CC BY
67
94
РЕЦЕНЗИИ
МЕТОДЫ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА: ОТ ДРОЖЖЕЙ ДО КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
(рецензия на монографию С.М. Закияна и соавт. «Методы редактирования генов и геномов», Новосибирск, 2020) Б.Д. Животовский
Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Факультет фундаментальной медицины, Москва, Россия
Институт медицины окружающей среды, Каролинский Институт, Стокгольм, Швеция
GENOME EDITING TECHNIQUES: FROM YEAST TO HUMAN CELLS
B.D. Zhivotovsky
Faculty of Medicine, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia Institute of Environmental Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden
e-mail: boris.zhivotovskY@ki.se
Организм человека содержит около 100 триллионов клеток, из которых не более 40% принадлежат нам, а остальные 60% — это клетки микроорганизмов, которые живут как внутри нас, так и на нашей поверхности. Самые короткоживущие (1-2 дня) клетки человека это клетки эпителия кишечника; ежедневно погибает около 70 миллиардов этих клеток. Время жизни эритроцитов не превышает двух недель, и около 2 миллиардов этих клеток погибает каждый день. Некоторые же клетки в организме живут достаточно долго. Так, продолжительность жизни клеток нейронов, волокон скелетных мышц и некоторых других, соответствует жизни организма. Количество клеток мозга при рождении человека (около 14 миллиардов) практически не увеличивается до самой смерти. Наоборот, их число после 25 лет жизни незначительно, но сокращается.
Ядро клеток содержит свернутую в клубок двойную спираль ДНК, которая представляет собой цепочку информации длиной в шесть миллиардов звеньев, скопленной нашими предками за миллиарды лет эволюции. Геном человека состоит из примерно 25 тысячи генов. В процессе деления, а также в течении жизни в каждом из генов могут появляться ошибки, которые должны узнаваться «контролирующей» системой и удаляться ферментами репарации. Однако, накопление нере-парированных повреждений, в том числе и в клетках с поврежденным механизмом гибели, способно привести к развитию большого ряда заболеваний. В последние 70 лет по крайней мере три важных события помогли разобраться в возможности влияния на регуляцию корректного функционирования генов. Прежде всего это открытие Фрэнсисом Криком, Джеймсом Уотсоном, Морисом Уилкинсом и Розалинд Франклин молекулярной структуры нуклеиновых кислот и ее значения для передачи информации в живом материале [1]. Трое первых были удостоены за это открытие в 1962 году Нобелевской премии по физиологии или медицине. Второе крупное достижение — это начавшийся под руководством Джеймса Уотсона в 1 990 году и завершившийся в 2003 году проект, позволивший расшифровать 20-25 тыс. генов в геноме человека. Третье достижение — это совсем недавнее открытие Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна одного из самых острых инструментов генной технологии — «генетических ножниц» CRISPR/Cas9. За разработку метода редактирования генома оба выдающихся ученых разделили в 2020 году Нобелевскую премию по химии.
Как это часто бывает в науке, открытие «генетических ножниц» было неожиданным. Во время исследований Streptococcus pyogenes, одной из бактерий, наносящих
большой вред человечеству, Эммануэль Шарпантье обнаружила ранее неизвестную молекулу, ^асЖ1\А и показала, что ^асЖ1\А является частью древней иммунной системы бактерий, CRISPR/Cas, которая обезоруживает вирусы, расщепляя их ДНК. Шарпантье опубликовала свое открытие в 2011 году [2]. Вскоре ей, вместе с Дженнифер Дудна, удалось воссоздать «генетические ножницы» бактерий в пробирке и упростить их молекулярные компоненты, чтобы было проще их использовать [3]. Затем, в принципиально важном эксперименте, «генетические ножницы» были перепрограммированы [4] и авторы доказали, что ими можно управлять так, что они могут разрезать любую молекулу ДНК в заранее определенном месте. Там, где ДНК разрезана, стало возможным переписать код жизни. В некотором смысле «генетические ножницы» позволяют ученым как бы перенестись в прошлое и исправить генетический код, закрепившийся в результате естественного отбора, если спустя тысячи или даже миллионы лет он стал представлять собой проблему для организма.
Несмотря на большие успехи в данной области, в литературе появляются все новые и новые методы описывающие различные подходы и модификации редактирования генома. Так, например, недавно под редакцией профессора С.М. Закияна вышла монография, включающая 26 глав, в которых собраны методики применения системы CRISPR/Cas на различных модельных организмах, включая дрожжи, растения, насекомых, лабораторных млекопитающих и культивируемые клетки человека [5]. Необходимо отметить, что все включенные в монографию методики разработаны авторами и содержат детальное описание не только пошагового их использования, но также появления возможных проблем в процессе практического применения и способов их преодоления. Характерной особенностью глав является также наличие в них информации о необходимых реактивах, расходных материалов и оборудования. Все это существенно облегчает использование описанных методических процедур. Редакторам монографии удалось собрать воедино хороший творческий коллектив. В настоящей рецензии невозможно описать все методы, включенные в монографию, поэтому, не обижая многих авторов, хотелось бы отметить некоторые из них. Так, мне представляется интересным метод, позволяющий успешно доставлять компоненты системы CRISPR/Cas9 в геном суспензионных культур растительных клеток. Авторы предложили использовать протокол, включающий этап создания генно-инженерных конструкций для редактирования генов-мишеней, доставки полученных конструкций в клетки суспензионной культуры, используя агробактериальную или биобаллистическую трансформацию, а также способы
РЕЦЕНЗИИ
95
селективного отбора «отредактированых» клеток с целью создания на их основе клеточных моноклональных линий. Важной является серия статей посвященной описанию различных подходов к редактированию генома Drosophila melanogaster. Б.В. Скрябин и Т.С. Рождественский детально разобрали вопрос о том, каким образом можно использовать CRISPR/Cas9 нуклеазы для производства трансгенных мышей. Особый интерес представляет описание авторами критически важного выбора стратегии направленной геномной модификации, конструирования специфичных нуклеаз CRISPR/Cas9 и детальных протоколов, используемых авторами, являющимися одними из лидеров в данной области.
Интересным является метод выключения генов в клеточных линиях с анеуплоидным кариотипом, предложенный коллективом автором под руководством П.И. Макаревича. Несмотря на то, что полученная популяция клеток оказалась идентичной по гетерогенности клеткам исходной популяции, клональный эффект в них нивелировался, что позволило авторам использовать данный подход при исследовании функций различных белков, включающих транскрипционные факторы, рецепторы и ферменты. Очень полезными представляются различные методы редактирования плюрипотентных стволовых клеток, включенные в монографию, и их скринига.
Совершенно очевидно, что «генетические ножницы» представляют собой инструмент, обладающий огромной силой, влияющей на всех нас. В последние годы использование этого инструмента резко возросло и способствовало многим важным открытиям в области фундаментальных наук. Так, исследователи растений смогли вывести культуры, устойчивые к плесени, вредителям и засухе. В медицине проходят клинические испытания новых методов лечения рака, и вполне возможно, что мечта о том, чтобы вылечить наследственные заболевания станет реальностью. В международной базе данных (clinicaltrials.gov) имеется более 40 исследований с использованием агентов редактирования генома, включая CRISPR/Cas9 с целью терапевтических вмешательств. Так, с помощью CRISPR/Cas9 был сделан и экспериментально подтвержден функциональный нокаут белка CCR5, экспрессируемого на поверхности белых кровяных телец и участвующего в регуляции иммунной системы, придавая устойчивость к ВИЧ-инфекции. Первое клиническое испытание этого нокаута на людях было зарегистрировано в 2017 году (NCT03164135).
Другое клиническое испытание с использованием CRISPR (NCT02793856) было сфокусировано на выключении гена белка 1 программируемой гибели клеток (PD-1 ) в Т-клетках из периферической крови. Основная проблема безопасности данного исследования заключалась в том, что использование общих неспецифических Т-клеток, а не опухолевых инфильтрированных лимфоцитов (TIL), собранных непосредственно из опухолей пациента, могло привести к общей гиперактивации иммунной системы пациента. Данные этого исследования CRISPR на людях не указывают на появление серьезных нежелательных явлений. Тем не менее, эффективность этой терапии в настоящее время неизвестна.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Watson J.D., Crick F.H. Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 1953; 171(4356): 737-8.
2. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 2011; 471(7340): 602-760.
3. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012; 337(6096): 816-21.
Имеются определенные достижения в лечении легкодоступных органов, таких как глаз или ухо. Было зарегистрировано (NCT03872479) первое клиническое испытание Cas9 для лечения слепоты, в стадии разработки находится терапия Cas9, включающая нокаут эндогенных копий гена и замену их функциональной копией при аутосомно-доминантной колбочко-палочковой дистрофии (СОПйб)-опосредованной слепоты. Коррекция с помощью Cas9 гена USH2A, ответственного за ухудшение зрения и слуха при синдроме Ашера, была показана в клетках пациентов. Кроме того, Cas9 был использован для избирательного разрушения мутантного аллеля Tmc1 (семейство 1 трансмембранного канала-подобных генов), связанного с аутосомно-доминантной потерей слуха, при сохранении аллеля дикого типа и предотвращения прогрессирующей потери слуха.
В настоящее время проходят клинические испытания лечения тяжелых гемоглобинопатий, таких как трансфу-зионно-зависимая бета-талассемия (TDT) и серповидно-клеточная анемия с помощью редактирования генов CRISPR/Cas9 препаратом CTXOOl. Первые результаты безопасности и эффективности препаратa весьма обнадеживающие.
Несмотря на то, что клинические испытания на людях как ex vivo, так и in vivo уже начались, имеется достаточно много проблем, ограничивающих клиническое использование CRISPR in vivo. Один из главных вопросов, которому уделяется наибольшее внимание — это проблема доставки. А именно, как точно доставить CRISPR, контролировать его активность и ограничить нецелевые события? Другое ограничение связано с тем, что доставка как CRISPR/Cas9 in vivo, так и других систем CRISPR, может вызвать иммуногенный ответ, а возраст пациентов может быть важным его медиатором.
Идеальный «редактор генов» должен обладать идеальной специфичностью и не вызывать мутаций ни в какой другой области генома. К сожалению, все известные системы на основе CRISPR/Cas пока не достигают таких высоких стандартов. В настоящее время ведутся интенсивные исследования и разрабатываются методы предотвращения нецелевых эффектов (off-target effect) для обеспечения улучшения терапевтических стратегий. К ним прежде всего относится разработка сверхточных систем CRISPR.
Технологии редактирования генов чрезвычайно мощны и обладают огромным потенциалом, открывая новые возможности для лечения множества болезней человека. Поскольку объем ресурсов, направленных на лучшее понимание и описание этих технологий, продолжает резко увеличиваться с каждым годом, их, как сказано выше, их полноценное клиническое внедрение становится очень близким. Поэтому рецензуруемая монография очень своевременна и вносит вклад в развитие данного направления науки.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ (19-15-00125). Работа лабораторий также поддерживается грантами РФФИ (18-29-09005), Шведского (190345) и Стокгольмского (181301) противораковых фондов.
4. Doudna J.A., Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 2014; 346(6213): 1258096.
5. Методы редактирования генов и геномов. Методы редактирования генов и геномов. Отв. ред. С.М. Закиян, С.П. Медведев, Е.В. Дементьева, В.В. Власов. РАН, Сиб. отд-ние, ФИЦ Ин-т цитологии и генетики и др. Новосибирск: Издательство СО РАН, 2020; 550.
