CC BY
270
В настоящее время в качестве базового метода диагностики патологических изменений принята гистологическая оценка образцов тканей, взятых посредством биопсии. Его преимуществом является возможность исследования структурных изменений кожи на субклеточном уровне, а главными недостатками - инвазивность, остающийся рубец, возможные осложнения: инфицированная рана, развитие флегмоны. Затруднение биопсии возникает при локализации высыпаний на лице, подошвах, ладонях, гениталиях и в складках [1]. Изучение фиксированных препаратов дает возможность исследовать только мертвые клетки и ткани, строение которых в той или иной степени отличается от прижизненного. Потребность изучать динамику протекающих в живых тканях физиологических и патологических процессов, а также стремление к познанию микроструктуры живых объектов стимулировали поиски методов прижизненной микроскопии [2].
Результаты исследований культуры тканей in vivo [3] послужили основой для разработки метода прижизненной микроскопии в проходящем свете с помощью специальных камер, введенных в организм подопытного животного. Имеется подробный обзор работ, опубликованных в этой области [4].
Актуальным является совершенствование методов «инструментального» исследования кожи (Bioengineering).
В 1933 г. Н. Hinselmann [5], предложивший кольпоскопию в гинекологии, использовал впервые стереомикроскоп для исследования кожных элементов; впоследствии разные варианты метода, получившего названия «поверхностная микроскопия», «микроскопия в падающем свете», «эпилюминесцентная микроскопия», «интравитальная микроскопия», стали широко использоваться в дерматологии, особенно при диагностике пигментных опухолей [6,711]. На 4-м конгрессе Европейской академии дерматологии и венерологии (Брюссель, 1995) некоторые доклады были посвящены вопросам эпилюминесцентной микроскопии [12]. На 5-м конгрессе Международного общества Skin imaging (Вена, 1997) основные программные доклады (Н. Pehamberger, A.J. Sober, S. Seidonari, P.A. Asciento, R. Schiffner и S.W. Menzies) были посвящены различным вариантам дерматоскопии (эпилюминесцентной микроскопии).
Разновидностью ПМК является контактная биомикроскопия (КБ), проводимая путем применения «контактных объективов». В первом «микроскопе-игле» поверхность объектива приводилась в контакт с фронтальной линзой объектива, освещение осуществлялось через объектив. Ранее был разработан метод интравитальной флюоресцентной микроскопии, основанный на освещении обследуемых объектов через опакиллюминатор. Позднее был созданы специальные объективы и опакиллюминаторы, что обеспечило прогресс в области КБ [13]. В настоящее время разработаны современные методы КБ, включающие флюоресцентную контактную микроскопию, контактную микроскопию в поляризованном свете; флюоресцентноабсорбционный метод КБ широко использовался для изучения прижизненной структуры ткани, особенностей клеточного инфильтрата, нарушения микроциркуляции и транспортных процессов на мембранах при патологии многих внутренних органов [14].
Интерес к ПКМ в дерматологии обусловлен стремлением к расширению возможностей в диагностике и проведении контроля за лечением при многих дерматозах. Прижизненная микроскопия кожи посредством операционного микроскопа [15] позволяет выявить детали морфологических элементов, но предельное 32-кратное увеличение ограничивает возможности данного метода.
На кафедре дерматологии Красноярской государственной медицинской академии методика КБ и микрофлюорометрии кожи была применена в середине 1980-х годов для диагностики дерматозов и изучения их патогенеза [16, 17]. Описано применение прижизненной микрофлюорометрии кожи (КБ) при ранней диагностике профессиональных дерматозов, опухолевых процессах, ранней диагностике атрофии кожи, дифференциальной диагностике поражений слизистой полости рта и красной каймы губ и других дерматозов. Особенно необходимо отметить перспективность КБ и ПМК при изучении физиологических и патологических состояний коллоидов дермы, ее волокон и транспортных процессов кожи [14,17].
Метод основан на применении контактных объективов, фронтальная линза которых соприкасается с поверхностью изучаемого в кожи объекта, а освещение осуществляется в падающем свете в нескольких спектральных режимах с помощью опакиллюминатора, специальных светоделительных пластин и фильтров. Этот способ, кроме изучения микроскопического изображения с увеличением от 50 до 600 раз, дает возможность проведения витальной микрофлюоромстрии выбранных в кожи объектов в режиме аутофлюоресценции или после использования экзогенных флюорохромов.
При КБ хорошо выявлялся феномен паракератоза, при этом на поверхности элементов обнаруживались клетки рогового слоя с тускло-зеленой цитоплазмой и
интенсивно светящимся ядром. По выраженности пара-1 кератоза (единичные корнеоциты с ядрами, ограниченные или обширные участки) можно было судить о степе-1 ни нарушения созревания клеток эпидермиса, что в какой-то мере характеризовало активность псориатическо-го процесса. Среди клеток рогового слоя встречались сегментоядерные лейкоциты с зеленым свечением ядра и красным свечением цитоплазмы, нередко образовывавшие скопления (псевдоабсцессы Мунро).
При лечении больных псориазом проведение ПКМ в динамике позволяло определить оптимальное время отмены препарата. Исчезновение ядер в корнеоцитах служило показанием для отмены цитостатиков. После 1-го курса
лечения метотрексатом ядра клеток рогового слоя приобретали дегенеративных формы (уменьшение объема, фрагментация, ядра палочковидные или в виде зернистости), что, как правило, совпадало с началом клинического регресса.
При ПКМ эрозий на месте вкравшихся пузырных элементов удавалось выяснить характер их расположения в коже (субкорнеальный, интраэпидермальный, субэпидер-мальный). В некоторых случаях при отсутствии вторичного инфицирования ПКМ позволяла выявить на поверхности эрозий акантолитические клетки или эозинофилы, лимфоциты, плазматические клетки. Акантолитические клетки имели крупное ядро и интенсивно светящуюся красную цитоплазму. При касании фронтальной линзы объектива дна эрозии отмечалась легкая дезинтеграция клеток эпидермиса.
При ПКМ кожи на участке высыпаний при чесотке хорошо определяются на поверхности рогового слоя извитые «траншееподобные» поверхностные ходы, в которых находятся клещи с хорошо различимой структурой. Основная масса клещей, расположенных в поверхностных слоях рогового слоя, определялась в виде ярко светящихся округлых образований различных размеров, зависящих от зрелости особей.
Исследование язв с помощью ПКМ в динамике давало возможность оценить выраженность репаративных процессов по активности образования грануляционной ткани и наличию краевой эпителизации и очагов эпителизации на протяжении раны.
В1997 году МЗ РФ были утверждены методические рекомендации «Контактная биомикроскопия и микрофлюориметрия в диагностике дерматозов» [18].
Выявляемые при КБ феномены зависят от гистологических изменений кожи, но вместе с тем носят своеобразный характер и требуют отдельного описания (таблица 1).
Таким образом, методы КБ и ПМК являются эффективными методами диагностики некоторых дерматозов. Данные методы позволяют объективизировать оценку эффективности лечения дерматозов. Вместе с тем визуальная картина патогистологических изменений в коже при КБ носит своеобразный характер и требует дальнейшего изучения в плане соотношения выявляемых феноменов с данными классического гистологического исследования и особенностями патогистологических изменений в коже.
В дальнейшем ПМК стала шире применяться для диагностики чесотки [17,19, 20, 21], розового лишая [22].
Люминесцентный метод ввиду его информативности, возможности проводить прижизненные исследования морфофункциональных изменений органов и систем в норме и при патологии нашел применение в хирургии и клинике внутренних органов [23].
Интерес к изучению диагностического значения люминесцентного метода в дерматологии возник со времени описания феномена аутофлюоресценции кожи. При освещении кожи ультрафиолетовым излучением длинноволнового диапазона описаны специфические изменения свечения при дерматомикозах, порфирии, эритематозе, псориазе, опухолях кожи [24, 25, 26].
В последние годы для диагностики заболеваний стали применять лазерную флюоресцентную спектрометрию [27, 28].
Исследована флюоресценция восстановленной формы никатинамидаденилдинуклеотида (НАД-Н) и окисленной формы флавопротеидов (ФП) при различных дерматозах. При этом максимум флюоресценция НАД-Н происходит при 455-460 нм (синяя область спектра), а ФП - при 530 нм (желто-зеленая область спектра). При делении клеточного дыхания наблюдалось изменение соотношения компонентов дыхательной цепи в сторону преобладания окисленных форм. Поэтому при увеличении дыхания кожи в ней нарастает желто-зеленая и затухает синяя флюоресценция [17]. С помощью люминесцентной контактной биомикроскопии, дополненной микрофлюориметрией кожи, можно оценивать состояние кожи и слизистых оболочек, функцию сальных желез [29, 30].
Идея создания микроскопа, способного на клеточном уровне показать прижизненный срез живой ткани, активно разрабатывалась еще 130 лет назад. Основной элемент был сконструирован в конце XIX в. и представлял собой вращающийся диск с мельчайшими отверстиями, расположенными по спирали. Этот диск был изобретен в 1883 г. немецким студентом Паулем Нипковым, в честь которого и получил свое название - диск Нипкова (или нипков-диск). Изобретение было основано на способности света, проходя через мельчайшие отверстия в диске и увеличительную линзу, проникать в глубину ткани и освещать фрагмент клетки на удалении от поверхности. При быстром вращении диска фрагменты складываются в общую картинку.
Для исследования кожи используют конфокальную сканирующую лазерную микроскопию (Confocal Scanning Laser Microscopy, CSLM). Метод позволяет увидеть эпидермис и сосочковый слой дермы с разрешением, приближенным к гистологическому. Все результаты обследования отображаются на мониторе и сохраняются в виде пакета файлов с изображениями (в виде микрофильма (в динамике) или микрофотографий).
Имеется две разновидности метода: отражательная микроскопия (reflectance CSLM) - основана на том, что различные внутриклеточные и межклеточные структуры имеют разный индекс преломления света, что позволяет получать контрастное изображение. В системе отражательной CSLM используют источник лазерного света длиной
волны 830 нм. Свет от линзы к коже проходит через вязкий иммерсионный раствор и проникает на глубину порядка 200 мкм (латеральное разрешение составляет около 1 микрона, аксиальное - около 3 микрон).
Флюоресцентная микроскопия (fluorescence CSLM) использует лазерный свет, проникающий в кожу и возбуждающий в ней экзо- или эндохромофоры, которые в ответ начинают излучать фотоны (то есть флюоресцировать). Система оснащена миниатюрным оптоволоконным сканером с сухим объективом, который одновременно освещает кожу лазерным светом и регистрирует флюоресценцию (поэтому этот метод также называют оптоволоконной конфокальной микроскопией). Подобный принцип, впервые предложенный M.R. Harris [31] в 1988 г., сегодня используют во многих диагностических приборах. Длина волны света, которым освещают кожу, зависит от того, что является флюорофором. Например, в случае использования в качестве эндогенных хромофоров таких красителей, как куркумин или флюоресцеин, используют лазерный свет с длиной волны 488 нм от аргоновой лампы, а регистрацию флюоресценции проводят при длине волны 505 нм.
В дерматологии конфокальную лазерную микроскопию используют для изучения проникновения соединений в кожу (путей, кинетики, распределения в коже), наблюдения за работой желез (определение активного и пассивного состояний), исследования микроциркулятор-ного русла (в том числе и в режиме реального времени), диагностики новообразований.
Не обсуждая достоинства и недостатки указанных выше разновидностей конфокальной микроскопии, отметим, что в последнее годы все большую популярность завоевывает флюоресцентная лазерная конфокальная микроскопия [32-38].
Внедрение цифровых технологий дало возможность усовершенствовать дерматоскопию за счет применения цифровой видеодерматоскопии [1]. Авторы применяли в дерматологической и косметологической практике методы видеодерматоскопии с применением аппарата «VideoScan» в компьютерной системе ASUSTEK (США), включающей программное и аппаратное обеспечение видеозахвата и обработки изображения. За указанный период обследованы 3000 пациентов с различными кожными заболеваниями. Авторы установили, что:
Видеодермоскопия повышает точность диагностики пигментных поражений кожи, что позволяет говорить о ранней диагностике меланомы;
Данный метод облегчает диагностику малых образований, высыпаний на коже в недоступных местах, при паразитарных заболеваниях (чесотка, педикулез, укусы лесных клещей и заболевания волос);
Он позволяет определить структуру и тип кожи, мельчайшие ее изменения и прежде всего процессы преждевременного старения, что очень важно в косметологической практике;
С помощью метода выявляются характерные признаки кожных заболеваний на самых ранних, доклинических стадиях, что позволяет ставить диагноз на стадии доклинических проявлений и проводить своевременное лечение.
Контролируя процесс видеодермоскопии, авторы с успехом проводили криотерапию, электрокоагуляцию, ревизию границ удаленных образований и пришли к следующим выводам:
Применение видеодермоскопии имеет юридический аспект, поскольку дает возможность фиксировать в памяти компьютера первичные изменения кожи, наблюдать в динамике воздействие лечения, обсуждать результаты с пациентом, в неясных диагностических случаях консультировать эти изображения с другими специалистами;
Психологический фактор - возможность интерактивного обсуждения заболевания совместно с пациентом, разъяснения ему необходимости лечебного воздействия при имеющихся изменениях; кроме того, наличие данного метода исследования в учреждении свидетельствует о высокой степени оснащенности последнего и использовании в работе передовых технологий.
По мнению авторов, изучение дерматоскопического изображения в дополнение к макропатологическому протоколу и гистологической картине удаленных образований облегчает и повышаег точность патоморфологического диагноза.
Наиболее важной областью в дерматологии для исследования ПКМ является диагностика пигментных образований. Диагностика и дифференциальная диагностика пигментных опухолей кожи постоянно волнует дерматовенерологов. С недавнего времени клинические критерии дают возможность окончательно поставить диагноз во многих случаях. Тем не менее значительное количество пигментных новообразований не может быть охарактеризовано даже в клинических экспериментах.
Н. Hinselmann [5] в 1933 году предложил использовать стереомикроскопию для исследования поражений кожи. V. Goldman [8] был первым, кто обследовал пигментные поражения кожи целенаправленно под микроскопом в 1951 году.
Поверхностная микроскопия показала, что необходимо предусматривать дополнительно среди характерных черт тонкие, неуловимые различия в определении пигментных поражений кожи. Этот метод может считаться полезным особенно для ранней и более точной клинической диагностики малигнизированной меланомы.
S. Menzies [39] детализировал оптические феномены ПМК при некоторых дерматозах (таблица 2).
Н.Р. Soyer с соавт. [40] представили практические иллюстрации поверхностной микроскопии в дифференци-
альной диагностике пигментных опухолей кожи, придавая особое значение клиникопатологическому соотношению.
Авторы наблюдали 150 вариантов пигментных поражений кожи, которые были исследованы методом поверхностной микроскопии и диагностированы гистологически: малигнизированная меланома (42 случая), меланома - in situ (12), диспластический невус (31), кожный невус (3), смешанный (сложный) невус (12), невус на стыке или в месте соединения тканей (16), голубой невус (3), себорейный кератоз (12), пигментная базально-клеточ-ная карцинома (9), ангиокератома (8) и геморрагии кожи дистальных отделов (2).
Прижизненные критерии и соответствующие гистологические черты, установленные на 150 пигментных образованиях кожи, приведены в таблице 3.
В последнем десятилетии прошлого века наблюдалось развитие таких прижизненных методов получения изображения кожи, как высокоразрешающий ультразвук [41], магнитно-резонансная микроскопия [42], оптическая когерентная томография (ОКТ) [43,44].
В заключение следует отметить, что диагностика кожных заболеваний затруднена вследствии субъективности восприятия врачом признаков болезни и индивидуальных особенностей проявления заболеваний. Остается актуальной проблема длительного мониторинга состояния кожи в процессе терапии, поэтому поиски оптимальных способов объективного исследования патологических изменений в коже продолжаются. Особую ценность среди них имеют вышеописанные визуализирующие методы, совершенствование которых, несомненно, будет способствовать появлению новых методов диагностики дерматозов.
Таблица 1 Диагностические критерии КБ при дерматозах
Вид дерматоза Диагностические критерии
Контактный дерматит Изменение микротопографии рогового слоя, не определяются отдельные чешуйки, треугольные ромбовидные поля. Большое количество клеточного детрита, среди которого просматриваются участки кожи с разрушенными кератиноцитами; инфильтрация эпидермиса преимущественно сегментоядерными лейкоцитами.
Аллергический дерматит Усиление десквамации в роговом слое при сохранении его структуры, преимущественно лимфоцитарная инфильтрация эпидермиса и сосочкового слоя дермы.
Профессиональные дерматозы На поверхности рогового слоя обнаруживаются частички металла, текстильной пыли, стекловолокна, абразивов, промышленных пигментов, угля.
Чесотка На поверхности и в глубине рогового слоя определяются извитые «траншееподобные» поверхностные ходы, в которых находятся клещи на различных этапах своего развития, хорошо конкурирующие яйца и их остатки, ярко флюоресцирующие фекалии паразита.
Псориаз Определяется феномен паракератоза, ядра при окраске акридиновым оранжевым с хорошо определяемой хроматиновой структурой, характерны не единичные паракерато-тически измененные клетки, а округлой формы образования на поверхности бляшек (лакуны), с участками скопления сегментоядерных лейкоцитов. В процессе лечения можно следить за динамикой исчезновения феномена паракератоза. При поскаблива-нии и снятии поверхностного слоя чешуек видны резко измененные «гроздьевидные» расширенные капилляры.
Красный плоский лишай Не наблюдается выраженного паракератоза. На слизистой рта признаки ороговения, ати-1 пичное расположение клеток, наличие клеток с атипичными (деформированными) ядра-1 ми. В отличие от псориаза — резкое сужение капилляров, уменьшение их количества.
Буллезные дерматозы При микроскопии удается выяснить характер расположения пузырей в коже (интра-, субэпидермальное), а также, при отсутствии вторичного инфицирования, определить характер клеточной инфильтрации, выявить эозинофилы, акантолитические клетки.
Трофические язвы Выраженность краевой эпителизации и наличие эпителизации или формирования руб-1 ца на протяжении язвенного дефекта. Число вновь образованных капилляров (грануляция). Характер клеточного инфильтрата.
Пигментные образования Определение пигментной «сети», характера ее расположения, выявление критериев активности невуса. В немеланоцитарпых образованиях «сеть» отсутствовала.
Ангиомы, ангиокератомы, лимфангиомы Выявление темных, нефлюоресцирующих сосудов на темно-зеленом или красном фоне, 1 их изменения в виде «лакун».
Себорейиый кератоз Ярко флюоресцирующие желтые точки (роговые кисты), небольшое количество роговых чешуек с ядрами.
Эктодермальная дисплазия Уменьшение числа устьев потовых желез, в том числе функционирующих, нарушение роста волос, их дистрофия.
Красная волчанка Серебристое свечение чешуек, фолликулярный кератоз; при ПМК выявляется усиление интенсивности свечения устьев сальных желез (копронорфирин III).
Угревая сыпь Количество и диаметр устьев сальных желез, интенсивность ороговения (comedo). Спектральные характеристики свечения секрета сальных желез и их динамика в процессе лечения.
Таблица2. Оптические феномены ПМК при дерматозах
Пигментированная базально-клеточная карцинома 1 Овоидные участки серо-голубой пигментации, не связанные с пигмен тированным телом опухоли 2. Серо-голубые участки 3. Депигментация
Гемангиома 1. Красно-голубые лакуны 2. Красно-голубой единичный свет
Голубой невус 1. Гомогенная голубая пигментация 2. Гомогенная голубая пигментация на всем протяжении опухоли 3. Рассеянная пигментная сеть
Spitz невус 1. Симметржчная пигментация 2. Темный край (ободок) периферийных коричневых точек 3. Центральная сетевидная депигментация 1. Сегашрная пигментная сеть 5. Негативная пигментная сеть
Себорейный кератоз 1. Щели (борозды) 2. Крипты 3. Милиарные кисты 1. Кератоз
Таблица3. Соотношение оптических феноменов и гистологической картины при опухолях кожи
ПМК-критерии Гистологические критерии Диагностическая ценность
Пигментная сеть Пигментированные и удлиненные гребни (борозды) с возрастающим числом меланоцитов в Меланоклеточпые образования
Расширяющаяся пигментная сеть Возрастающе е число атипичных меланоцитов, представленных как неправильные гнезда внутри Ранняя малигнизация мсланомы
Черные точки Большие скопления и гру ппы мрланоцитов в зернистом слое Малигнизирующаяся меланома
Неправильные удлинения Сливающиеся пигментированные соединенные гнезда меланоцитов Злокачественная меланома
Четко ограниченные красновато-голубые Расширенные сосуды в сосочках дермы и заключенные внутри эпидермиса Ангиокератома
^ро-коричневые «кленоподобные» Более или менее сильно пигментированные скопления базелиоидных клеток Базальноклеточная карцинома
Желтовато-белые точки Роговые псевдокисты Себорейный кератоз
