CC BY
30Национальная ассоциация ученых (НАУ) # IV (9), 2015 / БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
117
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ ИЗ ЭЯКУЛЯТОВ МУЖЧИН
Плосконос Мария Вячеславовна
кандидат биол. наук, доцент, ГБОУ ВПО Астраханский государственный медицинский университет Минздрава России, г. Астрахань, Каспийский институт морского и речного транспорта - филиал ФГБОУ ВО Волжский государственный университет водного транспорта, г. Астрахань
METHODS RECOVERED SPERMATOZOA MEN FROM EJACULATE
Ploskonos Mariia, Candidate of Science, assistant professor, Astrakhan State Medical University Health Ministry of Russian Federation, Astrakhan, Volga State University of Water Transport Caspian Institute of Sea and River Transport, Astrakhan АННОТАЦИЯ
Описаны методы выделения сперматозоидов из нативного эякулята: метод отмывания от семенной плазмы, метод всплытия «swim-up» и метод центрифугирования эякулята в градиенте плотности. Даётся сравнительная характеристика эффективности методов, а также описаны их недостатки. Выбор метода зависит от того, проводится выделение половых клеток для исследовательских целей или для клинического использования, а так же от характеристик эякулята и правил, предусмотренных в конкретной лаборатории. ABSTRACT
The methods of separation of sperm from the ejaculate of a native: the method of laundering of seminal plasma, the method «swim-up» and centrifugation method ejaculate density gradient. We give a comparative description of the effectiveness of methods and describes their shortcomings. The choice of method depends on the selection carried germ cells for research purposes or for clinical use, as well as the characteristics of the ejaculate, and the rules provided in a particular laboratory.
Ключевые слова: эякулят; сперматозоиды; «swim-up»; градиентное центрифугирование Keywords: ejaculate; spermatozoa; «swim-up»; gradient centrifugation
Эякулятом принято считать порцию сперматозоидов и спермоплазмы, выделяющуюся из уретры во время одной эякуляции. При проведении научных и лабораторных исследований, а так же при селекции клеток с целью дальнейшего их использования в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) бывает необходимо отделение половых клеток от спермоплазмы.
Для выделения сперматозоидов из нативного эякулята существуют разные методы: метод отмывания от семенной плазмы, метод всплытия «swim-up» и метод центрифугирования эякулята в градиенте плотности.
Важным условием при выборе того или иного метода является сохранение жизнеспособности и кинетических параметров мужских половых клеток после их выделения, а при выделении сперматозоидов с целью их селекции для программ ВРТ необходимым является получение фракции прогрессивно подвижных форм сперматозоидов с нормальной структурой хроматина.
Достаточно часто применяется метод отмывания, в результате которого нативный эякулят разделяют на сперматозоиды и семенную плазму центрифугированием при 1700g, сперматозоиды отмывают дважды физиологическим раствором, либо после разведения эякулята в 0,9 % NaCI (1:1) отмывание выполняют центрифугированием при 400g в течение 5 мин [2, 4, 6, 7, 9, 10, 11].
Однако, например, одним из направлений оптимизации программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) является разработка методов, позволяющих с наибольшей эффективностью выделить из эякулята фракцию прогрессивно подвижных сперматозоидов, используемую для инсеминации ооцитов, которая имела бы наилучшие показатели кинематики и морфологии. Поэтому наиболее широко применяемыми в ВРТ и в большинстве лабораторий для получения подвижной фракции используется метод всплытия «swim-up», либо фракционирование эякулята в градиенте плотности перколла (технология обработки спермы «Percoll» или «PureSperm»).
Метод «swim-up» отделяет сперматозоиды от остального состава эякулята исключительно на основании их подвижности, но не отделяет ни морфологически деформированные, ни сперматозоиды с нарушенным хроматином. Так же не удаляются бактерии и вирусы, присутствие которых и продуцируемых ими эндотоксинов или реакционноактивных соединений кислорода из клеток, мёртвых или погибающих сперматозоидов, оказывает губительное действие на функциональную полноценность хроматина, на оплодотворяющую способность и выживаемость всех сперматозоидов [8, 12].
Центрифугирование в градиенте плотности фракционирует клеточные популяции в соответствии с их плотностью и подвижностью. В процессе центрифугирования сперматозоиды перемещаются к той позиции в градиенте, которая отвечает их собственной плотности, другими словами, к их изопикнической точке. Поэтому сперматозоиды с неповрежденной ДНК находятся в прямой зависимости от доли сперматозоидов с интактной ДНК [17].
Кроме того, в процессе градиентного центрифугирования могут быть отделены другие клетки, присутствующие в эякуляте, например, лейкоциты и эпителиальные клетки, так же как мёртвые и погибающие сперматозоиды, которые служат источником реакционноактивных форм кислорода и могут вызывать оксидативный стресс [8]. Одновременное удаление сперматозоидов с повреждённым хроматином и источников реакционногенных видов кислорода должно смягчить воздействие их высокой концентрации на образцы спермы в процессе её обработки.
Считается, что применение перколла позволяет более полно выделить из нативного эякулята прогрессивно подвижные сперматозоиды [14]. В то же время популяция сперматозоидов, полученная при использовании метода «swim-up», характеризуется лучшими кинематическими параметрами, а также меньшим числом нежизнеспособ-
118
Национальная ассоциация ученых (НАУ) # IV (9), 2015/ БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ных и апоптотических сперматозоидов по сравнению с популяцией клеток, выделенных методами простого отмывания от семенной плазмы и непрерывного центрифугирования в градиенте плотности перколла [5, 13, 14].
Относительно того, какой из методов выделения фракции подвижных клеток в большей степени повышает долю морфологически нормальных сперматозоидов, нет единого мнения. Имеются указания как на преимущества использования перколла [16], так и «swim-up» [14], а также равную эффективность этих методов [13].
По данным Воробьевой О.А. и соавт. сравнительный анализ этих двух основных методов выделения прогрессивно подвижной фракции сперматозоидов показал, что метод «swim-up» более эффективен в селекции клеток с нормальным хроматином, чем градиент плотности [1]. Более того, после обработки в градиенте «PureSperm» в некоторых случаях степень повреждения ДНК - индекс фрагментации (ИФ) - повышался. Средний ИФ в эякуляте составлял 12%, после применения «swim-up» - 5,5% [15].
Воробьёва О.А. и Леонтьева О.А. [1, 3] считают, что наиболее эффективным для выделения из нативного эякулята фракции прогрессивно подвижных форм сперматозоидов и при селекции клеток с нормальной структурой хроматина, является комбинированный метод, суть которого заключается в последовательном применении центрифугирования в изотоническом 90% перколле, приготовленном по методике Кохена и дальнейшего всплытия сперматозоидов из полученного осадка. Эта модификация позволяет сочетать преимущества обеих методик [14]. В частности, было показано, что при этом эффективно повышается доля сперматозоидов с нормальной структурой хроматина. Применение комбинированного метода выделения прогрессивно подвижной фракции позволяет получить популяцию сперматозоидов со значительно лучшими морфологическими характеристиками по сравнению с нативным эякулятом как при нормо-, так и при па-тоспермии [3].
Анализируя данные разных исследований, проведённых как в России, так и за рубежом, можно сказать, что до настоящего времени не сложилось единого мнения какой метод лучше использовать для выделения сперматозоидов из нативного эякулята. Выбор метода зависит от того, проводится выделение половых клеток для исследовательских целей или для клинического использования. а так же от характеристик эякулята и правил, предусмотренных в конкретной лаборатории. Так, например, к недостатку методики «swim-up» следует отнести неадекватность подхода при выраженной астенозооспермии (низкой подвижности сперматозоидов). Подход градиентного центрифугирования применяется многими лабораториями, как штатный способ обработки спермы низкого качества.
Список литературы
1. Воробьёва О.А., Воскресенская А. В., Одинцов А. А. и др. Мужское бесплодие и нарушение структурной организации хроматина сперматозоидов. Существует ли связь? // Пробл. репрод. - 2005. - № 6. -С. 56-62.
2. Долгов В.В., Луговская С.А., Фанченко Н.Д. и др. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. - М.: Кафедра КЛД, 2006. - 145 с.
3. Леонтьева О.А., Воробьёва О.А. Сравнительный анализ морфологии сперматозоидов человека: на-тивный эякулят - прогрессивно подвижная фракция // Пробл. репрод. - 1999. - № 3. - С. 29-36.
4. Плосконос М.В. Физиологическое значение полиаминов в репродуктивной функции мужчин в норме и при её нарушениях // Дис. ... канд. биол. наук. -Астрахань, 2004.
5. Плосконос М.В. Методы определения апоптоза сперматозоидов (Обзор литературы) // Клин. лаб. диаг. - 2013. - № 4. - С. 3-8.
6. Плосконос М.В. «Абортивный» апоптоз сперматозоидов фертильных мужчин // Международный журнал экспериментального образования. - 2014.
- № 3 (часть 2). - С. 147.
7. Плосконос М.В. Применение эозина и йодистого пропидия для оценки жизнеспособности сперматозоидов человека // Клин. лаб. диаг. - 2014. - Т. 59, № 11. - С. 22-25.
8. Плосконос М.В. Экстернализация фосфатидилсе-рина на поверхность мембран сперматозоидов под действием оксидативного стресса // Российский иммунологический журнал. - 2015. - Т. 9(18), №1(1). - С. 156 - 157.
9. Плосконос М.В., Николаев А.А., Николаев А.А. Определение полиаминов в различных биологических объектах. Астраханская гос. мед. акад.. Астрахань, 2007.
10. Плосконос М.В., Николаев А.А. «Абортивный» апоптоз сперматозоидов: какова его доля в эякуляте фертильного мужчины // Пробл. репрод. -2014. - Т. 20, № 6. - С. 70-75.
11. Плосконос М.В., Николаев А.А. Апоптоз и мужская фертильность // Врач. -2014. - № 3. - С. 23-25.
12. Плосконос М.В., Николаев А.А. Влияние липополи-сахаридов Chlamydia trachomatis на апоптоз сперматозоидов и развитие мужского бесплодия (Обзор литературы) // Урология. - 2014. - №1. - С. 8487.
13. Chen S.U., Ho H.N., Chen H.F. et al. Comparison between a two-layer discontinuous Percoll gradient and swim-up for sperm preparation on normal and abnormal semen samples // Assist. Reprod. Genet. -1995. - Vol. 12. - № 10. - P. 698-703.
14. Florence L.H.Ng, De Yi Liu, Gordon Baker H.W. Comparison of Percoll and swim-up methods for sperm preparation from abnormal semen samples // Hum. Reprod. - 1992. - № 2. - P. 261-266.
15. Gandini L., Lombardo F., Paoli D. et al. Full-term pregnancies achieved with ICSI despite high levels of sperm chromatin damage // Hum. Reprod. - 2004. -№ 6. - Р. 1409-1417.
16. Singer R., Fish B., Levinsky H. et al. Separation of human semen on Percoll gradients: effect on percentage of motile and morphologically normal sperm and proportion of acrosome reacted sperm // Int. J. Fertil Menopausal Stud. - 1995. - Vol. 37. - № 3.
- P. 161-166.
17. Tomlinson M.J., Moffatt O., Manicardi G.C. et al. Interrelationships between seminal parameters and sperm nuclear DNA damage before and after density gradient centrifugation: implications for assisted conception // Hum. Reprod. - 2001. - Vol. 16. - № 10.
- P. 2160-2165.
