позволяет классифицировать заболевание на 5 прогностических групп, точно учитывая кариотип, количество бластных клеток и тяжесть отдельных цитопений (табл. 4) [24].
обязательно проводят конъюгацию ДНК-зондов со специфическими молекулами («метками»), которые маркируют данный зонд и позволяют визуализировать его локализацию непосредственно на исследуемых хромосомах (in situ).
Первым методом визуализации результатов гибридизации in situ был радиоактивный вариант детекции, впоследствии модифицированный в неизотопный — флюоресцентный [23]. FISH-анализ проводится на цитологических препаратах костного мозга с метафазными хромосомами (HM-FISH) или интерфазными ядрами (IP-FISH), на препаратах ядросодержащих форменных элементов крови. Рекомендуемые ДНК-зонды для диагностики мие-лодиспластического синдрома — 5q31, cen7, 7q31, cen8, TP53, 20q и cenY [25].
Нами обследовано 198 больных миелодиспластическим синдромом (96 мужчин и 102 женщины) в возрасте от 24 до 72 лет. Стандартному цито-генетическому исследованию были подвергнуты 72 пациента (36%). Из них нормальный кариотип имели 58 пациентов (80%), хромосомные аберрации — 12 пациентов (17%), у 2-х пациентов (3%) не удалось получить препараты хромосом. Большинство выявленных нами нарушений кариотипа
Таблица 4
Прогностическая шкала IPSS-R [24]
Прогноз Частота встречаемости (%) Аномалия (кариотип) Медиана выживаемости (годы)
очень хороший 4 -У, de1(11q) 5,4
хороший 72 нормальный, de1(5q), de1(12p), de1(20q), 4,8
средний 13 de1(7q), +8, +19, i(17q) 2,7
плохой 4 -7, -7/ de1(7q) комплексные хромосомные аберрации — 2-3 1,5
очень плохой 7 комплексные хромосомные аберрации — 3 и более 0,7
относились к числу подтверждающих диагноз миелодиспластического синдрома, а именно: делеция длинного плеча хромосомы 5 (del(5q), моносомия или делеция длинного плеча хромосомы 7 (del(7q) и трисомия хромосомы 8 (+8), реже — другие нарушения.
FISH исследование было проведено у 170 (86%) пациентов с миелодиспластическим синдромом с использованием 5q31, 5q33-34, 7q31, cen8, 12р13 и 20q ДНК-зондов. У 88 пациентов (52%) не было
выявлено хромосомных аберраций, 31 пациент (18%) имел комплексные хромосомные нарушения, связанные с хромосомами 5, 7, 8. У 24 пациентов (14%) были обнаружены хромосомные аномалии, связанные с хромосомой 8 (+8/-8), у 12 пациентов (7%) — нарушения хромосомы 7 ^е1(7ц)/-7), у 10 пациентов (6%) — делеция длинного плеча хромосомы 5 ^е!(5ц)), 5 пациентов (3%) имели хромосомные аномалии, связанные делецией хромосомы 12 ^е!(12р)) и хромосомы 20 ^е!(20ц)) (рис.).
52
14%
1К%
^ mSfíMU LtibdbiLLl карютт
□ Jül(5L|-y-5 dül(7L|-y-7 Нтрндемвх S/-S И сочетание ХА (-5. -7, \ 8) ® другие ХА
Рисунок. Хромосомные аберрации (ХА) у пациентов с миелодиспластическим синдромом, выявленные при FISH исследовании (собственные данные).
При использовании выбранной панели FISH исследования, менее чем в 3% были обнаружены хромосомные аномалии, которые не были обнаружены при стандартном цитогенетическом исследовании. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что уровень ложноположительных результатов при стандартном цитогенетическом исследовании очень низкий. Использование FISH метода с целью выявления хромосомных аномалий рекомендуется в случае неудач при проведении стандартного цитоге-нетического исследования и у пациентов с нормальным кариотипом.
Стандартное цитогенетическое исследование и рациональное использование FISH метода играют центральную роль в современной диагностике ми-елодиспластического синдрома. В течение многих лет большинством исследователей было получено очень ограниченное количество данных о специфических генных мутациях при миелодиспластиче-ском синдроме. Причиной этого являлся, в частности, тот факт, что сбалансированные хромосомные транслокации (которые позволили открыть «лей-козные» гены), очень редки при миелодиспластиче-ском синдроме, так как при миелодиспластическом синдроме в основном встречаются делеции крупных участков хромосом, что затрудняет идентификацию интересующих генов, которые могут играть важную роль в патогенезе и/или прогрессии миелодиспластического синдрома [23]. Однако появление методов секвенирования следующего поколения (NGS) в 75-80% исследованных случаев при миелодиспла-стическом синдроме помогло идентифицировать со-
матические мутации, которые составляют кластер из 4-х функциональных групп: сигнальные цитоки-ны (RAS), ДНК-метилтрасферазы (TET2, IDH х, DNMT3a), модификаторы гистонов (ASXL^ EZH2 гены), белки сплайсомы (SF3B^ SRSF2 гены) и мутаций в RUNX1 и TP53 генах. Большинство этих мутаций, кроме SF3B1 и TET2, ассоциируются с плохим прогнозом. Но есть и мутации (в основном TET2), которые ассоциируются с более благоприятным ответом на терапию гипометилирующими препаратами [26].
Частые мутации эпигенетических модуляторов при миелодиспластическом синдроме, по-видимому, в значительной степени способствуют эпигенетическому дерегулированию (в частности, гены гиперметилирования и деацетилирования гистонов) при прогрессировании миелодиспластического синдрома и объясняют эффективность гипометилирую-щих агентов при лечении миелодиспластического синдрома. В течение некоторого времени было известно, что гиперметилирование генов, таких как p15, может играть роль в прогрессировании миелодиспластического синдрома. Продемонстрированная эффективность гипометилирующих агентов, появление новых методов анализа клеточной и молекулярной биологии, обнаружение рекуррентных соматических мутаций в генах, кодирующих эпигенетические регуляторы, приводят к широкому изучению роли эпигенетических механизмов в развитии данного заболевания [27].
Эпигенетика — довольно современное направление современной науки, изучающее физиологиче-
02530248024802480223020102000201020102010230020002
ские и патофизиологические внутриклеточные процессы. Если генетика, в первую очередь, изучает процессы сохранения, изменения, реализации наследственной информации, которые связаны с особенностями нуклеотидной последовательности ДНК и ее изменениями, а также с числом и структурой хромосом, то эпигенетика изучает систему модификации генетического материала клеток, при этом структура ДНК (последовательность нуклеотидов) остается прежней, но модификация генома приводит к изменениям экспрессии транскрипционно-ак-тивных участков, то есть, в конечном итоге, меняет реализацию наследственной информации. Таким образом, эпигеном «настраивает», «регулирует» работу генома. В норме эпигенетическая регуляция играет важную роль в развитии, самообновлении, дифференцировке и пролиферации клеток. В ряде случаев такие изменения могут выходить за пределы нормы и приводить к нарушениям активности генов. Утрата или нарушения эпигенетического регулирования являются одной из причин развития онкологических заболеваний, в частности опухолей системы крови. Исследования экспрессии профиля генов и технологии секвенирования следующего поколения позволили уточнить молекулярный статус онкогематологических заболеваний. Они подтвердили, что аберрантная экспрессия и/или мутация регуляторов эпигенетических процессов относятся к последовательным патобиологическим процессам. Таким образом, возникающие при миелодиспласти-ческом синдроме нарушения активности генов, во многом, результат эпигенетических аномалий [28].
К наиболее активно изучаемым механизмам эпигенетического контроля реализации наследственной информации можно отнести, в первую очередь, метилирование ДНК, модификацию гистонов (аце-тилирование, фосфорилирование, метилирование, убиквитинирование и др.), а также регуляцию с помощью некодирующих РНК.
Процесс метилирования генома соматических клеток, как правило, заключается в добавлении ме-тильной группы (—CH3) к цитозиновым основаниям ДНК, в составе цитозин-гуаниновых динуклеотидов — метилирование так называемых CpG-островков (метилирование ДНК вне CpG-динуклеотидов является отличительной чертой эпигенома плюрипо-тентных стволовых клеток). Процесс осуществляется с помощью ферментов — ДНК-метилтрансфераз (DNMT), условно разделенных на 2 группы. К одной относятся метилтрансферазы, метилирующие ДНК de novo (DNMT3a и DNMT3b), которые осуществляют формирование паттерна метилирования. К другой группе относятся ДНК-метилтрансферазы, поддерживающие метилирование цепей ДНК в точках, где другая, комплементарная ей цепь, метилирована (DNMT1), в том числе сохраняя структуру, присущую материнской цепи при репликации ДНК. Удаление метильных групп из ДНК в результате отсутствия метилазной активности (пассивное деме-тилирование) реализуется после репликации ДНК. В активном деметилировании участвует ферментативная система, превращающая 5-метилцитозин в цитозин независимо от репликации. Такая модификация ДНК оказывает огромное влияние на экспрессию генов и, в конечном счете, на функцию клеток, тканей и организма в целом. Установлена
прямая зависимость между высоким уровнем метилирования ДНК и количеством репрессированных генов [27, 29, 30].
Метилирование может влиять на активность генов несколькими способами. В частности, ме-тильные группы могут физически препятствовать контакту фактора транскрипции (белка, контролирующего процесс синтеза информационной РНК на матрице ДНК) со специфичными участками ДНК. С другой стороны, они работают в связке с метилци-тозин-связывающими белками, участвуя в процессе ремоделирования хроматина [31, 32].
Утрата способности поддерживать метилирование ДНК может приводить к злокачественной трансформации клеток. Так, опухолевые клетки характеризуются масштабными изменениями системы метилирования ДНК: общим деметили-рованием генома, увеличением активности ДНК-метилтрансферазы с локальным гиперметилированием [32].
Деметилирование распространяется на рассеянные СрО-островки, содержание которых велико и составляет около 80% от общего числа, они метилированы в нормальных клетках. В то же время происходит локальное гиперметилирование СрО-насыщенных участков на, расположенных вблизи регуляторных регионов генов (процесс, тем самым, напоминает явление, известное как эпигенетический дрейф). Гиперметилированные островки нарушают взаимодействие регуляторных белков с промоторами, что вызывает инактивацию генов. Такого рода изменения считаются характерными для опухолевых клеток и рассматриваются в качестве одного из главных механизмов инактивации генов-супрес-соров опухолевого роста. У больных миелодиспла-стическим синдромом по мере прогрессирования заболевания возрастает вероятность метилирования генов-онкосупрессоров [27, 30].
Не менее важным механизмом эпигеномной регуляции является ацетилирование. Ферменты аце-тилирования и деацетилирования (ацетилтрансфе-разы) гистонов играют роль в ходе транскрипции. Эти ферменты катализируют ацетилирование локальных гистонов. Деацетилазы гистонов репрессируют транскрипцию. Эффект ацетилирования — это ослабление связи между ДНК и гистонами из-за изменения заряда, в результате чего хроматин становится доступным для факторов транскрипции. Ацетилирование представляет собой присоединение химической ацетил-группы (аминокислоты лизин) на свободный участок гистона. Как и метилирование ДНК, ацетилирование лизина представляет собой эпигенетический механизм для изменения экспрессии генов, не влияющих на исходную последовательность генов. Гистоновые модификации в результате нарушения ацетилирования принципиально отличаются от метилирования ДНК. Метилирование ДНК представляет собой очень стабильное эпигенетическое вмешательство, которое чаще закрепляется в большинстве случаев и приводит к формированию заболеваний, в частности, миелоди-спластического синдрома [31, 32].
Одним из механизмов взаимодействия между цитоплазмой и ядром является фосфорилирование и/или дефосфорилирование транскрипционных факторов. Гистоны были одними из первых бел-
v4
ков, фосфорилирование которых было обнаружено. Это осуществляется с помощью протеинкиназ. Под контролем фосфорилируемых транскрипционных факторов находятся гены, в том числе гены, регулирующие пролиферацию гемопоэтических клеток. Помимо описанных выше посттрансляционных модификаций гистонов имеются более крупные белки, такие как убиквитин, SUMO и др., которые могут присоединяться с помощью ковалентной связи к боковым аминогруппам белка-мишени, оказывая воздействие на их активность и определяя пролифе-
рацию, дифференцировку гемопоэтических клеток [27, 31, 32].
Приведенные нами литературные сведения и данные собственных исследований свидетельствуют о сложности диагностики миелодиспластического синдрома. Однако современные цитохимические, цитогенетические, молекулярно-биологические технологии позволяют повысить эффективность диагностики этого патологического состояния и оптимизировать тактику медикаментозной терапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Иванивская Т.С., Коваль С.В., Завелевич М.П., Украинская Н.И. и др. Новое в классификации ВОЗ миелоидных новообразований и острых лейкозов (пересмотр 2016 г.). Онкология. 2016; 18(3): 184-191.
2. Greenberg PL, Stone RM, Al-Kali A, Barta SK. Myelodisplastic syndromes, Version 2.2017. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 2017; 15(1): 60-86.
3. Niemeyer CM, Baumann I. Myelodysplastic syndrome in children. Semin Hematol. 2008; 45(1): 60-70.
4. Керндруп Г., Хасле Х. Цитоморфология МДС. Диагностические проблемы и характерные признаки МДС у детей. Гематология и трансфузиология. 1995; 40(2): 9-12.
5. Савченко В.Г., Паровичникова Е.Н., Кохно А.В., Семочкин С.В., Афанасьев Б.В. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению миелодиспластических синдромов взрослых (2015г.). Гематология и трансфузиология. 2016; 61(1), прил. 4: 3-31.
6. Arber DA, Orazi A, Hasserjian R. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2016; 127(20): 2391-2405.
7. Patnaik MM, Hanson CA, Sulai NH. Prognostic irrelevance of ring sideroblast percentage in World Health Organization-defined myelodysplastic syndromes without excess blasts. Blood. 2012; 119(24): 5674-5677.
8. Кононский А.И. Гистохимия: Учебное пособие для вузов. Кшв: Вища школа. 1976.
9. Savona MR, Malcovati L, Komrokji R. An international consortium proposal of uniform response criteria for myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms (MDS/MPN) in adults. Blood. 2015; 125(12): 1857-1865.
10. Karlow LS. Histochemical procedure for localizing and evaluating leucocyte alcaline phosphatase activity in smears of blood and marrow. Blood. 1955. 10(10): 1023-1029.
11. Astaldi G, Verga L. The glycogen content of the cell of lymphatic leukemia. Acta Haemat. 1957; 17: 129.
12. Дягилева О.А., Быкова И.А., Наумова И.Н., Шишина Р.Н., Савенко Т.А., Потапова С.Г. и др. Информативность цитохимических реакций на щелочную фосфатазу и мие-лопероксидазу для оценки функционального состояния нейтрофилов при ряде заболеваний. Гематология и транс-фузиология. 2001; 46(4): 38-41.
13. Смирнов А.Н. Цитохимические методы исследования и определение полового хроматина. Методическая разработка. М.: Каппа, 1995.
14. Двирнык В.Н. Цитоморфологическая характеристика изменений кроветворной ткани до и после эпигенетического и цитостатического воздействия у больных миелодиспласти-ческими синдромами: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2014.
15. Пирс Э. Гистохимия: теорет. и прикладная. М.: Изд-во иностр. лит., 1962.
16. Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. М.: Медицина, 1983.
17. Шатохин Ю.В., Снежко И.В., Куцев С.И., Сизякина Л.П. Клинико-морфологические, иммунологические особенно-
сти гемопоэтических нарушений у больных вторичным миелодиспластическим синдромом. Цитокины и воспаление. 2010; 9:139-142.
18. Мамаев Н.Н., Павлова В.А., Мамаева С.Е., Иванова Ю.С. Цитогенетика гемопоэтических дисплазий. Гематология и трансфузиология. 1988; 8: 42-44.
19. Olney HJ, Le Beau MM. Evaluation of recurring cytogenetic abnormalities in the treatment of myelodysplastic syndromes. Leuk Res. 2007; 31: 427-434.
20. Haase D, Germing U, Schanz J. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood. 2007; 110: 4385-4395.
21. Shaffer LG, McGowan-Jordan J, Schmid M, eds. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Basel: S. Karger, 2013.
22. Wang H, Wang XO, Xu XP, Lin GW. Cytogenetic evolution correlates with poor prognosis in myelodysplastic syndrome. Cancer Genet C^ogenet. 2010; 196:159-166.
23. Nybakken GE, Bagg A. The Genetic basis and expanding role of molecularanalysis in the diagnosis, prognosis, and therapeutic design for myelodysplastic syndromes. Molecular Diagnostics. 2014; 16(2): 145-158.
24. Greenberg PL, Tuechler H, Schanz J, Sanz G. International Prognostic Scoring System for myelodysplastic syndromes. Blood. 2012; 120:2454-2465.
25. Vorsanova SG, Yurov YB, Yurov IY. Human interpfase chromosome: a review of available molecular cytogenetic technologies. Molecular Cytogenetics. 2010; 3: 1-15.
26. Egger G, Liang G, Aparicio A, Jones PA. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 2004; 429: 457-463.
27. Itzykson R, Kosmider O, Fenaux P. Somatic mutations and epigenetic abnormalities in myelodysplastic syndromes. Best Practice & Research Clinical Haematology. 2013; 26: 355-364.
28. Ширин А.Д., Калетин Г.И., Баранова О.Ю. Эпигенетика в онкогематологии: краткий реферативный обзор. Клиническая онкогематология. 2015; 8(1): 26-30.
29. Baylin S, Esteller M, Routree MR. Aberrant patterns of DNA methylation, chromatin formation and gene expression in cancer. Hum. Mol. Genet. 2001; 10:687-692.
30. Kwok B, Hall JM, Witte JS. MDS-associated somatic mutations and clonal hematopoiesis are common in idiopathic cytopenias of undetermined significance. Blood. 2015; 126(21): 2355-2361.
31. Baylin SB, Herman JG. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics. Trends in Genetics. 2000; 16: 168-174.
32. Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG. A Gene Hypermethylation Profile of Human Cancer. Cancer Research. 2001; 61: 3225-3229.Запруднов А.М., Волкова А.И., Григорьев К.И. Справочник по детской гастроэнтерологии. М.: ГЭО-ТАР, 2007.
33. Коротько Г.Ф. Пищеварение - естественная технология. Краснодар: ЭДВИ, 2010.
