CC BY
19
УДК 636.13.082: 591.151
Шкавро Н.М., к.с.г.н. (shkavro@ukr.net) Ткачик Т.Е., к.б.н.(tim.tkachik@gmail.com) Россоха В.1., к.с.г.н. ©
1нститут тваринництва НААН, Хартв
ВИКОРИСТАННЯ М1КРОСАТЕЛ1ТНИХ ЛОКУС1В ДНК ДЛЯ ПЩТВЕРДЖЕННЯ ПОХОДЖЕННЯ КОНЕЙ ГУЦУЛЬСЬКО! ПОРОДИ
У статт1 наведет результаты тестування коней гуцулъсъког породи за мжросател1тними локусами ДНК. Локус ЛББ2 визначено як найбыъш пол1морфний (выявлено 5 алелъних вар1ант1в локусу та переважно гетерозиготт вар1анти генотитв, Н=0,727, Е=3,66, Р1С=0,700). На основ! пор1внялъного анал1зу електрофоретичних профыей батъюв та гх потомюв тдтверджене походження 12 коней за тръома мтросателтними локусами ДНК.
Ключое1 слова: ДНК, мшросателтш локуси, пол1морф1зм, експертиза походження, кош.
Вступ. У в1тчизняному конярств1 гостро сто1ть проблема оцшки та збереження генетичних ресурЫв. Згщно з даними експерт1в Всесв1тньо! продовольчо! оргашзаци ООН [1], основною перешкодою для розробки селекцшних програм з1 збереження локальних I аборигенних порщ сшьськогосподарських тварин е брак шформаци про генетичну структуру популяцш, так як статус ризику, який базуеться тшьки на чисельност1 погол1в'я, не вщображае повною м1рою картину можливих генетичних втрат. У конярств1 Укра!ни традицшно для вивчення генетично! структури порщ, а також при проведенш експертизи походження та щентифжаци коней, починаючи з 70-80 роюв XX стол1ття використовували локуси пол1морфних систем кров1 (еритроцитарш антигени I сироватков1 бшки) [2]. В даний час, вщповщно до рекомендацш КАО I вимог Мжнародного ком1тету з племшних книг (КБС), ¿з застосуванням як генетичних маркер1в м1кросател1тних послщовностей ДНК з'явилася можливкть надшно! генетично! щентифкацп кожно! тварини й досягнення максимально! ефективност1 контролю походження. Генетична експертиза походження коней за м1кросател1тними локусами ДНК мае ряд переваг, головна з яких - висока ефектившсть (надшшсть проведения генетично! експертизи походження та уточнения батьювства сягае 99,9%) у порщ. Вивчення генетично! структури мшцевих локальних нечисленних порщ тварин, що вирощуються в певних географ1чних I кл1матичних умовах, та пошук видо- та породоспещф1чних м1кросател1тних ДНК-маркер1в е досить актуальним, за умов подальшого обговорення виявлених законом1рностей на м1жнародних форумах з метою розширення та доповнення ¿снуючо! панел1
© Шкавро Н.М., Ткачик Т.Е., Россоха В.1., 2013
244
м1кросател1тних локуЫв для щентифшацп коней. В систем! мошторингового тестування коней, вщповщно до ISAG/FAO 2004, в якосп високошформативних генетичних маркер1в визначено панель з l7 м1кросател1тних локуЫв ДНК -AHT4, AHT5, ASB2, ASBl7, ASB23, HMSl, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTGl0, CA425, LEX3, VHL20. Проте найб1льш використовуваним в даний час е застосування явища пол1морф1зму м1кросател1тннх локуЫв ДНК саме для пщтвердження походження коней.
Матер1али та методи. Об'ектом дослщження внступала ДНК, що видшена з кров1 коней за методом Кавасаю з модифкащями (Kawasaki E.S., 1990). Дослщи проведен! на rpyni коней гуцульсько! породи НВА "Племконецентр" Свалявського району Закарпатсько! обл., що за записами в родовод1 характеризуються родинними зв'язками (n=20). Анал1з особливостей генетично! структури порщ коней за пол1морфними м1кросател1тними локусами ДНК проводили методом мультиплексно! ПЛР за використання наступних праймерш: для локусу HTG6 5/-CCTGeTTGGAGGCTGTGATAAGAT-3/ та 5-GTTCACTGAATGTCAAATTCTGCT-3/; для локусу ASB2 5 -CCTTCCTGTAGTTTAAGCTTCTG-3/ та 5 - CACAACTGAGTTCTCTGATAGG-3/; для локусу HMS2 5/-ACGGTGGeAACTGeCAAGGAAG-3/ та 5-CTTGCAGTCGAATGTGTATTAAAT-3 '. Режим проведения ампл1ф1каци: денатуращя ДНК при 96 С - 2 хв, дал1 l0 цикл1в за схемою: денатуращя ДНК при 96 С - 40 сек, вщпал праймер1в при 60 С - 40 сек, синтез ланцюпв ДНК при 7l С - 40 сек; пот!м 25 цикл1в за схемою - денатуращя ДНК при 90 С - 40 сек, вщпал праймер1в при 60 С - 40 сек, синтез ланцюпв ДНК при 7l С - 40 сек (в останньому цикл1 впродовж 3 хв). Детекщя продукпв ампл1ф1каци проводилась шляхом електрофоретичного розподшу молекул ДНК у В % пол1акршамщному гелев1 в денатуруючих умовах (у присутност1 сечовини), напружешсть поля 300V. Як барвник ДНК використовувався розчин 6poMÍCToro етидш в концентрацп l мг/см3. Як стандарт молекулярно! маси використовували DNA markers M50 та pUC ("Fermentas", Литва).
Результата дослщження. Для створення можливосп одночасного визначення пол1морф1зму декшькох м1кросател1тних локуЫв ДНК коней Í3 панел1, що запропонована ISAG, були проанал1зоваш нуклеотидш структури та температури вщпалу праймер1в для забезпечення ïx актив1зацп при однаковш температур! в однш реакцшнш cyMimi (проведения мультиплексно! ПЛР). Було визначено систему локуав (HTG6, ASB2 та HMS2), ампл1фковаш фрагмента яких за своею довжиною не переЫкаються. За формулою l розраховано температури плавления праймер1в та визначено оптимальну температуру вщпалу праймер1в, яка становила 60°С. Були пвдбраш параметри проведения мультиплексно! ПЛР - концентрация та кшьккть компоненпв реакцшно1 cyMimi, температурш умови проведения ампл1ф1каци.
ТПЛ(°С) = [(no + ifc) ■ 4] + [(nA + nx) ■ 2] (l),
де nA, nT, nG, nC - кшьюсть вщповщних нуклеотид1в y npañMepi.
245
За результатами проведеного анал1зу пол1морф1зму м1кросател1тних послщовностей ДНК пщконтрольнол! групи коней гуцульсько! породи (табл.1) встановлено високий пол1морф1зм за вЫма дослщженими локусами: за локусом НТО6 виявлено 4 алел1 та 5 вар1ант1в генотитв, серед яких 11,1% е гомозиготними; за локусом А8Б2 - 5 алелей та 6 вар1ант1в генотитв I визначено 1х 100% гетерозиготшсть. За локусом НМБ2 виявлено 4 алел1 та розподш гомо-та гетерозиготних генотитв на р1вш 0,188 та 0,812, вщповщно.
Таблиця 1
Розподш генотитв пщконтрольно! групи коней гуцульсько'1 породи
за мжросателггними локусами ДНК
Локус хромосома p03Mip, П.Н. шльшсть алелей шльшсть вар1ацш генотип1в гомозиготт генотипи, % гетерозиготш генотипи, %
HTG6 15 84-106 4 5 11,11 88,89
ASB2 15 154-188 5 6 - 100,0
HMS2 10 216-238 4 7 18,75 81,25
За кшькютю 1дентиф1кованих алел1в за дослщженими локусами i визначеними частотами алел1в, було розраховано ступен1 гетерозиготност1 - Н, ефективна к1льк1сть алелей в локуЫ - Ета 1ндекс ступеня пол1морф1зму - PIC (табл.2).
Таблиця 2
Популящйно-генетичш параметри, що обчислеш за м1кросател1тними
локусами ДНК тдконтрольно'1 групп коней гуцульсько'1 породи
Локус Алель Частота алелей H E PIC
HTG6 1 0,278±0,075 0,722 3,60 0,669
2 0,333±0,079
3 0,278±0,075
4 0,111±0,052
ASB2 1 0,156±0,062 0,727 3,66 0,700
2 0,406±0,084
3 0,219±0,071
4 0,188±0,067
5 0,031±0,010
HMS2 1 0,188±0,067 0,711 3,46 0,667
2 0,375±0,083
3 0,313±0,079
4 0,125±0,057
Так, значения ступеня гетерозиготност1 (Е ) перевищувало 70%.
Найвищими показниками оц1нюваних параметр1в для гуцульсько! породи характеризувався локус А8Б2 (Н=0,727, Е=3,66), який е найб1льш пол1морфним в досл1джен1й виб1рц1 коней. На основ! виявлених частот алелей проведено анал1з пол1морф1зму м1кросател1тних посл1довностей ДНК з
246
визначенням шдексу ступеня пол1морф1зму (PIC), значения якого для кожного локусу було на piBHi ионад 0,66, таким чином можна стверджувати, що дослщжеш локуси характеризуються високим р1внем пол1морфностг
3 метою пщтверджене иоходження коней за м1кросател1тними локусами ДНК за батьком, мат1р'ю, або за двома батьками, проведено тестування одночасно за трьома локусами, вщповщно до менделевського характеру успадкування. На рис.1 наведено алгоритм визначення походження шляхом пор1вняння бенд1в на електрофореграм1 (вщповщно визначеним алелям м1кросател1тного локусу) батьк1в та ïx потомив. За трьома м1кросател1тними локусами ДНК - HTG6, ASB2 та HMS2 було пщтверджене походження коней за двома батьками для 7 особин, за мат1р'ю - для двох особин пщдослщного стада, за батьком - для трьох коней.
1 2 345 678 9 10 M 11
□ [ " Г "СТ . ■ -
ШШШ Ц\к - 'О П Ш
I __
у ' Щ ' л ' /1
'"* щ.. . j , --- - \
Рис.1 Приклад перев1рки походження коней за локусами HTG6, ASB2 та HMS2. Доргжкн 1-11 - ДНК коней, включаючи батькт таУх нащадкчв, М -маркер po3MipiB фрагменте ДНК М50.
Висновки.
1. Розроблеш оптимальш параметри проведения мультиплексно! ПЛР за трьома мшросателтними локусами ДНК - HTG6, ASB2 та HMS2 для дослщження генетично! структури популяцш коней.
2. Анал1з розподшу алелей та генотитв м1кросател1тних локуав ДНК гуцульсько! породи коней виявив високий пол1морф1змом локуЫв HTG6, ASB2 та HMS2, найбшьш шформативним е локус ASB2 (H=0,727, E=3,66, PIC=0,700).
3.Використання мультиплексно! ПЛР (HTG6+ASB2+HMS2) дозволяе виршувати cnipHi питания експертизи походження племшних коней за умов пор1вняльного анал1зу електрофоретичних профшей м1кросател1тних локуЫв ДНК батьюв та !х потомюв.
247
Л1тература
1. The state of the world's animal genetic resources for food and agriculture/ Commission on genetic resources for food and agriculture food and agriculture organization of the united nations - Rome. - 2007// http ://www.fao. org/docrep/010/a1200e/a1200e00.htm
2. Bowling, A.T. The genetics of the horse/A.T.Bowling, A.Ruyinsky// Wallington. - 2000. - 203 p.
3. Эрнст, Л.К. Биологические проблемы животноводства в XXI веке/Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева// M.: РАСХН. - 2008. - С.228-288.
4. Храброва Л.А. Генетическая дифференциация чистокровных пород лошадей по локусам микросателлитов ДНК / Л. А. Храброва, М.А. Зайцева, Л.В. Калинкова//Сельскохозяйственная биология. - 2008. - №2. - С. 31 - 34.
5. Van De Goor L.P. A proposal for standardization in fgorensic equine DNA typing: allele nomenclature for 17 equine-specific STR loci/L.P. van De Goor, H. Panneman, W.A. van Haeringen//Animal Genetics. - N.41. - 2009. - P.122-127.
6. Felicetti M. Genetic diversity in the Maremmano horse and its relationship with other European horse breeds /M. Felicetti, M. Lopes, A.Verini-Supplizi, [et al.] //Anim. Genet. - 2010. - N.41. - Suppl. 2. - P. 53-55.
7. Kwiatkowska J. Powtorzenia sekwencji mikrosatelitarnych w genomie czlowieka/J. Kwiatkowska, R. Slomski//Post. Biol. Kom. - 1996. - N 23. - P. 1929.
Summary Shkavro N., Tkachik T., Rossoha V., Institute of animal science NAAS, Kharkov, Ukraine MICROSATELLITE DNA LOCI POLYMORPHISM APPLICATION FOR HUTSUL HORSES BREED PARENTAGE CONTROL
The article highlights the results of Hutsul horses breed testing by microsatellite DNA loci. The ASB2 locus defined as the most polymorphic (the five allelic variants and high heterozygosity genotype level were detected, H = 0,727, E = 3,66, PIC = 0.700). The origin of 12 horses by three microsatellite DNA loci was confirmed based on a comparative analysis of electrophoretic profiles of parents and their offspring.
Key words: microsatellite DNA loci, polymorphism, parentage control,
horses.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Щербатий 3.£.
248
