CC BY
10
Метрологическая оценка методов количественного определения микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны биотехнологических производств
Сычик С.И.
Республиканское унитарное предприятие«Научно-практический центр гигиены», Минск, Беларусь
Sychik S.I.
Republican Unitary Enterprise«The Scientific and Practical Center of Hygiene», Minsk, Belarus
Metrological assessment of the quantitative determination methods of active microbial strains in the air of biotechnological production zone
Резюме. Гигиенический контроль безопасности биотехнологических производств представляет собой самостоятельную медико-биологическую проблему поэтому разработка и метрологическая оценка инструментальных методов определения концентраций микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны в соответствии с требованиями ИСО является научно значимой и практически востребованной задачей. На основании результатов экспериментального моделирования биоаэрозолей микроорганизмов-продуцентов родов Bacillus и Pseudomonas в воздухе рабочей зоны как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологических производств рассчитаны метрологические параметры метода контроля двухкомпонентного микробного препарата с использованием двух оптимизированных сред культивирования. Оценка метрологических параметров по типу А (получение статистических оценок на основе результатов ряда измерений) подтвердила, что стандартное отклонение повторяемости, стандартное отклонение промежуточной прецизионности, расширенная неопределенность и др. соответствуют требованиям при принятой доверительной вероятности 95% и обеспечивают контроль биотехнологического производства. Ключевые слова: операционные характеристики, оптимизация состава сред метод эмпирического подбора, тип оценки микроорганизмы-продуценты, микробные препараты, модельный эксперимент, гигиенические нормативы, концентрация микроорганизмов-продуцентов, воздухрабочей зоны.
Медицинские новости. — 2020. — №6. — С. 81—83. Summary. Hygienic control of biotechnological production safety is an independent biomedical problem, therefore the development and metrological evaluation of instrumental methods for determining the concentrations of microorganisms-producers in the air of the working area in accordance with the requirements of ISO is a scientifically significant and practically demanded task. Based on the results of experimental modeiing of bioaerosols of microorganisms-producers of the Bacillus and Pseudomonas genera in the air of the working area as a risk factor for the health of biotechnological production workers, the metrological parameters of a two-component microbial control method were calculated using two optimized culture media. Estimation of metrological parameters by type A (obtaining statistical estimates based on the results of a series of measurements) confirmed that the standard deviation of repeatability, standard deviation of intermediate precision, extended uncertainty etc., meet the requirements wtth an accepted confidence level 95% and provide control of biotechnological production.
Keywords: operational characteristics, optimization of medium composition, empirical selection method, type of evaluation of microorganisms-producers, microbial preparations, model experiment, hygienic standards, concentration of microorganisms-producers, air of the working area. Meditsinskie novosti. - 2020. - N6. - P. 81-83.
дним из бурно развивающихся дисбиотических и диссеминирующих по-
0 направлений «зеленой» биотехнологии является производство микробиологических препаратов для биологической защиты и повышения урожайности сельскохозяйственных культур [5, 17, 18, 20, 22, 24-27]. Однако в процессе биотехнологических производств возможно загрязнение микроорганизмами-продуцентами производственной среды, выделение их в воздух рабочей зоны и атмосферы с вредным воздействием на здоровье работников и населения. Контакт с микробными аэрозолями является фактором риска здоровью работников биотехнологических производств [1, 4, 6-10, 14-16, 19, 23, 24]. В Республике Беларусь в результате комплексных токсиколого-гигиенических исследований, включающих оценку имму-но-аллергологических, гематологических,
казателей, выполнено гигиеническое регламентирование и установлены предельно допустимые концентрации для более чем 100 микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны [4, 7, 11-13, 21].
Эффективный производственный контроль биотехнологических производств основан на использовании вали-дированных инструментальных методов количественной оценки с оптимизированными параметрами. Принципиально важно, что метод оценки содержания микроорганизмов в воздухе рабочей зоны должен быть разработан, метрологически аттестован и утвержден перед началом биотехнологического производства продуцента. Как было показано ранее, моделирование микробных аэрозолей микроорганизмов-продуцентов в условиях лаборатории при разных
уровнях контаминации воздушной среды является перспективной технологией для разработки релевантных методов количественной оценки, набора статистических данных и расчета метрологических параметров методов [11-13, 21].
Разработка стандартизованных и валидированных методик выполнения измерений концентраций микроорганизмов-продуцентов представляет достаточно сложную аналитическую задачу и основана на учете совокупности параметров инструментального метода. Оптимизация среды культивирования является критической для разработки метода количественной оценки штаммов-продуцентов, так как в значительной мере обеспечивает требуемые метрологические параметры методики выполнения измерений [12]. Алгоритмы расчета операционных характеристик по типу А (получение статистических оценок
на основе результатов ряда измерений) в настоящее время являются наиболее эффективными [11, 12, 21].
Поэтому целью данной работы являлась оценка операционных характеристик оптимизированных инструментальных методов количественного определения микроорганизмов-продуцентов родов Pseudomonas и Bacillus в воздухе рабочей зоны биотехнологических производств на основе обширного массива данных моделирования микробных аэрозолей смешанной природы в затравочных камерах. Работа выполнена в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики GLP и стандартами ИСО.
Материалы и методы
Объектами исследования являлись микроорганизмы-продуценты Pseudomonas sp.-11 и Bacillus sp.-49. Штаммы депонированы в белорусских коллекциях непатогенных микроорганизмов.
В результате моделирования по методу эмпирического подбора были оптимизированы селективные среды. Среда 1: меласса - 30,0 г калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный - 7,0 г; калий фосфорнокислый однозамещен-ный - 3,0 г; сульфат аммония - 1,5 г; натрий лимоннокислый трехводный - 0,5 г; магний сернокислый семиводный - 0,1 г; агар микробиологический - 20 г; вода дистиллированная - 1 дм3, рН 7,1±0,1. Среда 2: триптон (гидролизат казеина) - 10,0 г; дрожжевой экстракт - 1,0 г; кальций хлористый безводный - 0,02 г; агар микробиологический - 15 г вода дистиллированная - 1 дм3, рН 7,2±0,2.
В работе использовали систему для создания жидких аэрозолей в затравочных камерах для токсикологических исследований объемом 250 л («Спектро-лаб», РФ); аспиратор SAS SUPER100 (PBI International, Италия), а также стандартное оборудование микробиологических лабораторий. Средства измерений и основное оборудование были должным образом проверены и калиброваны.
Для приготовления рабочих разведений микробных препаратов использовали фосфатный буферный раствор с 0,1% пептоном и рН 7,0. Для моделирования микробных аэрозолей использовали микробную суспензию с концентрацией 106 КОЕ/мл микроорганизма-продуцента.
Моделирование микробных аэрозолей проводили с помощью программного обеспечения затравочной
камеры. Осуществляли отбор проб воздуха в диапазоне объемов 10-50 л в зависимости от рабочей концентрации микроорганизмов-продуцентов в затравочной камере. Пробы воздуха отбирали аспирационным методом на поверхность агаризованных оптимизированных сред в двух повторностях. Пробы инкубировали в течение 48±2 ч при 30±0,5 °С на среде 1 и 36±4 ч при 30±0,5 °С на среде 2. Оценивали культурально-морфологические особенности сформированных колоний и подсчитывали число типичных колоний.
Расчет концентрации МО Х, КОЕ/м3, производили по формуле:
X=(Nx1000)/V где: Х - концентрация микробных клеток и спор в воздухе рабочей зоны; N - количество колоний МО на чашке; 1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха; V - объем отобранной пробы воздуха, дм3.
Результаты и обсуждение
Микроорганизмы родов Bacillus и Pseudomonas достаточно широко применяются для биологического стимулирования роста и развития сельскохозяйственных культур, а также в качестве средств биологической защиты [5, 7, 11-13, 21].
Разработанная технология количественного определения микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны в модельном эксперименте основана на классических этапах и приемах микробиологической практики: отбор проб воздуха аспирационным способом с учетом отобранного объема, культивирование в оптимальных для изучаемых микроорганизмах-продуцентах условиях на питательных средах оптимизированного состава, подсчет сформированных колоний с характерными морфологическими признаками, морфологическая идентификация микроорганизмов и колоний, расчет количества микроорганизмов на чашках с перерасчетом на 1 м3 воздуха.
Операционные характеристики для проведения метрологической аттестации МВИ были оценены в соответствии с требованиями международной организации по стандартизации (ИСО): определение показателей прецизионности (повторяемость и промежуточная прецизионность с изменяющимся фактором «оператор»), расширенной неопределенности и др. операционных характеристик, а также присущих для оценки биологических факторов показателей специфичности, чувствительности, частоты ложноположительных и ложноотрицательных результатов и др. [2, 3].
Для расчетов использованы результаты p=15 серий по n=2 единичных измерения. Проверку дисперсий на однородность выполняли по критерию Кохрена. Тест-статистику Кохрена Cr рассчитывали по формуле:
где: i - индекс серии измерений, i=1.....p, (p=15); Уи, yi2 У- результат измерений, преобразованный в log10 КОЕ/ м3 по формуле:
V/oflÄ;
Рассчитанное значение тест-статистики сравнивали с критическим значением Кохрена:
C (v = 2; f = 15; p = 95%) = 0,471. В случае выполнения условия Cr < C (v = 2; f = 15; P = 95%) считали, что статистические разбросы и выбросы отсутствуют.
Расчет стандартного отклонения повторяемости проводили по формуле:
г _ (у Р 'Vi i -Ун -
Значение предела повторяемости r, КОЕ/м3, рассчитывали по формуле:
г=2,8■ Sr.
Расчет стандартного отклонения промежуточной прецизионности проводили по формуле:
где: Yn - результат измерений, преобразованный в log10 КОЕ/м3; i - индекс образца, i=1 ... n (n=15); a, b - индекс фактора оператора, A или В.
Значение предела промежуточной прецизионности rL(O), log10 (КОЕ/м3), рассчитывали по формуле: гф) = 2,8■ Sl(or
Оценку неопределенности измерения проводили по ISO/TS 19036:2006.
Расширенную неопределенность U с коэффициентом охвата 2 (приблизительно соответствующим доверительному интервалу 95%) рассчитывали поформуле: U=2 ■ Sl0, где S^ - стандартное отклонение промежуточной прецизионности, log10 КОЕ/м3.
На основе массива данных, полученных в модельных экспериментах, были оценены операционные характеристики методов (табл. 1), а также показатели специфичности и селективности (табл. 2).
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
№6 • 2020
82
ЛИЦЯП Метрологические характеристики оптимизированных методов (тип оценки - А (статистический))
Метрологические характеристики Значение показателя
среда 1 среда 2
Стандартное отклонение повторяемости Sr 0,013 log10 КОЕ/м3 0,017 log10 КОЕ/м3
Предел повторяемости г 0,036 log10 КОЕ/м3 0,048 log10 КОЕ/м3
Стандартное отклонение промежуточной прецизионности (внутрилабораторной воспроизводимости) Sl(O)) 0,097 log10 КОЕ/м3 0,101 log10 КОЕ/м3
Предел промежуточной прецизионности Ф) 0,272 log10 КОЕ/м3 0,283 log10 КОЕ/м3
Расширенная неопределенность (к=2) и 0,194 log10 КОЕ/м3 0,202 log10 КОЕ/м3
ДНЯМ Показатели специфичности и селективности (тип оценки - А (статистический))
Показатели специфичности и селективности Значение
метод 1 метод 2
Чувствительность 0,98 1,0
Специфичность 0,5 0,9
Частота ложноположительных результатов 0,048 0,032
Частота ложноотрицательных результатов 0 0
Селективность 1,322 1,112
Эффективность 0,955 0,984
Верхний предел линейности Не более 150 колоний на чашку Не более 200 колоний на чашку
Таким образом, полученные значения метрологических параметров хорошо коррелируют с ранее полученными данными на основе результатов ряда измерений (тип А) для количественных методов оценки микроорганизмов-продуцентов родов Pseudomonas и Bacillus. Метрологические параметры методов (стандартное отклонение повторяемости, стандартное отклонение промежуточной прецизионности, расширенная неопределенность) соответствуют требованиям при принятой доверительной вероятности 95% и обеспечивают контроль биотехнологического производства. Использование селективной оптимизированной среды 2 обеспечивало получение более прецизионных метрологических характеристик аспирационного метода.
Заключение
В результате экспериментального моделирования аэрозолей микробных препаратов получены репрезентативные данные и оценены операционные характеристики аспирационного метода количественного определения штаммов Pseudomonas sp.-11 и Bacillus sp.-49 в воздушной среде с использованием двух оптимизированных сред. Подтверждено,
что методы обеспечивают объективный санитарно-производственный контроль содержания данных продуцентов в производственной среде на соответствие их гигиеническим нормативам. Формализованы подходы расчета операционных характеристик количественных методов контроля микроорганизмов в воздухе рабочей зоны для их оценки как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологических производств.
Автор выражает благодарность коллективам лаборатории микробиологии и лаборатории промышленной токсикологии республиканского унитарного предприятия «Научно-практический центр гигиены»за экспериментальное моделирование биоаэрозолей промышленных штаммов, что обеспечило получение массивов данных для метрологической оценки методов.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Изучение безопасности биотехнологических штаммов микроорганизмов с целью их гигиенического нормирования / Е.И. Буданова [и др.] // Вестн. Рос. акад. мед. наук. - 2010. - №11. - С.42-46.
2. ISO/TS 19036:2009. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководство по оценке неопределенности измерения для количественных определений.
3. ИСО 5725-2. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и
воспроизводимости стандартного метода измерений.
4. К вопросу о гигиеническом нормативе содержания в воздухе рабочей зоны микробного препарата Стимул / В.В. Шевляков [и др.] // Мед. журнал. - 2013. - №4. - С.135-139.
5. Коломиец Э.И. Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: Сб. науч. тр. / НАН Беларуси, Ин-т микробиологии. - Минск,
2018. - Т.10. - С.3-12.
6. Новые сведения о токсичности и опасности химических и биологических веществ микроорганизм Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi / Шеина Н.И. [и др.] // Токсикол. вестник. - 2018. - №1. - С.35-37.
7. Обоснование предельно допустимой концентрации (ПДК) в воздухе рабочей зоны микробного препарата Бетапротектин / В.В. Шевляков [и др.] // Медицинский журнал. - 2013. - №2 (44). - С.123-126.
8. Обоснование ПДК микроорганизма Beauveria bassiana штамм OPB-43 в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе населенных мест / Шеина Н.И. [и др.] // Токсикол. вестник. - 2018. - №4. -С.50-52.
9. Проблема биобезопасности промышленных микроорганизмов в России: настоящее и будущее / Шеина Н.И. [и др.] // Токсикол. вестник. - 2016. -№4. - С.2-10.
10. Проблемы и перспективы гигиенического нормирования биотехнологических штаммов микроорганизмов / Ю. П. Пивоваров [и др.] // Гигиена и санитария. - 2010. - №5. - С.9-12.
11. Разработка и валидация методик выполнения измерений содержания однокомпонентных микробных препаратов на основе штаммов-продуцентов родов Bacillus и Pseudomonas в воздухе рабочей зоны / Н.В. Дудчик [и др.] // Актуальные проблемы транспортной медицины. - 2016. -№4. - С.21-29.
12. Филонюк В.А. Методология гигиенического регламентирования микробных препаратов и разработки методик выполнения измерений содержания микроорганизмов в воздухе рабочей зоны / В.А. Филонюк, В.В. Шевляков, Н.В. Дуд-чик. - Минск, 2018. - 264 с.
13. Филонюк В.А. [и др.] // Мед. журн. - 2015. -№4. - С.128-136.
14. Шеина Н.И. // Вестн. Оренбург. гос. ун-та. -2012. - №6. - С.165-169.
15. Шеина Н.И., Иванов Н.Г. // Мед. труда и пром. экол. - 2010. - №5. - С.1-5.
16. A quantitative assessment of the morphofunctional activity of the population of mast cells exposed to biotechnological strains of microorganisms / N.I. Sheina [et al.] // Int. J. of Biomedicine. - 2018. - Vol.8, N2. - P.150-154.
17. Becker J., Wittmann C. // Angew. Chem. Int. Ed Engl. - 2015. - Vol.9, N54. - Р.3328-3350.
18. Becker J., Wittmann C. // Curr. Opin. Biotechnol. -2012. - Vol.23, N4. - P.631-640.
19. Biosafety assessment of microbial strains used in biotechnology according to their taxonomy // N.I. Sheina [et al.] // Int. J. of Biomedicine. - 2017. - Vol.7, N1. - P.51-56.
20. Chemical and biological environmental monitoring series. Preface. / H. Rudel [et al.] // Environmental Science and Pollution Research - 2009. - Vol.16, N5. - P.483-485.
21. Dudchik N., Fitanyuk V, Shevlyakov V, Sychik S. // J. of microbiol., biotechnol. and food sciences. -
2019. - Vol.4. - P.1054-1056.
22. Jullesson D., David F., Pfleger B., Nielsen J. // Biotechnol. Adv. - 2015. - Vol.15, N33. - Р.1395-1402.
23. Ladicsa G.S. Sewaltb V // Regul. Toxicol. and Pharmacol. - 2018. - Vol.98. - P.151-154. Safety of Novel Microbes for Human Consumption: Practical Examples of Assessment in the European Union / Brodmann T. [et al.] // Front. Microbiol. - 2017. -Vol.8. - P.1725.
24. Sang Yup Lee, Mattanovich D., Villaverde A. // Microb Cell Fact. - 2012. - Vol.11. - P.156.
25. Sang Yup Lee, Hyun Uk Kim // Nature Biotechnol. - 2015. -Vol.33. - P.1061-1072.
26. Vitorino L.C., Bessa L.A. // Front. Microbiol. -2017. - Vol.8. - P.827.
Поступила 27.09.2019 г.
