CC BY
36
22 БИОМАРКЕРЫ
EXTRACELLULAR ADHESION MOLECULES ICAM -1 (CD 54) and ICAM -3 (CD 50) in PATIENTS WITH PROLIFERATIVE DIABETIC RETINOPATHIA
Kochemasova T.V., Shestakova M.V., Milenkaya T.M., Smirnova N.B., Gorelysheva V.A., Polosukhina E.R., Baryshnikov A.Y., Dedov l.i. Endocrinology Research Center RAMS, Russian N.N. Blokhin memorial cancer research center RAMS ABSTRACT Our study is devoted to investigation of expression of extracellular adhesion molecules ICAM-1 (CD54) and ICAM-3 (CD50) in patients with proliferative diabetic retinopathia. It was shown that patients with proliferative stage of retinopathia and essentic neovascularisation have the statistically convincing increase of percent of CD54-positive lymphocytes and granulocytes of peripheral blood in comparison with healthy donors. This percent was 25,1 ±4,8% and 52,5± 1,6% vs 12,4±3,0 and 8,3±3,0, respectively. At the same time in the stage of stabilization of the process in the eye-ground the percent of CD54-positive lymphocytes and granulocytes in patients does not differ from the latter in healthy donors. So the expression of ICAM-1 (CD54) could be represent like implicit index of activity of the process, inter alia in the eye-ground. The study of expression of ICAM-3 (CD50) did not give statistically convincing difference between patients and the control group. Межклеточные молекулы адгезии ICAM -1 ( CD 54 ) и ICAM - 3 ( CD 50 ) у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией
Т.В.Кочемасова,1 М.В.Шестакова,1 Т.М.Миленькая,1 Н.Б.Смирнова,1 В.А.Горелышева,1 Е.Р.Полосухина,2 А.Ю.Барышников,2 И.И.Дедов.1 (Эндокринологический научный центр РАМН1, Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН2) РЕЗЮМЕ ных лимфоцитов и гранулоцитов не отличается от та-Данная работа посвящена исследованию экспрес- кового у здоровых доноров. Таким образом, экспрессии межклеточных молекул адгезии ICAM-1 (CD54) и сшо ICAM-1 (CD54) можно рассматривать как косвен-ICAM-3 (CD50) у пациентов с диабетической пролифе- нь™ показатель активности процесса, в частности, на ративной ретинопатией. Установлено, что у больных с глазном дне. пролиферативной стадией ретинопатии и выраженной неоваскуляризацией статистически достоверно возра- Введение стает процент CD54-позитивных Т-лимфоцитов и гра- Диабетическая ретинопатия ( ДР) является одним нулоцитов периферической крови по сравнению со здо- из самых тяжёлых микрососудистых осложнений са-ровыми донорами и составляет 25,1 ±4,8% и 52,5± 1,6% харного диабета ( СД ) и одной из основных причин vs 12,4±3,0 и 8,3±3,0. В то же время на стадии стабили- слепоты и слабовидения среди работоспособного насе-зации процесса на глазном дне процент С054-позитив- ления промышленно развитых стран Европы и Амери-
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ №3 Том 1
ки [1,10,16,18,19].
Данные эпидемиологических исследований указывают на то, что какая - либо стадия ретинопатии спустя двадцать лет после начала заболевания при СД1 типа отмечается почти всегда, а при СД 2 типа - более, чем в 60 % случаев [16]. Ewing et al указывают, что результирующий процент частоты развития ретинопатии у больных обоими типами СД равен 75 %. [23]
Многообразие диагностических подходов и сосуществование нескольких классификационных схем, разработанных в разное время и используемых в нашей стране и за рубежом, диктует целесообразность следования единому стандарту для характеристики стадийности процесса [Дедов И.И., Шестакова М.В., Максимова М.А., 2002].
В соответствии с принятой большинством клиницистов в настоящее время классификацией E.Kohner и M.Porta (1989 ) в течении ретинопатии выделяют три стадии - непролиферативную, препролиферативную, пролиферативную [1,10,18,19,25].
Изучается механизм межклеточных взаимодействий, нарушение которого может приводить к « повреждению «привычных клеточных коопераций, необходимых для нормального функционирования органов и тканей [6,7,11,13,15,17]. Полагают, что указанные межклеточные взаимодействия регулируются системой цитокинов, в частности, интерлейкином -1 ( ИЛ-1) и фактором некроза опухолей (TNF- б [6,15,17]. Именно они воздействуют на особые белковые структуры -молекулы адгезии и способствуют их усиленной экспрессии на поверхности различных клеток(20,22,24,26).
Ведётся активная работа по выяснению патогенетической роли эндотелия и форменных элементов крови в развитии и прогрессировании ДР [1,22,24,27]. Рядом исследователей молекулам адгезии отводится роль косвенных показателей активационно - адгезионной способности клеток [1,2,21,28]. Реакции с участием молекул адгезии и их контррецепторов между эндотелиальными клетками и форменнными элементами крови (лимфоцитами, гранулоцитами, моноцитами, тромбоцитами и др) внутри сосудов мелкого и крупного калибра в условиях неблагоприятных метаболических, гемодинамических и реологических сдвигов при СД могут способствовать возникновению зон микро и макротромбоза[1,3,21,29]. Как входе экспериментальных, так и клинических исследований обнаружено вышеупомянутое повышение уровня молекул адгезии на разных стадиях ДР - непролиферативной, препроли-феративной, пролиферативной[23,24,25,28,29]. Последняя выражается, главным образом, в появлении новообразованных сосудов на глазном дне, образовании зон фиброза и глиоза. Новообразование сосудов сетчатки происходит в ответ на ее ишемию. Физиологический и патологический ангиогенез - высококоорди-нируемый и многостадийный процесс [1,17,23,]. Новообразованные сосуды - структурно и функционально неполноценные и хрупкие - могут стать причиной обширных кровоизлияний сетчатки. В стимуляции пролиферации клеток принимают участие белки базальной мембраны (ламинин и факторы роста), фибронек-
тин и ангиогенные факторы ( металлопротеиназы, гиа-луронатныеолигосахариды)способствуют взаимодействию клеток с внеклеточным матриксом. Молекулы адгезии клеток, в частности, представители семейств иммуноглобулинов и селектинов, по мнению ряда исследователей, обладают проангиогенными свойствами. В связи с этим адгезины могут являться показателями активности процесса, в частности, на глазном дне (1,6).
Целью нашего исследования являлось определение экспрессии межклеточных молекул адгезии - 1 и 3 (ICAM -1 и 3 ( CD 54 и CD 50 ) , от англ. Intercellular Adhesion Molecule ) лейкоцитами у больных на пролиферативной стадии ДР.
Материалы и методы в исследование включены 23 пациента с СД 1 типа ( 6 мужчин и 17 женщин) и 17 лиц контрольной группы ( 7 мужчин и 10 женщин ). Медиана возраста в обеих группах составила 26, 5 0,6 лет.
Группа ( п = 23 ) с длительным течением СД 1 типа (медиана длительности заболевания 26,1 1,2 лет) и пролиферативной стадией ретинопатии ( ДР 3 ) была разделена на две подгруппы - с наличием обширных очагов неоваскуляризации ( п = 17 ) и стабилизированным процессом на глазном дне ( п = 6 ) .
Из исследования исключались лица с наличием других аутоиммунных заболеваний, воспалительных очагов любой локализации, болезней печени, злокачественных новообразований, заболеваний системы крови.
Офтальмологическое обследование проводили с помощью методов прямой и непрямой офтальмоскопии с фотографированием глазного дна на камере FF5 Zeiss.
Диагноз и стадию ДР устанавливали согласно классификации Е. Kohner и М. Porta, 1992
Лабораторное обследование включало биохимические исследования крови с определением уровня глики-рованного гемоглобина ( HbAlc), общего холестерина ( ОХ ) и триглицеридов ( ТГ).
Определение экспрессии CD 54 ( ICAM -1) и CD 50 ( ICAM - 3 ) на поверхности лейкоцитов ( лимфоцитов и гранулоцитов ) проводили при помощи моноклональных антител ( МКА ) против соответствующих антигенов, результаты учитывали методом проточной цитоф-люориметрии на проточном цитометре FACS сап (Beckton Dickinson ). К100 мл периферической крови добавляли 20 мкл МКА и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре , после чего клетки отмывали центрифугированием в PBS в течение 7 минут при 1500 об \ мин. Затем к клеткам добавляли по 20 мкл меченой антисыворотки барана против иммуноглобулинов мыши линии BALB \ С ( производство НПЦ «МедБиоСпектр» ) и инкубировали 30 мин при 4 С. Для удаления эритроцитов к клеткам добавляли 2 мл лизи-рующего раствора ( Becton Dickinson ) и тщательно перемешивали на вортексе. Инкубировали при комнатной температуре,в защищённом от света месте в течение 10 мин. Центрифугировали 7 мин при 1500 об \ мин. После проведения процедуры лизиса клетки отмывали дважды в PBS, после чего ресуспендировали в PBS, содержащим 1 % формалина и 0,1 % азида натрия. Экс-
прессию антигенов на лимфоцитах и гранулоцитах учи-тывали на цитофлюориметре FACScan (Beckton Dickinson). Гейт ( окно ) популяции клеток устанавливали на основе комбинации светорассеяния и размера клеток. При учёте реакции подсчитывали 5 ООО событий. Каждый маркёр считали диагностически значимым, если он выявлялся не менее, чем на 10 % исследуемых клеток.
Антитела любезно предоставлены профессором
А.Ю.Барышниковым.
Статистическая обработка материала проведена в отделе компьютеризации Гематологического Научного Центра РАМН (Директор - академик РАН АИ Воробьев ) совместно с Б.В.Зингерманом с использованием программ Excell и Statistica. Оценка достоверностей различий средних величин для независимых переменных осуществлялась по критерию Стьюдента (t).
Результаты и их обсуждение
Как известно, темп развития осложнений у больных СД может быть обусловлен комплексом взаимосвязанных и взаимообусловленных причин [1,4,5,8,9,12,18]. К ним относят характер дебюта заболевания, качество метаболического контроля, эффективность и адекватность проводимого лечения. Многочисленные исследования последних лет посвящены патогенетической роли генетических, гемореологических, метаболических, иммунологических факторов в развитии ДР [1,14,16].
У всех обследованных пациентов данной группы начало заболевания было острым и последующее течение диабета у них характеризовалось длительными периодами гипергликемии или нестабильностью уровня сахара крови.
При осмотре пациентов методами прямой и непря-
Таблица1
КЛИНИКО - ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАЦИЕНТОВ С ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИЕЙ И КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЫ
Контрольная группа ( п = 17) ДР 3 ( с наличием неоваскуляризации) (п = 17) ДР 3 ( со стабилизацией процесса) (п = 6)
пол, м \ ж 7 \ 10 5 \ 12 1 \ 5
возраст, годы 26,4 ±0,5 26,1 ± 1,2 25,8 ± 1,3
Длительность СД от момента диагностики, годы 14,9 ± 1,5 20,2 ±3,2
НЬ А1 с, % <6,2 11,1± 0,6* 8,6± 0,5*
О.холестерин сыворотки крови, ммоль\л 4,0± 0,27 6,27 + 0,64* 6,21± 0,37*
Триглицериды сыворотки крови, ммоль\л 0,99+ 0,08 1,99± 0,45* 1,21+ 0,15
СБ 54 на лимфоцитах, % 12,41± 3,02 25,13 ±4,8** 11,5 ±3,0
СБ 54 на гранулоцитах, % 8,33+ 3,01 52,5 ±1,62** 5,28± 1,62
СБ 50 на лимфоцитах, % 78,00+ 5,72 86,09 ±3,66 87,67± 4,27
СБ 50 на гранулоцитах, % 80,91± 5,15 94,89± 1,10 93,90± 2,76
Примечание * достоверно отличается от контрольной группы ( р<0,05)
** достоверно отличается и от контрольной группы, и от подгруппы с ДР 3 и стабилизацией процесса ( р<0,05 )
мой офтальмоскопии был выявлен выраженный рост новообразованных сосудов в области диска зрительного нерва и плоскости сетчатки. При этом у 7 больных процесс неоваскуляризации развился в достаточно короткие сроки ( от нескольких дней до недель ), что подтверждалось сопоставлением серии осмотров, проведенных при обращении пациентов к офтальмологу -эндокринологу. Анамнестически периодам столь выраженного прогрессирования процесса на глазном дне чаще всего предшествовали эпизоды гипогликемии (нередко ятрогенного характера), нервная или физическая нагрузка. Практически все больные этой подгруппы не соблюдали правил самоконтроля основного заболевания. Следует отметить, что на момент данного обследования этим пациентам ещё не проводилось лазерной коагуляции сетчатки. В этой же группе обследуемых отдельно были выделены пациенты со стабилизированным процессом на глазном дне (наличием редукции новообразованных сосудов, зон фиброза и глиоза ).
Примечательно, что практически у всех больных ( 85 % ) уже имелись признаки диабетической нефропатии, а также полинейропатии. Все пациенты с ДР 3 имели в анамнезе или находились на плановой терапии ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента.
Не было установлено достоверных различий между подгруппами с наличием неоваскуляризации и стабилизированным процессом на глазном дне по полу, возрасту и длительности СД1 типа от момента постановки диагноза СД 1 типа ( р > 0,05 ). Указанные подгруппы были также сопоставимы между собой по уровням НЬА1с, общего холестерина и триглицеридов, которые у пациентов с ДР 3 были очень высокими.
Данные, полученные в результате проведения иммунологического обследования больных и статистические достоверности различий, представлены в таблице-.
Пролиферативная стадия ДР с выраженной неовас-куляризацией характеризуется возрастанием значений СО 54 позитивных лимфоцитов до 25,13 4,8% и резким ростом таковых гранулоцитов - 52,5 1,62 %. В то же время, на стадии стабилизации процесса на глазном дне отмечается снижение экспрессии СО 54 на лимфоцитах до уровня 11,5 3,0 % и гранулоцитов до 5,28
1,62 %. Мы не выявили разницы между уровнем СБ 50 у пациентов с СД 1 типа и здоровых лиц ( р > 0,05 ).
Суммируя полученные данные, можно сделать предположение, что у больных СД 1 типа и ДР 3, сопоставимых по полу, возрасту, степени компенсации и длительности заболевания, но разной степенью активности процесса на глазном дне, активационно - адгезионная способность лимфоцитов и гранулоцитов, оцениваемая по уровню 1САМ -1 (СБ 54), неоднородна: высокая при наличии неоваскуляризации и низкая на стадии стабилизации процесса. Таким образом, 1САМ -1 (СБ 54) можно рассмотреть как косвенный показатель активности процесса, в частности, на глазном дне.
Нам не удалось установить корреляции между степенью экспрессии СБ 54 и СБ 50 на лимфоцитах и гра-нулоцитах и такими показателями как пол, возраст,
длительность СД, а также уровнями гликированного гемоглобина, общего холестерина и триглицеридов.
На сегодняшний день очень важным аспектом остаётся не до конца выясненный вопрос о природе описанных иммунологических показателей - молекул адгезии и их связи с метаболическим контролем [21,22,24,26,27]. Рядом исследователей высказывается предположение о том, что гипергликемия per se способна вызывать повышенную выработку цитокинов (TNF - б и IL -1), которые усиливают экспрессию молекул адгезии на поверхности различных клеток [6,17,24,26]. Как в нашем, так и в других исследованиях не выявлено корреляции между содержанием адге-зинов и уровнем Hb Ale, что не позволяет дать однозначный ответ на вопрос о влиянии гипергликемии на эти иммунологические показатели. Кроме этого, описанные выше различные стадии ретинопатии имеются у больных, отличающихся по количеству CD 54 позитивных лейкоцитов, но с одинаковым качеством метаболического контроля не подтверждает роли гипергликемии , как фактора, однозначно регулирующего изучаемые процессы.
Очень важное значение придается выяснению корреляционных зависимостей адгезивных молекул с рядом гемореологических показателей[28]. Проводятся исследования, посвященные изучению взаимосвязи представителей различных семейств адгезинов с фибриногеном, фактором фон Виллебрандта, тромбомо-дулином [6,17,29]. Мы также планируем проведение дальнейших клинико - экспериментальных трайлов по изучению обозначенных механизмов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Балаболкин М.И. \\ Сахарный диабет, Москва, Медицина, 2000
2. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. \\ Проблемы эндокринологиии, № 6, т.46, стр 29 - 34,2000
3. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская
В.М. \\ Сахарный диабет, №1(2), стр 2-8,1999
4. Бахритдинова Ф.А. \\ Вестник офтальмолога, т 112, № 2 \ 2, 1996
5. Беляева М.И., Шестаков В.А \\ Методические рекомендации, Москва, 1981
6. Боценовский В.А., Барышников'А.Ю. \\ Успехи современной биологии, том 114, вып 6, стр 741 - 753, 1994
7. Васильев C.А. \\ Автореферат.... Д.м.н., Москва, 1999
8. Ветров Ю.Д. \\ VII Съезд офтальмологов России, Москва, Тезисы докладов, стр 422, 2000
9. Герасимов A.A. \\ Автореферат....к.м.н., Москва, 1991
10. Дедов И.И., Фадеев В.В. \\ Руководство для врачей, Москва, 1998
11. Жабоедов Г. Д., Сидорова М.В., Скрипник Р. Л. \\ VII съезд офтальмологов России, Тезисы докладов, часть I, стр 436, 2000
12. Зайцева Н.С., Дудникова Л.К., Слепова О.С., Шевченко Т.Ф. \\ Вестник офтальмолога, том ИЗ, № 1, 1997
26
БИОМАРКЕРЫ
13. Ковальчук JI.B., Ганковская Л.В., Рубакова Э.И. \\ Система цитокинов, Москва, 1999
14. Миленькая Т.М, Бессмертная Е.Г \\ Врач, №1, стр 8- 11, 2000
15. Насонов Е.Л. \\ Русский медицинский журнал, том 8, № 17 (118), стр 718 - 722, 2000
16. Нестеров А.П.\\ Проблемы эндокринологии, № 3, том 43, стр 16-19,1997
17. Пальцев М.А., Иванов A.A. \\ Межклеточные взаимодействия \\ Москва, Медицина, 1995
18. Смирнова Н.Б. \\ Автореферат ... к.м.н., Москва, 1998
19. Смирнова О.М. \\ Диабетография, № 12, стр 15 -19, 1998
20. Abraham С, Griffith J, Miller J \\ Journal of Immunology, vol 162, № 8, pp 4399 - 4406, 1999
21. Ceriello A \\ Diabetes, Nutrition & Metabolism, Clinical and Experimental \\ vol 12,№ l,pp 42-47, 1999
22. Cominacini L, Garbin U, Fratta Passini A, La Cascio V \\ Diabetologia, Vol 39, № 10, pp 1242, 1996
23. D , Amore P \\ Investigative Ophthalmology and Visual Science \\ vol 35, № 12, pp 3974 - 3979, 1994
24. Fasching P, Veitl M, Rohac M, Streli C, Schneider B, Waldhausl W \\ Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, № 81 (12 ) , pp 4313 - 4317,1996
25. Kohner EM \\ British Medical Journal, 307, pp 1195 - 9, 1993
26. Limb G A, Webster L, Soomro H, Janikoun S, Shilling J \\ Clinical Experimental Immunology, 118(2), pp 213
