Методы выделения патогенной микофлоры из семян подсолнечника Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

УДК 631.466.1

Методы выделения патогенной микофлоры из семян подсолнечника

В.Т. ПИВЕНЬ,

заведующий отделом защиты растений Всероссийского НИИ масличных культур Н.В. МУРАДАСИЛОВА, старший научный сотрудник И.И. ШУЛЯК,

ведущий научный сотрудник Т.П. АЛИФИРОВА, старший научный сотрудник e-mail: piven39@mail.ru

Зараженность семян микроорганизмами является одной из важнейших причин ухудшения их посевных качеств и возникновения болезней у вегетирующих растений.

Семена подсолнечника служат благоприятным субстратом для развития многообразной микрофлоры, главным образом, грибной. Поверхностная инфекция включает в себя пропагулы грибов, локализующиеся на поверхности перикарпа, а внутренняя - инфекцию, находящуюся в плодовой, семенной оболочках и в семени.

Зараженность семян подсолнечника выявляют по методу Н.А. Наумовой (1960) (ГОСТ 12044-81), проращивая их во влажной камере при постоянной температуре (2425 °С) в течение 5 суток. Поверхность семянки перед закладкой во влажную камеру предварительно дезинфицируют. Для более полного определения видового состава патогенного комплекса и локализации возбудителей болезней в тканях плода необходимо модифицировать эти методики. Это позволит подбирать фунгицидные составы, эффективно защищающие всходы от всего комплекса болезней и, прежде всего, наиболее вредоносных - ложной мучнистой росы (ЛМР), белой, серой, пепельной и

сухой гнилей, фузариоза, альтерна-риоза, фомопсиса.

В отличие от общепринятого метода, для более точного разделения поверхностной и внутренней инфекций в своих исследованиях мы отдельно изучали микофлору плодовой оболочки и семени. Семянки стерилизовали фламированием в пламени спиртовки (с предварительным смачиванием в спирте). Из средней пробы оценивали по 100 штук семянок в 3 повторностях. Ядра и лузгу отдельно помещали на картофельно-глюкозный агар (КГА) в чашки Петри по 10 штук в каждую и инкубировали их в условиях бокса при колебании температуры от 20 до 25 °С в течение 15 суток. Первый учет проводили через 7 суток, второй - через 15. После образования колоний грибы идентифицировали по характерным видовым признакам, используя определители [4, 6]. В каждой чашке Петри подсчитывали число плодовых оболочек и ядер, инфицированных тем или иным возбудителем, а затем вычисляли процент их зараженности отдельно каждым видом возбудителя.

Предложенные нами условия проведения фитоэкспертизы расширяют спектр выделяемых с се-

мянок возбудителей болезней и дают возможность определить, проникло ли инфекционное начало в ядро. Этот метод наиболее приемлем для выделения возбудителей фомопсиса и белой гнили из семян с растений подсолнечника, у которых поражен стебель, но отсутствуют симптомы болезни на корзинках (табл. 1).

Так, по методу Наумовой инфекционное начало фомопсиса выделили из 4,5 % целых семянок. При раскладывании на агаре отдельно ядер и плодовых оболочек получили совершенно другое, в 3,3 раза превышающее предыдущее, значение. Это доказывает, что все инфекционное начало фомопсиса сосредоточено в ядре, пораженность которого 15 %. При обычной фитоэк-спертизе через 5 суток учитывают, в основном, колонии быстрорастущих грибов (Alternaria spp., Fusarium spp.), которые не дают к этому времени развиться всему инфекционному началу фомопсиса, содержащемуся в семенах. Мицелий этого патогена компактный, полупогруженный в субстрат, растет медленно, пикниды появляются через 6-10 дней. Учет и видовая идентификация фомопсиса проводятся через 10 дней.

Для выделения гриба Sclerotinia sclerotiorum из семян подсолнечника с растений, пораженных прикорневой и стеблевой формами белой гнили, использовали такие же подходы, но приоритетным фактором являлось колебание температуры от 18 до 25 °С. Только при таких ус-

Таблица 1

Результаты фитоэкспертизы семян подсолнечника из растений с пораженным фомопсисом и белой гнилью стеблем и отсутствием симптомов на корзинках (Краснодар, ВНИИМК, 2007-2008 гг.)

Пораженность семян (%)

Метод H.A. Наумовой Модифицированный метод

Вариант (целые семянки) ядро плодовая оболочка

Phomopsis spp. Sclerotinia sclerotiorum Phomopsis spp. Sclerotinia sclerotiorum Phomopsis spp. Sclerotinia sclerotiorum

Стебель поражен фомопсисом 4,5 - 15 - 3,4 -

Стебель поражен белой гнилью — 0 - 6,8 - 0

ловиях ведения фитоэкспертизы на 14-15-е сутки мицелий возбудителя склеротиниоза с формирующимися на нем склероциями начинает пробиваться поверх ранее выросших колоний грибов. В нашем случае гриб выделился из 6,8 % семянок.

Для определения скрытой инфекции возбудителей болезней подсолнечника использовали метод Е.М. Долговой [2], суть которого в следующем: внешне здоровые проростки подсолнечника помещают в дистиллированную воду. Лишившись элементов минерального питания, патогены, развивающиеся в скрытой форме, вынуждены добывать их, подключая свою ферментативную систему. Побурение тканей или появление перетяжек на гипо-котилях проростков свидетельствуют о наличии в них возбудителей болезней и о начале патологического процесса. Исследования показали, что у некоторых партий семян, имеющих лабораторную всхожесть 98-100 %, зараженность внешне здоровых проростков скрытой формой развития патогенов составляла 60-90 %. Дальнейшее их развитие зависело от метеоусловий. С помощью этого метода Е.М. Долгова обнаружила, что внешне здоровые проростки подсолнечника могут нести инфекционное начало белой и серой гнилей, альтернариоза, фузариоза, сухой гнили. Позднее ученые многих стран мира принимали участие в разработке методов выявления скрытого заражения семян различных культур (табак, огурцы, сахарный тростник, кукуруза), в основном,вирусами,что говорит о важности этой проблемы [6, 7, 8, 9]. В наших опытах метод Долговой оказался наиболее приемлемым как более доступный и дешевый в исполнении, но он также нуждался в усовершенствовании.

Мы анализировали семена подсолнечника, всхожесть которых приближалась к 100 %. Семянки раскладывали на увлажненную фильтровальную бумагу зароды-

шем вниз в два ряда в шахматном порядке. Сверху накрывали этой же бумагой, заворачивали в рулоны, которые устанавливали в сосуды, заполненные дистиллированной водой на 2-3 см. Полученные внешне здоровые 7-дневные проростки с развитыми главным корнем и боковыми корешками извлекали при разворачивании рулонов, затем промывали в охлажденной кипяченой воде и помещали в стаканы с дистиллированной водой, культивируя при медленном понижении температуры в ночное время до 20 °С и повышении в дневное до 2526 °С. Через каждые 2 суток отбирали проростки с появляющимися на гипокотилях некрозами или перетяжками. У оставшихся проростков промывали корневую систему перед тем как поменять в стаканах дистиллированную воду. Окончательное извлечение больных проростков из дистиллированной воды проводили через 9-10 суток. Пораженные участки гипокотилей с граничащей с ними здоровой тканью помещали в стерильные чашки Петри на увлажненную фильтровальную бумагу и инкубировали при переменных температурах (18-25 °С) до появления спороношения или формирования плодовых структур. Видовую принадлежность патогенов устанавливали микроскопиро-ванием. Количество семян со скрытым инфицированием определяли по отношению к общему количеству заложенных в рулоны.

Нами подтвержден вывод Е.М. Долговой [2], что скрытая форма существования патогенов обна-руживаетсебя при появлении на гипокотилях проростков побурения тканей или перетяжек. В режиме переменных температур в опыте удалось выявить более широкий спектр болезней, инфекционное начало возбудителей которых обнаружено во внешне здоровых проростках. Впервые выявлено скрытое инфицирование семян подсолнечника возбудителями фомопсиса по образующимся на некрозах гипокоти-

1. Созревшие микмиды возбудителя фомоп-сиса Phomopsis helianthi на гимокотиле проростка подсолнечника со скрытым патогенезом (ориг.)

лей пикнидам (рис. 1), при созревании которых формировались или только р споры (Phomopsis helianthi), или в и а споры (Ph. arctii).

Нами впервые обнаружено скрытое инфицирование семян подсолнечника новым для него возбудителем альтернариоза (Alternaría con-sortiale), идентифицированным по микросклероциям и конидиям; возбудителем вертициллеза (Verticil-lium dahliae) - по мицелию и споро-ношению; возбудителем ЛМР - по хлоротичным пятнам на лицевой стороне семядолей.

Анализ семян на скрытое инфицирование подтвердил, что внешне здоровые проростки подсолнечника могут являться носителями инфекционного начала патогенов, которое при наличии комплекса благоприятных условий [2] становится причиной развития болезней на вегетирующих растениях (табл. 2).

Наибольшее развитие на гипокотилях проростков подсолнечника получили представители рода Alternaría. Скрытая форма альтер-нариоза в среднем за три года выявлена у 89,8 % проростков. Впервые выделенный нами с растений подсолнечника гриб Alternaria consortiale в общей структуре рода Alternaria составил 25,7 %. Признаки скрытого инфицирования фо-мопсисом выявлены у 0,5 % семян.

При этом наибольшее количество пораженных гипокотилей с образовавшимися на них пикнидами получено с внешне здоровых проростков семян урожая 2008 г. - 1 %. Грибы рода Fusarium в среднем за три года получили развитие на 8,8 % внешне здоровых проростков семян. В незначительном количестве (0,3 %) выявлена скрытая форма возбудителей серой и белой гнилей на семенах урожая 2008 г. В среднем за три года исследований инфекционное начало грибов Ver-ticillium dahliae и Rhizopus spp. было обнаружено на некрозах проростков соответственно в 0,6 и 1,3 % случаев.

При изучении ЛМР на подсолнечнике рядом ученых отмечено отсутствие симптомов болезни на растениях, полученных из больных семян. Впервые ответ на этот вопрос был дан Н.С. Новотельновой, открывшей существование скрытого течения ЛМР [3]. Ею был предложен метод обнаружения скрытой инфекции - выращивание подсолнечника в полевых условиях из семян пораженных растений. При этом необходимо было исключить возможность его инфицирования через почву и аэрогенным путем. Корни внешне здоровых растений подсолнечника, достигших 7 пар настоящих листьев, закладывали во влажную камеру. О наличии болезни судили по образующемуся на них спороноше-нию гриба. Позднее О.И. Тихоновым был предложен метод выявле-

ния скрытого течения ЛМР, основанный на просмотре продольных срезов стеблей внешне здоровых растений подсолнечника [5]. При наличии возбудителя болезни область корневой шейки имеет желтовато-коричневую окраску. Эти методы не нашли широкого применения из-за сложности в исполнении.

Методику определения инфици-рованности семян подсолнечника возбудителем ЛМР - грибом Plas-mopara helianthi отрабатывали на семенах с растений, пораженных разновидностью второй формы и с симптомами пятой формы. 300 семянок в смачиваемых рулонах (по 50 штук) проращивали в условиях влажной камеры при медленном понижении температуры в ночное время до 16 °С и повышении в дневное до 22 °С. На 7-е сутки учитывали число проростков с визуальными симптомами поражения ЛМР. У проростков семян с растений со второй формой болезни появлялись бурые некрозы на границе корня с гипокотилем, а с пятой формой -бурые до коричнево-кирпичного цвета штрихи вдоль гипокотиля и обеих сторон семядолей. Корни были лишены боковых корешков и имели такой же коричнево-кирпичный цвет (рис. 2).

Для определения скрытого инфицирования семян ЛМР также использовали метод «истощения» Е.М. Долговой [2] для обнаружения скрытой формы патогенеза сапрот-рофных грибов. Внешне здоровые

в

2. Признаки поражения ЛМР проростка подсолнечника из семян растений с симптомами пятой формы болезни (ориг.): а — не развившийся корешок; б — некрозы на гипокотиле; в — некрозы на семядолях

3. Симптомы скрытого течения ЛМР на семядолях подсолнечника (ориг.): а — здоровый проросток; б — деформированные семядоли больного проростка с хлоротич-ными пятнами

проростки помещали в дистиллированную воду и вели за ними ежедневное наблюдение. Соблюдая тот же диапазон температур (16-22 °С), начиная с 5-х суток экспозиции, учитывали проростки с хлоротичны-ми пятнами на лицевой стороне семядолей (рис. 3).

Микроскопирование срезов тканей в области некрозов и хлорозов подтверждало наличие гифов гриба Plasmopara helianthi в межклеточном пространстве. Окончательный учет скрытого инфицирования проводили через 7-8 суток после помещения проростков в воду. В каждом варианте подсчитывали общее количество пораженных ЛМР

Таблица 2

Поражение семян подсолнечника сорта Мастер скрытой формой патогенов (Краснодар, ВНИИМК, 2006-2008 гг.)

Патоген Поражено внешне здоровых проростков (%)

2006 2007 2008 Среднее

Alternaria spp., 94,7±1,3 82±2,2 92,7±1,5 89,8±1,7

в том числе Alternaria consortiale 24±2,5 26±2,5 27±2,6 25,7±2,5

Fusarium spp. 9,7±1,7 4,7±1,2 12±1,9 8,8±1,6

Botrytis cinerea 0 0 0,3±0,3 0,1±0,1

Sclerotinia sclerotiorum 0 0 0,3±0,3 0,1±0,1

Phomopsis spp. 0,3±0,3 0,3±0,3 1±0,6 0,5±0,4

Verticillium dahliae 0,7±0,5 0,3±0,3 0,7±0,5 0,6±0,5

Rhisopus spp. 0,3±0,3 2,7±0,9 1±0,6 1,3±0,7

Таблица 3

Инфицированность семян подсолнечника сорта Мастер возбудителем ложной мучнистой росы (Краснодар, ВНИИМК, 2007-2008 гг.)

Число проростков

Число проростков с симптомами Всего

Вариант с видимыми скрытого течения пораженных

симптомами ЛМР ЛМР (в стаканах ЛМР проростков

(в рулонах) (%) с дистиллированной водой)(%) (%)

Растения с симптомами раннего 49,5 50,5 100

проявления ЛМР

(разновидность 2-й формы)

Растения с симптомами 31,5 14,8 46,3

позднего проявления ЛМР

(5-я форма)

Контроль (здоровые растения) 0 0 0

семянок, суммируя проростки с визуальными симптомами болезни и проростки с симптомами скрытого течения болезни.

Разработанный нами лабораторный метод обнаружения инфекционного начала ЛМР в семенах подсолнечника, по сравнению с ранее предложенными [3, 5], имеет ряд преимуществ: полностью исключается возможность заражения проростков почвенной и вторичной инфекциями, а учитывается лишь та, которая присутствует в семенах; появляется возможность контролировать режимы влажности и температуры, оптимальные для развития патогена, которые в полевых условиях в период вегетации подсолнечника могут отсутствовать. При оптимальном для развития патогена температурном режиме выявляется наибольшее число пораженных проростков, в том числе и среди внешне здоровых (табл. 3).

Внешне здоровые проростки подсолнечника, выросшие из семян растений, пораженных второй фор-

мой болезни, были заражены в

50.5 % случаев; из семян растений с поздней формой проявления болезни - в 14,8 % случаев.

О методической правильности определения зараженности семян подсолнечника ЛМР в лабораторных условиях говорят результаты ранее проводившихся полевых исследований: у О.И. Тихонова [5] эти цифры составили соответственно

50.6 и 16,3 %. Проводимая нами лабораторная диагностика позволила выявить не только проростки с симптомами скрытого течения ЛМР, но и с видимым поражением, которое в полевыхусловиях на взрослых растениях не проявляется. В наших исследованиях проростки, полученные из семян растений с симптомами разновидности 2-й формы, несли такие признаки ЛМР в 49,5 % случаев, а с симптомами 5-й формы - в 31,5 % случаев.

Для проверки модифицированных нами методов была проанализирована партия семян сорта Мастер 1-й репродукции. В табл. 4

представлены результаты, полученные разными методами.

По общепринятой методике Н.А. Наумовой с поверхности плодовой оболочки выделены возбудители альтернариоза (98 %), фузари-оза (2 %), сухой гнили (1 %), пепельной гнили (2 %) и в незначительном количестве возбудители фомопси-са, белой, серой гнилей - соответственно 0,5; 0,5; 0,3 %.

По модифицированной методике с ядер выявлена зараженность фо-мопсисом уже в 3 % случаев, что превышает предыдущий результат в шесть раз. Семян, инфицированных возбудителем белой гнили, больше в четыре раза (2 %). Кроме того, при анализе ядер выделены грибы Alternaria consortiale - 10,7 %, Sclerotium bataticola - 2 % и Verticillium dahliae - 0,3 %.

Показатели внутреннего инфицирования семян увеличивались за счет результатов их анализа на скрытое инфицирование: Alternaria consortiale - 37,7 %; Fusarium spp -17 %; Rhizopus spp. - 2 %; Phomopsis spp, - 4 %; Plasmopara helianthi - 9 %; Verticillium dahliae -1 %; Sclerotinia sclerotiorum - 2,3 % и Botrytis cinerea - 0,6 %.

Таким образом, опираясь на более достоверные результаты фито-экспертизы,установили,что в проанализированном семенном материале наибольшую встречаемость имеют возбудители комплекса болезней: фомопсиса, фузариоза, пепельной гнили, сухой гнили, альтернариоза и ЛМР.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант № 08-04-99106.

Таблица 4

Определение зараженности семян подсолнечника сорта Мастер возбудителями болезней (Краснодар, ВНИИМК, 2008 г.)

Метод фитоэкспертизы Пораженность семян грибами (%)

Alternaria spp. Alternaria consortiale Fusarium spp. Rhizopus spp. Phomopsis spp. Plasmopara helianthi Verticillium dahliae Sclerotinia sclerotiorum Botrytis cinerea Sclerotium bataticola

H.A. Наумовой (целые семянки) 98 0 2 1 0,5 0 0 0,5 0,3 2

Модифицированный H.A. Наумовой 85 10,7 5 1 3 0 0,3 2 0,3 2

Модифицированный Е.М. Долговой 92,7 27 12 1 1 9 0,7 0,3 0,3 0

УДК 632.93:633.491

Подготовка семенного материала и посадка картофеля

ЛИТЕРАТУРА

1. Билай В.И. Фузарии. - Киев: Наук. думка, 1977, 441 с.

2. Долгова Е.М. Способ оценки семян подсолнечника на зараженность возбудителями болезней / Болезни подсолнечника. - Краснодар, 1988, с. 42-46.

3. Новотельнова Н.С. Ложная мучнистая роса подсолнечника (таксономия и биология возбудителя, патогенез заболевания). - М.-Л.: Наука, 1966, 150 с.

4. Пидопличко Н.М. Грибы - паразиты культурных растений. - Киев: Наук. думка, 1977, т. 1, 295 с.

5. Тихонов О.И. Биологические особенности и пути снижения вредоносности возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника в Краснодарском крае. Автореф. дисс. - Краснодар, 1969, 24 с.

6. Bacon C.W. Symptomless endophytic colonization of maize by Fusarium moniliforme. // Can. J. Bot., 1996, v. 74, № 8, p. 1195-1202.

7. Izaguirre-Mayoral M.L. Physiological performance of asymptomatic and yellow leaf syndrome - affected sugarcanes in Venezuela. // J. Phytopathol., 2002, v. 150, № 1, p. 13-19.

8. Kintzios S. The application of the bioelectric recognition assay for the detection of human and plant viruses: Definition of operational parameters. // Biosens. and Bioelectron., 2001, v. 16, № 7-8, p. 467-480.

9. Lee H.K. Symptomless infection of barley seed by Rhynchosporium secalis. // J. Cen. Plant Pathol, 2001, v. 23, № 2, p. 185.

Аннотация. Представлены исследования по выявлению более полного патогенного комплекса семян подсолнечника, по локализации возбудителей болезней в тканях плода и в тканях внешне здоровых проростков.

Предложен лабораторный метод определения инфицированности семян обли-гатным паразитом Plasmopara helianthi -возбудителем ЛМР подсолнечника.

Ключевые слова. Фитоэкспертиза, возбудитель болезни, инфицирован-ность семян, идентификация, плодовая оболочка, ядро, скрытая инфекция.

Abstract. The researches on detection of more full pathogenic complex seed of sunflower, on localization of exciters of illnesses in tissues of a fetus and in tissues outwardly able-bodied tillers are submitted.

The laboratory method of definition infected seeds by an obligate parasite Plasmopara helianthi - exciter downing mildew of sunflower is submitted.

Keywords. Phytoexpertise, causative agent, infected seeds, identification, fruit shell, core, masked infection.

В.Н. ЗЕЙРУК, заведующий отделом Всероссийского НИИ картофельного хозяйства В.М. ГЛЁЗ,

старший научный сотрудник e-mail: 02012626@mail.ru

Целый ряд требований предъявляется к качеству посадочного материала картофеля: он должен состоять из клубней одного сорта, здоровых, чистых, сухих, соответствующих данному сорту по форме и окраске; не содержать клубней, пораженных мокрой или сухой гнилями, подмороженных, с механическими повреждениями более 4 % от общей массы для семеноводческих и 5 % для продовольственных посадок; не включать примесей почвы свыше 1 % от общей массы. Клубни следует разделять на фракции по максималь-

ному поперечному диаметру (табл. 1).

Подготовку семенного материала к посадке следует начинать с проведения клубневых анализов хранящихся партий картофеля. Это позволит отбраковать больные клубни и подобрать соответствующий препарат для обработки каждой партии.

Для более полного выявления скрытых форм заражения возбудителями грибных, бактериальных и нематодных заболеваний и исключения перезаражения ими партии картофеля перебирают или сортируют, отбирая клубни с явными признаками болезней, затем прогревают их при температуре 14-18 °С в течение 3 недель, и перед посадкой удаляют те, у которых проявились симптомы болезней. Сортировку и калибровку

Таблица 1

Максимальный поперечный диаметр клубней разных фракций (мм)

Мелкая Средняя Крупная

Для сортов с удлиненной формой клубней 28-36 37-45 46-55

Для сортов с округло-овальной формой клубней 30-40 41-50 51-60

Таблица 2

Препараты для предпосадочной обработки семенных клубней

Норма расхода на 1 т

Препарат препарата рабочей Заболевание

(л/кг) жидкости (л)

Фитоспорин-М, ж 0,8-1 30 Ризоктониоз, фитофтороз

Баксис, сп 0,01 2 Ризоктониоз, фитофтороз

Алирин-Б, сп 0,002-0,003 2 Ризоктониоз, фитофтороз, альтернариоз

Колфуго супер, ск 0,2-0,3 3-5 Ризоктониоз, сухая гниль

Альбит, тпс* 0,1 10 Ризоктониоз, фитофтороз, альтернариоз

ВИСТ, шашки 0,01-0,05 фумигация Ризоктониоз, сухая гниль,

насыпные ооспороз, фомоз

Максим, кс 0,4 2 Ризоктониоз, фитофтороз

* Препарат обладает ростстимулирующей активностью