Межполушарная асимметрия церебрального аминокислотного пула при субтотальной ишемии головного мозга крыс Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Межполушарная асимметрия церебрального аминокислотного

пула при ишемии

головного мозга крыс

Ю.Е. Разводовский, В.Ю. Смирнов, Э.И. Троян, Н.Е. Максимович

УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Республика Беларусь

Патогенетические механизмы развития ишемического инсульта сложны и до конца не изучены, включая роль межполушарной асимметрии биохимической организации мозга.

Цель исследования: изучить содержание свободных аминокислот (АК) и их производных в коре больших полушарий головного мозга крыс при его субтотальной ишемии.

Материалы и методы. У 6крыс опытной группы субтотальную ишемию головного мозга моделировали путем перевязки обеих сонных артерий в течение 2 ч. Контролем служили 6ложнооперированных крыс. Анализ содержания АК и их дериватов проводили в хлорнокислом экстракте ткани методом обращенно-фазной хроматографии.

Результаты. Субтотальная ишемия головного мозга сопровождалась изменениями пула АК, характер которых в коре левого и правого полушарий был различным. В коре левой лобной доли больших полушарий снижался уровень глутамата, треонина, таурина, тирозина, триптофана и а-аминоадипиновой кислоты, а также повышался уровень орнитина. В коре правой лобной доли больших полушарий снижался уровень аспарагина, серина и фенилаланина.

Заключение. Характер изменений уровня АК в левом и правом отделах коры больших полушарий свидетельствуют о межполушарной асимметрии аминокислотного дисбаланса, развивающегося при ишемии головного мозга.

Ключевые слова: полушария мозга, субтотальная ишемия, аминокислоты, асимметрия.

Адрес для корреспонденции: 230009, Беларусь, Гродно, ул. Горького, д. 80. ГрГМУ. Е-mail: [email protected]. Разводовский Ю.Е.

Для цитирования: Разводовский Ю.Е., Смирнов В.Ю., Троян Э.И., Максимович Н.Е. Межполушарная асимметрия церебрального аминокислотного пула при субтотальной ишемии головного мозга крыс. Анналы клинической и экспериментальной невро-

The pathogenetic mechanisms of ischaemic stroke are complex and have not been fully studied, including the role of interhemispheric asymmetry in the brain's biochemical organization.

Study objective. To study the levels offree amino acids (AA) and their derivatives in the cerebral cortex of rats with subtotal cerebral ischaemia. Materials and methods. Subtotal cerebral ischaemia was modelled in 6 rats in the experimental group by ligation of both carotid arteries for 2 hours. Six rats with sham surgeries served as the control. The levels of AA and their derivatives was analysed in perchlorate tissue extract using reversed-phase chromatography. Results. Subtotal cerebral ischaemia was accompanied by changes in the AA pool, with differences found between the cortex of the left and right hemispheres. Glutamate, threonine, taurine, tyrosine, tryptophan and a-aminoadipic acid levels decreased in the left frontal lobe cortex, and ornithine levels increased. Asparagine, serine and phenylalanine levels decreased in the right frontal lobe cortex.

Conclusion. The nature of changes in the AA levels in the left and right halves of the cerebral cortex indicates interhemispheric asymmetry of amino acid imbalance, which develops in cerebral ischaemia.

Keywords: cerebral hemispheres, subtotal ischaemia, amino acids, asymmetry.

For correspondence: 230009, Belarus, Grodno, Gor'kogo str., 80. Grodno State Medical University. E-mail: [email protected]. Razvodovsky Yu.E.

For citation: Razvodovsky Yu.E., Smirnov V.Yu., Troyan E.I., Maksimovich N.E. [Interhemispheric asymmetry of the cerebral amino acid pool in rat with subtotal cerebral ischaemia]. Annals of clinical and experimental neurology 2019; 13(2): 41-46. (In Russ.)

DOI: 10.25692/ACEN.2019.2.5

логии 2019; 13(2): 41-46. DOI: 10.25692/ACEN.2019.2.5

Interhemispheric asymmetry of the cerebral amino acid pool in rat with subtotal cerebral ischaemia

Yury E. Razvodovsky, Vitalyi Yu. Smirnov, Elina I. TToyan, Natalya E. Maksimovich

Grodno State Medical University, Grodno, Republic of Belarus

Инсульт является одной из ведущих причин инвалидности и смертности во многих странах мира [1—4]. Патогенетические механизмы развития ишемического инсульта сложны и до конца не изучены. В патогенезе ишемического инсульта выделяют стадии биохимического каскада, включающие энергетический дефицит, глутаматную и аспартатную эксай-тотоксичность, окислительный стресс, воспалительные реакции, апоптоз [5-8]. Неполное представление о патогенезе ишемических повреждений головного мозга не позволяет осуществлять эффективную терапию. Одним из направлений детализации механизмов развития повреждения головного мозга при его ишемии является изучение изменений аминокислотного пула различных отделов мозга [9, 10].

Аминокислоты (АК) и их производные (в частности, биогенные амины) играют важную роль в функционировании головного мозга как в норме, так и при патологии, участвуя в биосинтезе мембранных белков, сигнальных молекул, гормонов и регуляторных пептидов [7]. Они также выступают в качестве источника энергии через цикл трикарбоновых кислот и участвуют в образовании углеводов путем глюконе-огенеза при их избытке [11]. До настоящего времени, однако, практически нет данных о межполушарной асимметрии АК-пула в норме и о ее возможной роли при развитии церебральной ишемии. Между тем изучение функциональной асимметрии при различных патологических процессах, в том числе асимметрии биохимической организации мозга, является актуальной задачей, поскольку может раскрыть закономерности течения заболеваний и выявить характерные признаки, улучшающие их диагностику.

Целью настоящего исследования явилось изучение пула свободных АК в коре левой (ЛЛД) и правой (ПЛД) лобных долей больших полушарий головного мозга крыс при его субтотальной ишемии.

Материалы и методы_

Эксперименты выполнены на 12 белых беспородных крысах-самках (по 6 животных в опытной и контрольной группах) массой 180-220 г. Контролировали температурный, световой и шумовой режимы. При выполнении экспериментов руководствовались принципами гуманного отношения к животным с соблюдением всех требований Директивы № 2010/63/EU от 22.09.2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей.

Крысам опытной группы моделировали субтотальную ишемию головного мозга путем перевязки обеих сонных артерий в течение 2 ч. Контрольную группу составили лож-нооперированные животные. Все оперативные манипуляции проводили в условиях внутривенного тиопенталового наркоза (60 мг/кг). После извлечения головного мозга осуществляли забор фрагментов коры ЛЛД и ПЛД больших полушарий, которые замораживали в жидком азоте. Выбор коры лобной области больших полушарий головного мозга в качестве объекта исследования обусловлен техническим удобством симметричного забора материала левого и правого полушарий.

Спектр определяемых соединений включал: протеиноген-ные АК, орнитин, цитруллин, а также ряд родственных соединений (таурин, оксипролин, а-аминобутират и эта-ноламин). Анализ АК и их дериватов проводили на хроматографе «Agilent 1100» методом обращенно-фазной хрома-

тографии с предколоночной дериватизацией о-фталевым альдегидом и 3-меркаптопропионовой кислотой в Na-бора-тном буфере [12].

Для статистической обработки данных с помощью программы «StatSoft Statistica 10.0» применяли методы описательной статистики, двухфакторный дисперсионный анализ связанных выборок, метод Bornta программы R для нахождения наиболее значимых показателей.

Результаты и обсуждение_

У контрольных животных не выявлено существенных различий в содержании АК в коре ЛЛД и ПЛД. Субтотальная ишемия головного мозга сопровождалась изменениями пула АК, характер которых в коре обоих полушарий был разным. В коре ЛЛД снижался уровень глутамата, треонина, таурина, тирозина, триптофана и а-аминоадипиновой кислоты (aAAA) и повышался уровень орнитина (рис. 1). Снижение уровней ароматических АК, как следствие, приводило к повышению соотношения АК с разветвленной углеводородной цепью и ароматических АК (табл. 1).

В коре ПЛД снижался уровень глутамата, аспарагина, сери-на, aAAA, треонина, таурина, фенилаланина, а также повышался уровень орнитина (рис. 2).

300 -

250 -

-С/ § 200 -

i 150 -j 100 -50 -

Glux0,01 aAAA Thrx0,1 Taux0,01 Tyr Контроль / Control ■ Ишемия / Ischaemia

Trp

Orn

Рис. 1. Уровни свободных АК и их производных в коре ЛЛД крыс (мкмоль/г).

Здесь и на рис. 2 приведены только показатели, уровни которых статистически значимо изменялись

Fig. 1. Levels of free AA and their derivatives in the left frontal lobe cortex of rats (^mol/g)

Here and in Fig. 2 only indicators whose levels were statistically significantly changed shown

Glux0,01 Asn Serx0,1 aAAA Thrx0,1 Taux0,01 Phe Контроль / Control ■ Ишемия / Ischaemia

Orn

Рис. 2. Уровни свободных АК и их производных в коре правой лобной доли больших полушарий головного мозга крыс (мкмоль/г)

Fig. 2. Levels of free AA and their derivatives in the right frontal lobe cortex of rat cerebral hemispheres (^mol/g)

_ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ. Экспериментальная неврология

Межполушарная асимметрия аминокислотного пула при церебральной ишемии

20000

Контроль / Control

Ишемия / Ischaemia

Контроль / Control

Ишемия / Ischaemia

Контроль / Control

Ишемия / Ischaemia

ЛЛД / LFL

Контроль/Control --А-- ПЛД / RFL

Ишемия / Ischaemia

си ьп

2400 2100 1800 1500 1200

2600 2400 2200 2000

Контроль / Control

Ишемия / Ischaemia

-^Ч VsN

1

Контроль / Control

Ишемия / Ischaemia

Контроль / Control

Ишемия/Ischaemia

Контроль / Control Ишемия / Ischaemia

Рис. 3. Анализ взаимодействия факторов «сторона лобной доли» и «наличие/отсутствие ишемии». На графиках показаны средние (мкмоль/г) и 95% ДИ.

Fig. 3. Analysis of the interaction between the 'frontal lobe side' and 'presence/absence of ischaemia' factors.

The graphs show the averages (^mol/g) and 95% CI

В обеих долях происходило обеднение суммарного пула АК (заменимых и незаменимых), при этом пул кетогенных АК оставался неизмененным (табл. 1). В целом изменения интегральных показателей в коре обеих долей совпадали, различия касались только пулов ароматических АК: в ПЛД соотношение АК с разветвленной углеводородной цепью и ароматических АК не увеличивалось.

Нарушения пула АК затронули и уровни нейроактивных АК: в обеих долях снижалась концентрация возбуждающих

(аспартат, глутамат) и тормозных (таурин, глицин) нейро-трансмиттерных АК, однако их соотношение не изменялось (табл. 1).

Анализ взаимодействия двух факторов (сторона больших полушарий и наличие/отсутствие ишемии) свидетельствует о различии влияния субтотальной ишемии на уровни тирозина, триптофана и орнитина в обеих долях. Уровень тирозина и триптофана изменялся только в ЛЛД, уровень орнитина повышался в коре обеих долей, однако в ПЛД это

Таблица 1. Интегральные показатели АК-пула коры ЛЛД и ПЛД головного мозга крыс при субтотальной ишемии (мкмоль/г) Table 1. Integral indicators of the AA pool in the left frontal lobe and the right frontal lobe cortices of rats with subtotal ischaemia (^mol/g)

Показатель / Indicator ЛЛД I Left frontal lobe ПЛД I Right frontal lobe

контроль I control ишемия I ischaemia контроль I control ишемия I ischaemia

Ароматические АК / Aromatic AA 491±30,5 342±15,2* 488±37,6 415±30,7

АК с разветвленной углеводородной цепью / AA with a branched hydrocarbon chain 821±56,9 839±43,6 814±69,2 853±54,1

Заменимые АК / Non-essential AA 52 800±1560 45 500±1130* 54 200±1340 44600±1170*

Незаменимые АК / Essential AA 3900±92,9 3250±214* 4010±110 3570±164*

Гликогенные АК / Glycogenic AA 55500±1630 47600±1120* 56 900±1330 46 900±1210*

Кетогенные АК / Ketogenic AA 799±29,8 915±65,1 842±38,2 952±93,4

Нейротрансмиттерные АК / Neurotransmitter AA 62 500±1820 50100±1750* 62 000±2590 48 200±1070*

Возбуждающие АК / Excitatory AA 34 300±1590 27 700±978* 35 900±1470 27 200±1100*

Тормозные АК / Inhibitory AA 28 200±2360 22 400±1020* 26 100±1870 21 000±1080*

Соотношение АК с разветвленной

углеводородной цепью и ароматических АК / Ratio of AA with a branched hydrocarbon 1,71±0,136 2,48±0,177* 1,73±0,177 2,11±0,205

chain and aromatic AA

Заменимые/незаменимые АК / Non-essential/essential AA 13,6±0,342 14,3±1,12 13,6±0,522 12,6±0,401*

Гликогенные/кетогенные АК / 70,4±4,34 53,3±4,96* 68,3±2,99 50,6±3,58*

Glycogenic/ketogenic AA

Возбуждающие/тормозные АК / Excitatory/inhibitory AA 1,28±0,139 1,24±0,0493 1,41±0,0965 1,31±0,101

Суммарный пул АК / Total AA pool 83 600±2320 70100±1550* 83 000±2590 68 300±1430*

Примечание. *p<0,05 по отношению к соответствующему контролю. Note. *p<0.05 relative to the corresponding control.

повышение было статистически значимо выше, чем в ЛЛД (рис. 3). Уровни фенилаланина, таурина, серина, треонина и глутамата снижались однонаправленно в обеих долях мозга.

Для нахождения наиболее информативных показателей традиционно используются пошаговые процедуры. Однако такой подход зачастую зависит от выбора начальных условий поиска, что может приводить к неоднозначным результатам. Поэтому для решения этой задачи нами была применена процедура Boruta из пакета статистических программ R, алгоритм которой не зависит от начальных условий.

Результаты применения процедуры ВогШ;а (рис. 4) показали, что наиболее значимыми показателями, характеризующими изменения АК-фонда коры ЛЛД при субтотальной ишемии головного мозга, являлись треонин, глутамат, ор-нитин, тирозин, аААА и таурин. В ПЛД наиболее значимыми были треонин, аспарагин, глутамат, серин, орнитин, в-аланин, фенилаланин и таурин.

Развитие асимметрии пула свободных АК коры лобной доли больших полушарий подтверждается методом многомерного анализа. Линейный дискриминантный анализ показал увеличение на плоскости двух главных

10-

5-

0-

-5-

ЛЛД I LFL

т

в

т

t

> о о о о о

I Т I I I I I I Т I I I I Т I I I I = .¡з £>< <_2_Е_2< = ¡^ ç с-*

ГТ Г "Г ГГ 1"ПТГТТ

л с .¡^ Jyo;

10-

5-

0-

-5-

ПЛД I RFL

Г» g'

.^îïJRi*

« оооооооооо

I I I I Т I I I I f I ! I I I I I

I I I I I

Рис. 4. Результаты применения алгоритма Boruta по отбору наиболее значимых показателей Fig. 4. Results of Boruta algorithm application to select the most significant indicators

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ. Экспериментальная неврология

Межполушарная асимметрия аминокислотного пула при церебральной ишемии

■

□ □ . ЛЛД контроль / LFL control □ —1 _n о 4 □ о ПЛД контроль / RFL control ■ ЛЛД ишемия / LFL ischaemia ■

• ■ ■

О 5 ........

С) о - W. • о ПЛД ишемия / RFL ischaemia •

Стандартизированные коэффициенты канонических дискриминант-ных функций

Standardized coefficients of canonical discriminant functions

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

Корень 2/Root 2

Рис. 5. Расположение групп на плоскости первых двух корней дискриминантной функции

Fig. 5. The position of the groups on the first two discriminant function roots plane

компонент расстояния между областями ПЛД и ЛЛД животных с ишемией (D2 Махаланобиса = 8,8) по сравнению с таковым для контрольной группы (D2 Махаланобиса = 2,3; рис. 5). Наибольший относительный вклад в значение 1-го корня дискриминантной функции вносили глутамат, треонин и триптофан, в значение 2-го корня — треонин и таурин (рис. 5). Анализ внутригрупповых коэффициентов корелляции переменных и стандартизированных канонических дискриминантных функций показал, что 1-й корень тесно связан с уровнем глута-мата, а 2-й — тирозина (рис. 5). Можно предположить интерпретацию корней как «общее» (т.е. не зависящее от стороны лобной доли — 1-й корень) и «специфическое» (2-й корень) действие ишемии, поскольку именно сдвигом группы «ЛЛД ишемия» вдоль 2-го корня обусловлена асимметрия АК-пула коры головного мозга при ишемии. Поскольку на долю 1-го корня приходится более 83% общей дисперсии (что значительно превышает соответствующий показатель для 2-го корня — 14,3%), «асим-

Корень 1 / Root 1 Корень 2 / Root 2 Корень 3 / Root 3

Glu 0,632 -0,545 -0,520

Thr 0,706 0,722 0,151

Tau 0,604 -0,636 0,199

Tyr -0,150 1,217 -0,048

Trp 0,839 -0,408 0,792

Факторная структура Factor structure

Корень 1 / Root 1 Корень 2 / Root 2 Корень 3 / Root 3

Thr 0,454* 0,365 -0,326

Tau 0,406* -0,301 0,023

Tyr 0,232 0,438* 0,156

Trp 0,167 0,012 0,843*

Glu 0,520 -0,032 -0,740*

метрия» АК-дисбаланса незначительна по сравнению с его выраженностью.

Таким образом, субтотальная ишемия головного мозга сопровождается выраженным дисбалансом АК-пула коры больших полушарий. Имеющиеся различия в характере изменений уровня АК в ЛЛД и ПЛД больших полушарий свидетельствуют о межполушарной асимметрии АК-дисбаланса при ишемии головного мозга. Полученные результаты носят предварительный характер не только из-за ограниченного количества животных, но и потому, что на основе данного материала трудно выдвинуть целостную гипотезу о различиях пула АК в правом и левом полушарии после субтотальной ишемии. В дальнейшем предполагается провести анализ возможных причин формирования асимметрии АК в полушариях, вызванной нарушением кровоснабжения мозга.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. The authors declare that there is no conflict of interest.

4

3

2

0

Список литературы

1. Feigin V.L., Norrving B., Mensah G.A. Global burden of stroke. Circ Res 2017; 120: 439-448. DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.116.308413. PMID: 28154096.

2. Стаховская Л.В., Клочихина О.А., Богатырева М.Д., Коваленко В.В. Эпидемиология инсульта в России по результатам территориально-популяци-онного регистра (2009-2010). Журнал неврологии и психиатрии 2013; 5: 1-10.

3. Разводовский Ю.Е. Потребление алкоголя и смертности от инсульта в Беларуси. Вопросы наркологии 2009; 6: 82-92.

4. Razvodovsky Y.E. Alcohol-attributable fraction of stroke mortality in Russia. J Neurol Sci 2013; 333: e231. DOI: 10.1016/j.jns.2013.07.905

5. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М., 2001.

6. Максимович Н.Е. Роль оксида азота в патогенезе ишемических и репер-фузионных повреждений мозга. Гродно, 2004.

7. Кулеш С.Д. Патогенез ишемического инсульта: Биохимические механизмы и роль нейроактивных аминокислот. Медицинские новости 1998; 1: 21-24.

8. Zablocka B., Domanska-Janik K. Enhancement of 3[H]D-aspartate release during ischemia like conditions in rat hippocampal slices: source of excitatory amino acids. Acta NeurobiolExp (Wars) 1996; 56: 63-70. PMID: 8787212.

9. Razvodovsky Y.E., Troyan E.I., Doroshenko Ye.M. et al. Levels of free amino acids and their derivates in the brain cortex of rats during unilateral ischemia. Int JNeurosci Behavior Sci 2017; 1 (1): 18-21.

10. Скворцова В.И., Раевский К.С., Коваленко А.В. Содержание нейротранс-миттерных аминокислот в спинномозговой жидкости больных острым ише-мическим инсультом. Журнал неврологии и психиатрии 1999; (2): 34-38.

References

1. Feigin V.L., Norrving B., Mensah G.A. Global burden of stroke. Circ Res 2017; 120: 439-448. DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.116.308413. PMID: 28154096.

2. Stakhovskaya L.V., Klotchichina O.A., Bogatyreva M.D., Kovalenko V.V. [Epidemiology of stroke in Russia according to results of territory-population register (2009-2010)]. Zhurnal nevrologii ipsychiatrii 2013; 5: 1-10. (In Russ.)

3. Razvodovsky Yu.E. [Alcohol consumption and stroke mortality in Belarus]. Voprosy narcologii 2009; 6: 82-92. (In Russ.)

4. Razvodovsky Y.E. Alcohol-attributable fraction of stroke mortality in Russia. J Neurol Sci 2013; 333: e231. DOI: 10.1016/j.jns.2013.07.905

5. Gusev E.I., Skvortsova V.I. [Ischemia of the brain]. Moscow, 2001. (In Russ.)

6. Maksimovich N.E. [Role of nitrogen oxide in the pathogenesis of ischemic reperfusion brain damage]. Grodno, 2004. (In Russ.)

7. Kulesh S.D. [Pathogenesis of ischemic stroke: biochemical mechanisms and role of neiroactive amino acids]. Meditsinskie novosti 1998; 1: 21-24. (In Russ.)

8. Zablocka B., Domanska-Janik K. Enhancement of 3[H]D-aspartate release during ischemia like conditions in rat hippocampal slices: source of excitatory amino acids. Acta Neurobiol Exp (Wars) 1996; 56: 63-70. PMID: 8787212.

9. Razvodovsky Y.E., Troyan E.I., Doroshenko Ye.M. et al. Levels of free amino acids and their derivates in the brain cortex of rats during unilateral ischemia. Int J Neurosci Behavior Sci 2017; 1 (1): 18-21.

10. Skvortsova V.I., Raevskiy K.S., Kovalenko A.V. [Concentration of neurotransmitters amino acids in the spinal cord liquid in patients with acute ischemic stroke]. Zhurnal nevrologii ipsychiatrii 1999; 2: 34-38. (In Russ.)

Том 13 № 2 2019

www.annaly-nevrologii.com

11. Fernstrom J.D. Branched-chain amino acids and brain function. J Nutr 2005; (6 Suppl): 1539S-1546S. DOI: 10.1093/jn/135.6.1539S. PMID: 15930466.

12. Барковский Е.В., Бокунь С.Б., Бородинский А.Н. и др. Современные проблемы биохимии. Методы исследований. Минск, 2013.

11. Fernstrom J.D. Branched-chain amino acids and brain function. J Nutr 2005; (6 Suppl): 1539S-1546S. DOI: 10.1093/jn/135.6.1539S. PMID: 15930466.

12. Barcovskiy E.B., Bokun' S.B., Borodinskiy A.N. et al. [Contemporary problems of biochemistry. Methods of investigation]. Minsk, 2013. (In Russ.)

Поступила 07.12.2018 Принята в печать 04.03.2019

Received 07.12.2018 Accepted 04.03.2019

Информация об авторах: Разводовский Юрий Евгеньевич — ассистент каф. патологической физиологии им. Д.А. Маслакова ГрГМУ, Гродно, Беларусь;

Смирнов Виталий Юрьевич — к.б.н., с.н.с. научно-исследовательской лаборатории ГрГМУ, Гродно, Беларусь; Троян Элина Ивановна — к.м.н., доц. каф. патологической физиологии им. Д.А. Маслакова ГрГМУ, Гродно, Беларусь; Максимович Наталья Евгеньевна — д.м.н., проф., зав. каф. патологической физиологии им. Д.А. Маслакова ГрГМУ, Гродно, Беларусь.

Information about the authors: Yury E. Razvodovsky, assistant, D.A. Maslakov Department of pathophysiology, Grodno State Medical University, Grodno, Belarus;

Vitalyi Yu. Smirnov, PhD (Biol.), senior researcher, Science and research laboratory, Grodno State Medical University, Grodno, Belarus; Elina I. Troyan, PhD (Med.), Assoc. Prof., D.A. Maslakov Department of pathophysiology, Grodno State Medical University, Grodno, Belarus;

Natalya E. Maksimovich, D. Sci. (Med.), Prof., Head of D.A. Maslakov Department of pathophysiology, Grodno State Medical University, Grodno, Belarus.